基于核磁共振技术基于核磁共振技术的代谢组学研究进展的代谢组学研究进展核磁共振波谱分析121.生命科学领域的核磁共振技术生命科学领域的核磁共振技术2.代谢组学概述代谢组学概述3.基于核磁共振的代谢组学研究进展基于核磁共振的代谢组学研究进展核磁共振波谱分析12一、生命科学领域的核磁共振一、生命科学领域的核磁共振核磁共振波谱分析12磁共振成像磁共振成像(NMRI, Nuclear Magnetic Resonance Imaging)磁共振定域谱磁共振定域谱(MRS, Magnetic Resonance Spectroscopy)核磁共振波谱核磁共振波谱(NMR, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)核磁共振核磁共振波谱分析12二、代谢组学概述二、代谢组学概述核磁共振波谱分析12Jeremy K NicholsonImperial College London，UK代谢组学的定义代谢组学的定义Metabonomics: the quantitative measurement of the multi-parametric metabolic response of living systems to pathophysiological stimuli or genetic modifications对对生生物物系系统统因因病病理理生生理理或或基基因因改改变变等等刺刺激激所所致致动动态态多参数代谢应答的定量测定。多参数代谢应答的定量测定。J. K. Nicholson, J. C. Lindon, E. Holmes. Xenobiotica, 1999, 29: 1181-89.技术：技术：NMR动物代谢分析：动物代谢分析：动物的体液和组织动物的体液和组织核磁共振波谱分析12Oliver FiehnUniversity of CaliforniaHealth Sciences DriveDavis, USAMetabolomics: comprehensive analysis of all the metabolites of an organism. The quantitative measurement of all low molecular weight metabolites in an organisms cells at a specific time under specific environmental conditions.生生物物体体所所有有代代谢谢物物的的系系统统分分析析。本本质质是是“给给定定细细胞胞在在给定时间和条件下所有小分子代谢物的定量分析给定时间和条件下所有小分子代谢物的定量分析”。 O. Fiehn. Plant Mol. Biol., 2002, 48: 155171.技术：技术：GC-MS植物代谢分析：植物代谢分析：细胞细胞核磁共振波谱分析12代谢组学的发展代谢组学的发展198219831984198919992000200120022004Sadler, Sadler, Buckingham Buckingham and and Nicholson:Nicholson: First publication on 1H-NMR of blood and plasmaNicholson, Nicholson, et et al.:al.: Multi-component analysis of spectra data from rat urineNicholson and Wilson: NMR spectroscopy of biofluidsNicholson:Nicholson: Definition of MetabonomicsHaselden, Haselden, et et al.:al.: First independent Pharma publication of MetabonomicsNicholson, Nicholson, Lindon, Lindon, and and Holmes:Holmes: Publication in Nature on MetabonomicsHolmes Holmes and and Antti Antti : : Explanation of statistics in MetabonomicsIncreasing # of publicationsIncreasing # of publicationsVan Van De De GreefGreef: publication of MS for urine profiling19701997OliverOliver: : Definition of MetabolomeHorming, et al.:Horming, et al.: Metabolic profiles of metabolites in human核磁共振波谱分析12代谢组学的中心任务代谢组学的中心任务v对生物体液和组织中内源性代谢物质进行系统对生物体液和组织中内源性代谢物质进行系统测量和分析测量和分析。v对生物体在受到病理生理上的刺激以及某种基因修饰所带对生物体在受到病理生理上的刺激以及某种基因修饰所带来的代谢物的动态变化进行来的代谢物的动态变化进行量化和编录量化和编录，从而得到生物，从而得到生物体代谢随时间及生化过程的变化而改变的信息。体代谢随时间及生化过程的变化而改变的信息。v将这些信息与病生理过程中的将这些信息与病生理过程中的生物学事件生物学事件关联起来，从而关联起来，从而确定此变化规律相关的靶器官和作用部位，进而确定相确定此变化规律相关的靶器官和作用部位，进而确定相关的关的生物标志物生物标志物。核磁共振波谱分析12系统生物学系统生物学(Systems Biology)的组成的组成表现型表现型(phenotype)个体个体(individual)器官器官(organ)组织组织(tissue)细胞细胞(cell)代谢物代谢物(metabolite)蛋白质蛋白质(protein)mRNADNA代谢组代谢组(metabonome/metabolome)蛋白质组蛋白质组(proteome)转录组转录组(transcriptome)基因组基因组(genome)代谢组学代谢组学(metabonomics/metabolomics)蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)转录组学转录组学(transcriptomics)基因组学基因组学(genomics)系系统统生生物物学学(Systems Biology)核磁共振波谱分析12不同组学关系及分析技术不同组学关系及分析技术NMR, GC&MSGene核磁共振波谱分析12Metabolomics is More Time Sensitive Than Other “Omics”MetabolomicsProteomicsGenomicsResponseResponseResponseTime核磁共振波谱分析12GenomicsTranscriptomicsProteomicsMetabonomicsTarget materialGene, chromosome (genetic code)mRNA (genetic code)Protein (function of the protein)Low molecular weight metabolitesMW100,000-120,000100,000-120,0005,000-20,000100- 5000CharacteristicsContext independent Context dependentContext dependentContext dependentAnalysisMapping, sequencingSequencingSeparation, characterizationSeparation, characterizationMethodsDNA sequencerHybridization2D gel, Maldi TOFNMR, MS, GC, LCHuman30,000 genome109?2,500各种组学技术的比较各种组学技术的比较核磁共振波谱分析12代谢组学分析检测技术代谢组学分析检测技术UPLC, HPLCCE/microfluidicsLC-MSFT-MSQqQ-MSNMR spectroscopyX-ray crystallographyGC-MSLIF detection核磁共振波谱分析12 简便便：样品不需复杂预处理，检测不需严格分析条件，避免引入干扰物的可能。 快捷快捷：常规1H NMR谱只需几分钟，且对低分子量和高分子量的代谢物均能给出定性和半定量的信息。 避免漏避免漏检：不需预先选定化合物，在对待测物知识非常有限的情况下意义尤为重要。基于基于NMR的代谢组学的特点的代谢组学的特点核磁共振波谱分析12 不破坏不破坏样品的原有品的原有组成成：NMR方法具有无损伤性, 可以在生理条件下对样品进行实时检测且不影响混合物的生理生化性质甚至化学平衡，以达到模拟体内条件和进行分子水平的分析需要。 NMR方法可以方法可以进行行实时和和动态的的检测。基于基于NMR的代谢组学的特点的代谢组学的特点核磁共振波谱分析12 分析分析组织的高分辨魔角旋转组织的高分辨魔角旋转(HR-MAS) NMR方法方法：消除了磁场不均匀性、化学位移各向异性和偶极偶极相互作用带来的谱线增宽影响，从而可以获得与液体高分辨NMR 相媲美的分辨率。 无偏向性无偏向性: NMR对所有化合物的灵敏度是一样的, 氢谱中谱峰和化合物的氢原子是一一对应的, 所测的每个氢原子都有其相关的谱峰, 并且信号的强弱反映样品中各组分的相对含量。基于基于NMR的代谢组学的特点的代谢组学的特点核磁共振波谱分析12 多参数多参数：从核磁谱图中的多种参数得出结构信息。对于药物代谢来说，可以通过化学位移、谱峰的多重性、偶合常数、弛豫时间、NOE 效应、谱峰强度等多种参数对同一问题做全面的反映。 多核与多维多核与多维NMR：解决同一问题可采用多核（1H、13C、15N、31P、23Na、7Li、139La 等）和多维（2D COSY、NOESY、TOCSY、HSQC）等多种核磁共振编辑手段和实验方法。基于基于NMR的代谢组学的特点的代谢组学的特点核磁共振波谱分析12 检测灵敏度低灵敏度低：500MHz谱仪的1H NMR的检测限理论为10M。 水峰水峰过强：体液中的生物分子一般其浓度为毫摩尔级，水中质子浓度约为100 mol/L，是生物分子浓度的105 倍! 检测动态范围有限检测动态范围有限：很难同时检测同一样品中含量相差很大的物质。 谱峰重叠及峰重叠及谱线较宽。NMR检测生物样品中存在的问题检测生物样品中存在的问题核磁共振波谱分析12代谢组学中主流技术的比较代谢组学中主流技术的比较ChromatographyMass SpectrometryNMRObjectiveYesYesYesReproducibilityPoorGoodGoodResolutionFairFairGoodSensitivitySelectiveSelectiveFairUnbiased detection (Simultaneous)NoNoYesHolisticNoNoYesMolecular informationPoorFairRichSample preparationExtensiveExtensiveLittlePre-knowledge requirementsYesYesNoin vivo/in situImpossibleAlmost impossibleYesThroughputFairHighHighRecurrent expenditureHighHighLowLabour intensivenessFairFairLowCost per sampleFair/lowFairLow核磁共振波谱分析12Analytical ApproachesBio-systemsExogenousEndogenousExposure assessmentBio-monitoringDisease diagnostics Time courseDose responseToxins, DrugsEnvironmentaletcMetabolic pathwaysDatabasesMol. Biosyst. 2009, 5: 288; J. Proteome. Res. 2009, 8: 5657; 2009, 8: 352.代谢组学方法和流程代谢组学方法和流程核磁共振波谱分析12三、基于三、基于NMR的代谢组学研究进展的代谢组学研究进展核磁共振波谱分析12 在药物毒理代谢组学的研究领域，最为瞩目的工作是国际COMET (Consortium for Metabonomic Toxicology)计划，旨在建立代谢组数据库，并为目标器官及其位点的毒性建立预测性专家系统。他们已经建立起了第一个基于机器学习的实验室啮齿动物肝脏和肾脏毒性预测的专家系统。1. 毒理研究毒理研究核磁共振波谱分析12肾肾毒毒素素：HgCl2、CdCl2、Na2CrO4、硝酸铀酰、苯酚、对氨基苯酚、六氯丁二烯(HCBD)、顺铂、2-溴乙胺(BEA)、丙烯亚胺(PI)等 肝肝毒毒素素：肼、异硫氢酸萘(ANIT)、半乳糖胺(GaIN)、羟丁基甲苯(BHT) 核磁共振波谱分析12例例1.各种肾毒素对 大 鼠 尿 液1H NMR 谱的影响。A, 对照组；B，20 mg/kg Na2CrO4(肾脏近曲小管毒)组；C，50 mg/kg 对氨基苯酚(肾脏近直小管毒)组；D，50 mg/kg 丙烯亚胺(令肾髓质坏死)组 ； E， 250 mg/kg 2-溴乙胺(产生急性肾乳头坏死)组。核磁共振波谱分析12-25-20-15-10-50510152025-30-20-10010PC1PC2PAPANITControl-15-10-5051015-40-30-20-10010PC1PC2ANITControla-naphthylisothiocyanite (ANIT)p-Aminophenol (PAP)Control核磁共振波谱分析12尿中乳酸升高尿中乳酸升高：急性肾小管受损：急性肾小管受损TMAO、DMA、DMG和琥珀酸水平升高和琥珀酸水平升高：肾乳头受损肾乳头受损氨基酸，乳酸（血中）升高氨基酸，乳酸（血中）升高：急性肝受损：急性肝受损氨基酸，乳酸（尿中）升高氨基酸，乳酸（尿中）升高：肾小管损坏：肾小管损坏尿中琥珀酸升高，尿中琥珀酸升高，-酮戊二酸升高，柠檬酸酮戊二酸升高，柠檬酸降低降低：肾小管酸中毒或线粒体酶活性降低：肾小管酸中毒或线粒体酶活性降低牛磺酸升高牛磺酸升高：肝脏受损：肝脏受损酮体含量升高酮体含量升高：线粒体中酶代谢紊乱：线粒体中酶代谢紊乱肌酸含量升高肌酸含量升高：睾丸毒：睾丸毒一些重要的一些重要的NMR markers核磁共振波谱分析12 基基于于NMR 的的代代谢谢组组学学方方法法不不仅仅能能区区分分组组织织器器官官的的正正常常与与非非正正常常的的状状态态，而而且且能能给给出出毒毒性性作作用用的的靶靶器器官官以以及及作作用用机机制，识别出毒性的生物标记物。制，识别出毒性的生物标记物。核磁共振波谱分析122. 药物代谢及药物代谢及 安全性评价安全性评价药物物种种类：利尿剂（乙酰唑胺），抗菌素（氨比西林、苄基青霉素、先锋霉素、氟氯西林、青霉素），中枢神经药（脱氧麻黄碱），抗炎解热镇痛药（氨茴酸、萘普生、布洛芬、阿斯匹林、退热净、扑热息痛），抗滴虫药（灭滴灵 ） ， 治 关 节 炎 药 （ 青 霉 胺 ） ， 抗 癌 药 物 （ Au(Ph2P(CH2)2PPh2)2Cl 、IF、 Carboplation Pt(II)(NH3)2 ）样本本：鼠尿，鼠胆汁，人尿，人淋巴液，血浆方方法法：1H NMR, 13C, 19F NMR, 31P, 1H-1H COSY, 1H-19F COSY 核磁共振波谱分析12 在药物开发阶段，代谢组学不仅可以进行早期活体毒理测试，而且能为药物分子的筛选提供依据； 在药物临床应用前，它能帮助确定药物的安全性生物标记物和代谢表型； 评价将动物模型实验应用于人类疾病的可行性。核磁共振波谱分析123. 病理诊断及病理生理学病理诊断及病理生理学 代谢组学相对于基因组学研究来说，在疾病（如癌症，糖尿病，心血管疾病，肥胖，哮喘）领域是一个相对较新，不断获得更加广泛认可的分析方法。利用代谢组学的方法可以实现对疾病的诊断，通过对生物标记物的寻找和相关代谢网络的研究，探寻生物标记物的代谢途径和疾病的产生机理，实现对疾病的诊断。核磁共振波谱分析12v1957年， “NMR医学研究系”v1979年，利用体液的氢谱对癌症进行诊断v 1986年，利用人血浆中脂蛋白峰的甲基和亚甲基的线宽区别进行恶性肿瘤的诊断v近年来，通过对血浆、血清、脑脊液、卵巢囊液、组织液、鼠肝提取液的NMR分析，对体液NMR技术进行癌症或一些特异的肿瘤如：子房瘤、卵巢瘤、脑瘤、肝脏淋巴瘤、中枢神经系统恶性胶质瘤进行检测诊断的可能性进行了研究。核磁共振波谱分析12v临床和生化研究的一个重要领域：利用高分辨NMR技术研究慢性肾功能衰竭(chronic renal failure, CRF)者的生化异常。v利用NMR技术可以研究先天性代谢失常，包括2-羟基戊二酸尿症、棕色糖尿病、酪氨酸血症、先天性血色沉着病、先天性尿道钙结石，在其它疾病如脑白质病、糖尿病、神经病等方面也取得了一些有益的研究成果。核磁共振波谱分析12例例1. Urine samples Cataract（白内障）（白内障）Cataract Cataract (48)(48)Control (48)Control (48)核磁共振波谱分析12例例2. Serum samples-cardiovascular disease (冠心病冠心病)Brindle JT et al., 2002. Nat Med. 8(12), 1439-45.核磁共振波谱分析124. 食品安全及质量控制食品安全及质量控制目前对饮食的安全可靠性和食品的质量控制引起了科学领域和公众的特别关注，促进了在食品领域的代谢组学分析和对其质量控制方面的研究。核磁共振波谱分析12 目前主要研究方向：酒精饮料和酿造食品（啤酒、葡萄酒、蒸馏酒、酱油、醋），咖啡和茶类，水果和蔬菜（果汁、柑橘、猕猴桃、芒果、黑树莓、甜瓜、西瓜、西红柿、莴苣、芸苔、土豆、胡萝卜、玉米、小麦），橄榄油，牛奶和乳制品（牛奶、奶酪、黄油和人造黄油），蜂蜜，鱼和肉类。还有其它的研究如松露、菌类和藏红花。核磁共振波谱分析12PCA (A) and OPLS-DA (B) 3D score plots derived from the 1H NMR spectra of beef sirloin (or chuck) extracts obtained from Australia, Korea, New Zealand, and the United States of America.例例1. Extracts from beef sirloin (牛里脊肉牛里脊肉)核磁共振波谱分析12例例2. Beer（啤酒）（啤酒）The same company, protocol (Genome), pipe-line (Proteome), but different taste (Metabolome)核磁共振波谱分析12例例3. Wine（葡萄酒）（葡萄酒）Red wineMore tannins and phenolicsWhite wineMore amino acid核磁共振波谱分析12例例4. 蜂蜜蜂蜜（Honey）CJ (Chinese jujube，枣花花), LJ (Lonicera japonica，金金银花花), FS (Flos sophorae，槐花槐花), FCI (Flos chrysanthemi indici，菊花，菊花), EJ (Eriobotrya japonica，枇杷，枇杷)不同花蜜的不同花蜜的NMR谱核磁共振波谱分析12例例4. 蜂蜜蜂蜜（Honey）相同相同产地地不同花源不同花源相同花源相同花源不同不同产地地相同厂家相同厂家不同批次不同批次核磁共振波谱分析125. 营养代谢研究营养代谢研究 代谢组学的方法可以帮助识别和常量营养物的最终摄入效应密切相关的代谢物，并且有助于定义各种常量营养物的正常摄入范围。营养代谢营养代谢组学组学（Nutrimetabolomics）定义的提出。核磁共振波谱分析12 饮食与营养科学与代谢组学相结合系统地表征在不同健康状态（健康，亚健康，疾病）下，饮食习惯，地域差异，营养结构（种类和用量），营养相关疾病等对机体造成的细微代谢变化，这些变化概况为探索不同饮食或营养条件下机体内的细胞，组织和器官的生物标记物，代谢整体水平以及代谢作用机制，并有可能为机体的健康状况动态地况进行诊断和营养搭配提供新的策略。核磁共振波谱分析126. 功能基因组的研究功能基因组的研究 随着人类基因组测序工作的完成，人们已经步入到了后基因组时代即对功能基因组学的研究。通常，功能基因组学利用基因组提供的信息和产物，运用遗传或其他新的实验技术，通过识别基因在一个或多个生物模型中的作用来全面认识和分析基因的功能。核磁共振波谱分析12 基因产生变异的生物体在生长速率等表型上可能没有显著的改变，这是因为细胞内的代谢物浓度的改变补偿了变异产生的影响。但是这也同时意味着生物体在代谢表型代谢表型上可能会有显著的变化。代谢组学作为功能基因组学研究应用的一个重要方法，主要是从基因表达谱的终点代谢物组的信息来鉴定或推测出基因的功能。“基因组学告诉我们什么可能发生，代谢组学则告诉我们发生了什么”，二者相互关联，将会从现象到本质探寻生命的奥秘。核磁共振波谱分析127. 中医药现代化中医药现代化 代谢组学有可能在中医“病、证、方”的研究体系中发挥作用，在规范中医基于证的诊断标准、探索证候的动态内涵和演变规律，以及提示证与疾病疗效的相关性和科学性方面扮演重要的角色。另外在中药质量控制、整体疗效和中药安全性也进行了初步研究。核磁共振波谱分析128. 微生物领域的研究微生物领域的研究 微生物代谢组学是力求在特定的条件下分析微生物体系中所有代谢物的动态变化，它不仅反映了基因、转录和环境等作用的最终结果，还为发现新的标记代谢物和代谢网络中复杂的相互作用提供信息。在微生物分类，突变体筛选、发酵工艺的监控和优化、微生物降解环境污染物以及人体健康（如口腔、肠道）等方面有着重要的应用。核磁共振波谱分析129. 环境科学环境科学 环境代谢组学是研究生物有机体与生态环境相互作用，探讨生物体应对生态环境影响作用的代谢概况的一门学科。目前主要应用于评价生命有机体如陆生、水生动植物对环境中化学污染物暴露的代谢影响，挖掘生物标记物，探索生态毒理性；监测环境因子（如冷、热、缺氧、干燥、饥饿等）对生物体的代谢轮廓的影响；研究诊断野生水生动物受环境作用引起的疾病代谢。核磁共振波谱分析1210. 植物作物植物作物 植物代谢组学，在某特定的环境条件中，选取植物的单个细胞或器官中所有代谢物，动态地进行定性定量的分析，进而确认不同环境条件下植物的代谢概貌和应答。核磁共振波谱分析12v与其它领域的代谢组学方法相比具有自身的特点和挑战 代谢体系庞大而复杂：现在已知的植物代谢物已经达到约300000种，它们的极性不一，化学性质各异，在植物细胞中的稳定性及浓度均存在差异。v目前，国内国际主要在以下几个方面开展研究工作：S指导植物的分类（如转基因植物和野生植物）；S确定植物代谢受到外部环境刺激的变化规律；S区分不同基因型和区域性植物以及其药理作用差异；S发现新的功能基因等。核磁共振波谱分析12例例1. 50% MeOH fraction-tobacco (烟叶烟叶)* There was no difference in CHCl3 fractions.Wild leafCSA leafWild veinCSA vein核磁共振波谱分析12W: wild type plant C: transgenic plantNL: non-inoculated leafIL: inoculated leaf SL: systemic leaf核磁共振波谱分析12例例2. Extraction of Citrus grandis Osbeck (柚柚)Mature stageImmature stage核磁共振波谱分析12核磁共振波谱分析12PCA核磁共振波谱分析12