心血管疾病药效学研究一、实验设计的医学基础 根据缺血性心脏病(心绞痛、急性心肌梗死)的主要症状发现，中医将其归属于“厥心痛”、“真心痛”、“胸痹”范畴。病位以心肾为主。基本病机为本虚标实。本虚以脏气亏虚为主可兼阴虚；标实以血瘀痰阻多见，可兼气滞、寒凝。基本治法为宣痹通阳，活血化瘀，芳香温通及扶正固本。 缺血性心脏病可由不同病因引起，最常见的原因是冠状动脉粥样硬化、冠状动脉血栓及冠状动脉痉挛。其共同特点是由于心肌供血不足所致氧的供需矛盾而发生的一系列病理生理改变及证候。 改善心脏血管功能，增加心肌的供血供氧，降低氧的消耗，改善心肌代谢，缓解心绞痛，减小心肌梗死面积是药物治疗的主要目的。二、药效学研究的实验设计 缺血性心脏病需要进行的药效学实验较多，般应以整体动物实验为基础，根据药物特点及实验要求适当选用器官、组织、细胞及分子水平的实验，多层次实验相结合，有利于重复验证和说明作用原理。但由于缺血性心肌发病机制复杂，防治的途径，方法及药物类型亦较复杂。应明确研究的思路，作用的途径，选择适宜的主要药效学实验方法及必要的观测指标，进行止确的分析判断，以求得科学的结论。 3血液流变学试验 心肌缺血发生前后，常伴有血液流变学改变。因此，测定血液黏度、血浆纤维蛋白原含量、血细胞比容、红细胞沉降、血小板黏附和聚集等血液流变学指标，对评价药物的作用有重要意义。 4氧代谢试验 增加心肌的供氧和提高心肌的耐缺氧能力，改善心肌能量代谢是药物治疗缺血心脏病的重要作用。方法除前面介绍的心肌耗氧量测定外，可同时选用小鼠常压、低压耐缺氧等实验和指标。 (四)阳性对照药 阳性对照药既可选择西药，也可选中药。西药作用明确，疗效肯定，尤其是一些经典药品，可检验实验方法可靠性。西药剂量与中药量相差较大，作用特点亦不大相同，不做药效强度比较。采用中药阳性药时，一股应选疗效肯定的功能主治相似的中成药对照，对照药应是药典记载或经卫生部批准生产的；对照药剂应与受试药等效或相当，以便进行比较，同一受试药的不同药效学实验选用不同的阳性对照药。 三、动物模型建立方法 (一)犬或小型猪心肌缺血及心肌梗死模型 1原理 通过缩窄或完全闭塞冠状动脉，减少或停止供应区的血流，形成心肌缺血、缺氧而发生代谢紊乱，以致发生心肌坏死。 2方法 健康成年犬或小猪(现我国已培育出实验用“中国实验小型猪”)，雌雄兼用，体重1015kg，经戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，手术台固定，分离气骨并插管，连接电动呼吸机，调节潮气量300600wi，动脉氧分压维持在1213kPa(90-100mmHg)，血pH在正常范围；左侧第四肋间开胸，暴露心脏，剪开心包，做心包床；分离冠状动脉左前降支中段(一般相当厂第三分支根部)，可用以下儿种方法阻断冠状动脉，形成心肌缺血： (1)冠状动脉结扎法：在冠脉分离处穿34号处线以备结扎，或用动脉夹阻断，一般用于急性心肌缺血实验。 (2)冠状动脉血栓形成法：将弧型针状电极(刺激电极)置于分离的冠状动脉下，另一电极(参考电极)距刺激电极o6mm处置于心外膜下，两电极分别连接电刺激仪的隔离器正负极，以25、lmA直流电刺激冠状动脉30min左右，冠状动脉内血栓形成，阻断冠状动脉血流，诱发心肌缺血。 (3)冠状动脉气囊压迫法：压迫环由有机玻璃外套和可膨胀的乳胶小囊构成，外套长5mm侧面lmm的缝隙，血管由此进入肺内，小囊长34mm，一端密闭，一端与塑料管相连，充满蒸馏水或生理盐水，经塑料管注水3040ul使小囊膨胀以压迫套内的血管，当压力去除时，小囊恢复原状，冠状动脉重新通畅，适用于急性和慢性心肌缺血或再灌实验。 (4)Ameroid缩窄环法：为形成慢性冠状动脉闭塞、心肌缺血或观察冠状动脉侧支循环的变化，用具有吸水性的塑料环(Ameroid环)套在冠状动脉左旋支根部。关闭胸腔后，塑料环吸收组织水分膨胀，环外壳系硬质材料做成，限制环的外展，结果压迫冠状动脉，形成心肌缺血。环植人46星期，血骨内径缩小80-90。 (5)清醒动物心肌缺血实验：将气囊压迫环固定在冠状动脉适当部位，缝合心包，放置心包膜电极，气囊的导管电极的导线分别穿过胸壁引出皮外，逐层缝闭胸。实验时注入蒸馏水，使气囊膨胀，压迫冠状动脉造成心肌缺血，测量心外膜电图或其他观察指标,本法可反复阻断冠状动脉，进行多次清醒动物的心肌缺血实验及再灌注损伤实验。 (6)缺血再灌注创伤：在心肌缺血一定时间造成心肌损伤后，冉供血一定时间，加重心肌损伤而形成再灌注损伤，观察药物的保护作用。 3药物疗效判断 (1)心外膜电图标测：心外膜标测点的定位应包括缺血中心区、边缘区和非缺血区，标测方法：将心电极固定于具有一定弹性的无刺激性材料作成的片子上，该片四角缝于心外膜，如多点固定式心外膜电极。或直接将每个电极固定于心外膜表面，或用一个灯芯电极按顺序点测标测点。或用一个电极沿心表山一定途径移，记出一个连续的心外膜电曲线。电极用浸泡生理盐水的烛芯棉线或细毛笔尖等柔软材料探查电极，联于心电图胸前导联描记，用普通心电图机或多导生理记录仪记录。确定心肌缺血以ST段抬高作为指标，以ST段抬高2mv的点数(NST)代表心肌缺血的范围，以各点段抬高的毫伏数之和(ST)代表心肌缺血的程度。记录阻断冠脉血流前后的变化及药物的影响。 (2)缺血区及梗死区面积的测定：在阻断冠状动脉血流孔后，经左心耳根部向心房注人碳索墨水15mlkg，20-30s注完，迅速取下心脏，冰冻3040min，在冠状动脉结扎线下平行冠状沟等厚度将心室部分横切成5片，分别称重，再用求积仪或电脑图分析仪测量每片心肌两面的墨水染色区与末染区(缺血区)，计算心肌缺血范围的重量及百分比。然后将5片心肌置硝基四氮唑蓝(NBT)染液中，震摇染色15min后取出，正常心肌染为暗蓝色，梗死区心肌则小着色或浅黄色，用求积仪或落点求积法或电脑图像分析法测量每片心肌两面的梗死区和非梗死区，计算出每片心肌总面积、总重量；缺血区和梗死面积和重量；计算缺血区占心室百分比，梗死区占心空白分比，及梗死区占缺血区百分比，以评价药物的疗效。 (3)生化指标：阻断冠状动脉前后定时抽取血液，测量血中乳酸脱氢酶的变化，分析心肌损伤情况。为避免具他肌肉组织释放的酶干扰，测同工酶。 同时可测定血ATP、cAMPcGMP、无机离子、代谢物、能量代谢物质等，如需了解药物作用与前列腺素的关系，可观察PGl2或代谢产物的变化，以观察药物对的影响。如需了解药物与氧自由基的关系，可测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)作为氧自由基产生和清除的观测指标。 (4)血液流变性指标测定：阻断冠状动脉前后定时抽取血液，测定全血黏度、血浆纤维蛋白原含量、血细胞比容、红细胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流变学指标。 4 注意点 犬和小型猪是建立心肌缺血模型最常用的动物，其体积大小适中，性情温顺、易训练、心脏解剖及生理特点与人相似，其影响因素有： (1)动物冠状动脉分支及侧支循环有个体差异，对分支及侧支变异大的，不合标准的应剔除不用，各组动物模型心肌缺血程度和范围接近。 (2)正式实验之前应熟练掌握动物开胸手术和冠状动脉分离手术，尽量减少出血，做心包床时，心肌不应移位而影响心脏的正常舒缩功能。 (3)实验时应严格控制心外膜电极的位置、压力，心脏表面的温度、湿度及位置。心外膜电极放置的位置，或反复测定的位置应准确固定，不应移位。电极不可对心脏压力过大，心脏表面的温度及湿度应稳定，不可干燥。否则将影响实验的准确性。 (4)实验可注射给药，但口服中药消化道给药，消化道灌胃给药或十二指肠给药，灌胃时，注意动物提前812h禁食。 (5)在进行本项实验时一定要严格控制实验条件，排除干扰因素，确保实验结果。必要时同步测血氧、pH等。 (二)大鼠实验性心肌梗死模型 I，原理 结扎大鼠的冠状动脉前降支，阻断其分布区域的心肌供血，心肌细胞长时间缺血缺氧而造成不可逆损伤和坏死。 2方法 取体重200250g雄性大鼠，乙醚吸入或戊巴比妥钠腹腔麻醉，仰卧固定，气管插管，在胸骨侧作2cm的纵切口，近胸骨侧剪断第三第四肋软骨，打开胸腔，联接呼吸机(通气量2mll00g，50次min)。剪开心包膜，暴露心脏，冠状动脉左前降根部穿线以备结扎，记录标准导联心电图，稳定10min，结扎冠状动脉左前降支，关闭胸腔，用针筒或橡皮吸引吸出动物喉部分泌物，使动物恢复呼吸。 3 测定指标 (1)心电图ST段及Q波标测：记录标准导联心电图及胸前导联心电图，测ST、病理性Q波、严重心律失常等指标。 (2)测定血浆生化指标：如IDH、CPK、ATP、cAMPcGMP、PGI2TXA2等。 (3)梗死面积估算：处死动物，取心脏横切数片，测梗死面积，方法同前，但误差较大。可用石蚶包坤组织块切片，染色，显微镜下观测，分级定度或用定量组织学方法直接算心肌梗死面积。 4注意点 本实验方法在一般实验室条件均可进行，方法简便，但动物较小，操作不便，耐受缺氧时间不长，心脏较小，实验误差较大，可作为辅助试验。手术者必须熟悉冠状动脉的分布和解削位置，便于定位。操作者严格训练操作熟练，手术时间不宜过长，部分结扎冠状动脉后ECG无改变者需剔除。 (三)心肌缺血再灌注损伤模型 1原理 心肌经一定时间缺血(缺氧)后，突然恢复血(氧)供，形成更严重损伤，即“心肌缺血再灌注损伤”，其形成原因可能是心肌恢复血流时，加速细胞膜内外的钠钙交换，大量钙离子进人细胞内，形成“钙超载”：心肌细胞发生“拘缩”而丧失功能。心肌缺血再灌注损伤模型既可用于整体动物，又能用于离体心脏和体外培养心肌细胞。在药效学研究可根据所试药物的药理作用及作用特点，选用不同的动物和模型。 2 方法 (1)在体心脏心肌缺血再灌注损伤模型：实验可用多种动物如，犬、小型猪、猫和大鼠等。一般采用阻断局部冠状动脉血流一定时间，然后恢复冠脉血流，形成再灌注损伤。手术方法观察指标大致同前。 (2)离体心脏缺血再灌注损伤模型：实验一般用成年Wistar种雄性大鼠，猛击动物头部使昏迷，快速开胸，摘取心脏、立即放人4改良Krebs-Hensleit液中，主动脉插管，装于Leaigendorff罐流装置，以KH液(pH74)恒温37进行灌流。将两电极分别于主动脉及左心室壁，记录心表面电图。 实验程序：预备灌流期，心脏正常灌流(正常改良KH液)，稳定l0min，给药灌流(含不同药物的改良K-H液，实验持续进行)5min。缺血期，以00号线于左心耳部下力进针，从肺动脉圆锥旁穿出，结扎冠状动脉10min。复灌期，剪断结扎线，进行再灌注15min。 3 观察指标 心表面电图，记录复灌后5min出现的室性早搏PVC个数对数值lgPVC及室速与室颤总时对数值。心肌丙醛(ADA)含量及越氧化物歧化酶(s0D)活性，实验结束后，剪下再灌区全层心肌约02g，制备匀浆进行测定。心肌离子含量测定，实验结束后，以无钙冲洗液(三羟甲基氨基甲烷缓冲掖)冲洗心肌，取再灌区层心肌约o 2g，干燥至恒重，以硝酸消化溶解，无离子水稀释至所需浓度，原子吸收分光光度汁或等离子休发射光谱仪测定钠，钾、钙，镁等离子含量。心肌梗死面积测定，实验结束时，将心脏横切染色，计算心肌梗死面积。 (四)体外培养心肌细胞缺血样损伤模型 1原理 通常应用Wistar种大鼠乳鼠进行原代心肌细胞培养，用缺氧缺糖形成缺血样损伤。心肌细胞缺氧缺糖后，功能从形态有明显改变，如胞浆泡形成，胞浆颗粒增加出现异形心肌细胞等；经活体染色证实细胞死亡数增加；搏动频率下降，动作电位改变；胞浆的乳酸脱氢酶，羟酸脱氢酶及磷酸肌酸肌酶大量漏出等、可利用这些指标评定药物对心肌细胞缺血样损伤的保护作用。 2方法 取出生23曰乳鼠，开胸、取心室，放人盛有Eagle培养皿中，反复冲洗3次，三角烧瓶中用眼科剪将心室组织剪成碎块，加入006胰蛋白酶溶液。在搅拌器上37水浴消化10min自然沉淀后，丢上消液，沉淀的组织块再加入胰蛋白酶，消化l0min，然后吹打1min，自然沉淀，上清移人离心骨中。加入等量冷培养基以终止消化，离10min(2000rmin)，弃上清，再加入适量培养基于离心管内的细胞沉淀中，混匀，离心，弃上清以洗残存的胰蛋白酶，加入15Eagle培养基，制成细胞悬液。将自然沉淀的组织块反复消化数次，直至完全分散为止。将各次消化制的细胞悬液集中，制成心肌细胞悬液，接种至玻璃培养瓶，塞紧，37c下静置单层培养或在二氧化碳培养鞘开放培养。 体外培养心肌细胞缺氧缺糖性损伤模型的建立方法：取培养3日的心肌细胞，按下法进行缺氧缺糖实验缺糖：实验时采用无糖液或不含糖的Eagle培养基代替正常培养。缺氧：将无糖Hanks液或无糖培养基预先用纯氮气(99.999)饱和15min；实验时换人这种缺氧缺糖液或培养基，培养瓶内再充人氮气(1l/min)30s以置换瓶内空气，然后塞紧瓶塞。正常对照组用正常Hanks液或培养基，不充氮气，如用二氧化碳培养箱加以培养，则通人95N2+5C02气体形成缺氧。也可在缺氧后再供氧，形成冉供氧损伤，开观察药物对供氧损伤的影响。 3测定指标 (1)形态学观察：用台盼兰染色进行死活细胞鉴定，观察细胞活力的改变及死亡比例，光学显微镜下可观测心肌细胞形态变化，如伪足变化、胞泡形成、胞浆颗粒增加、异形(长形、纺锤形)心肌细胞的出现。在扫描或透射电镜下观察超微结构的变化。 (2)心肌细胞搏动的变化：包括搏动的频率、节律及强度等。 (3)胞浆酶的释放：可用生化或细胞化学方法测定缺氧缺糖后心肌细胞内从培养基中酶的变化，如IDH、CPK、羟酸脱敏酶、转氨酶等的变化。 (4)其他：测定细胞内氧化物歧化酶的变化从钙离子运转等。 上述观测指标综合选用，以判断心肌细胞损伤程度及药物保护作用。 4方法学评价 优点：观察药物对心肌细胞的直接作用，可排除药物通过其他间接影响心肌缺血氧的作用。节约药物，适用于分离或合成得到的极少药物进行实验。适用于从细胞或分子水平进行机制研究。 局限性：技术设备要求高。不适于观察不溶于水或含杂质的粗制药物，或非直接作用心肌细胞的药物的作用。因此，本法应与整体或器官水平的实验配合进行，以便更全面的判断药效。 (五)药物诱发心肌缺血模型 近年研究认为冠状动脉痉挛是导致心肌急性缺血的主要原因之致心绞痛、心肌梗死和猝死。目前常用垂体后叶素在整体动物(犬、小型猪、兔、豚鼠，大鼠)或离体心脏上造成冠脉痉挛心肌缺血模型，或用儿茶酚胺类药物引起心肌缺血的方法，以评价抗心肌缺血药物的疗效。 l、垂体后叶素诱发心肌缺血模型 (1)原理：垂体后叶素能使冠状动脉痉挛，造成急性心肌供血不足，从外周阻力增加导致心脏负荷加重，心电图可见心肌缺血的典型变化，适用于缓解冠状动脉痉挛以防治心肌缺血药物的初筛方法；垂体后叶素能收缩全身(特别是内脏)小血管，作用是非特异的。 (2)方法： 大鼠缺血模型：取体重200g健康大鼠，腹腔注射乌拉坦麻醉，仰卧固定，将电极插入四肢及胸前心尖搏动处皮下，调节心电图灵敏度1mV=15mm，纸速为50mm/s，可琏接心电示波器连续观察心电变化，记录胸前导联或导联心电图。实验前有心电图或心律失常异常变化，则弃去不用，根据所试药物特点选择适当给药途径和间隔，静脉给后15min腹腔注射后1530min，灌胃后1-2h，经下静脉或尾静脉注射垂体后叶素05或07ukg，注射速度5s或l0s。注射后即刻、5s、10s、15s及30s、lmin、2min及5min，重复记录心电图(记录时间可据示波器所示异常情况决定)。 正常大鼠注射脑垂体后叶素后心电图变化分两期： 第一期，注射即刻至30s，T波升高，ST段抬高(超过o1mV)，尤以l0s变化最明显。 第二期，注射后30s至数分钟，T波低双相、倒置，心率变慢，PR及QT间期延长。 判定标准，以出现第一期或第二期缺血变化为阳性，否则为阴性，比较各组的差异，并做统计学处理。 家兔缺血模型：健康家兔，体重23kg，在清醒或麻醉状态下进行实验，记录胸前导联或D导联心电图，耳静脉30s注入垂休后叶素25ukg，心肌缺血的心电变化急剧，不便判断药效，亦可改用静脉滴注法，即在l0min内恒速滴人上述剂量的垂体后叶素，心电图变化可持续到1530min，除上述缺血性心电图变化外，偶有窦性心律失常、室性早搏、室性心动过速等心律失常发生。 判定指标同大鼠。 2，异丙肾上腺素诱发心肌缺血模型 (1)原理：异丙肾上腺素为受体兴奋剂通过加快心率增加心肌收缩力等环节，增加心肌耗氧量，造成心脏负荷过重，心肌微循环障碍，连续应用可形成心肌损伤，可用心电图和病理方法观测病变程度。适用调节心肌代谢、氧供需平衡及作用于受体药物的研究； (2)方法：健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、猫或犬均可。经心电图检查，弃去心电图有异常改变或心律失常。大鼠、豚鼠和犬每日皮下注射异丙肾上腺素28mgkg，家兔1016mg/kg连续两日，第一次和第二次绐异丙肾上腺素后30min内，每隔5min记录心电图一次，第二次给药后24h记录心电图后杀死动物，取心脏做病理切片检查。 异丙肾上腺素可引起T波倒置或双相，有ST段抬高，窦性心动过速(心率明显加快)，早搏或伴有其他心律失常。心肌病理观察可见：白细胞和巨噬细胞浸润，心肌纤维肿胀、断裂、横 纹消失、甚至溶解，发生玻璃样变和脂肪变性等。比较各心电图和病理变化，以判断药效。 (3)注意点：适用于研究影响心肌氧代谢平衡或作用受体而防治心肌缺 血的药物，用心电图难于定量观测药物的作用，须用病理观测，但制备病理标本及观察 量较大，难准确定量，是其缺点，可用分级定度或半定量法观测。 3麦角新碱诱发心肌缺血模型 (1)原理：动物左冠状动脉干注入麦角新碱，可诱发明显的冠状动脉痉挛 和血流动力学改变：平均动脉压、冠脉压和肺动脉压及外周阻力增加，心排出量下降，乙电图 ST-T抬高，60发生室性心律失常，左冠状动脉造影显示狭窄率达5075，动脉血氧下 降，血小板聚集和血拴烷增加，前列腺环素下降，显示急性心肌缺血缺氧全身高凝状态 的病理生理改变：、病理学证实，心肌有缺血坏死性改变及冠脉血栓形成。这种动物模型 可用以评价通过缓解冠状动脉痉挛、攻善血液流变性等多种途径防治心肌缺血的药物。 (2)方法：健康犬，体重lo20kg，戊巴比妥钠30mgkg注射麻酢，自右侧股动脉插入导 管至左冠脉主干，以麦角新碱o.22mgkg于生理盐水，lmin内拄入，可形 成冠脉痉挛及心肌缺血。 (3)观测指标：心电图或体表标测心电图ST及NST改变。血流动力学 改变。生化指标：CPK、血小板聚集、TXB2、keloPGF等变化。心脏病理学 改变。 (4)注意事项：本实验特点是不开胸，不结扎冠状动脉，通过心电图、血流动力学、生化 和病理研究以评价抗心肌缺血药的治疗作用。但设备及技术要求较高，如血流动力学的测 定需要带热敏电阻的Swan-Gmlg四腔导管等。为简化实验方法，可试用猫、兔、大鼠或豚鼠 按照垂体后叶素实验方法进行。 (六)心脏血流动力学实验 1原理 心肌缺血往往伴随心脏血流动力学改变，人部分治疗缺血性心脏病的有效药 物均可改善血流动力学而发挥作用。因此，心脏血流动力学指标应作为主要药效学研 究内容。实验动物可用犬、小型楮、猫或大鼠，但后两种动物心脏较小，某些指标不宜直接观 测，犬和小型猪应作为首选动物。 2方法 健康犬或小型堵，雌雄兼用，体重12-15kg实验动物用戊巴比妥钠(30mgkg) 静脉麻酐，手术台固定，分离气管并插管，连接电动呼吸机，调节潮气量300600ml，动脉氧 分压维持在如100mmHg，血ph在正常范围；左侧第四肋开胸，露心脏，剪开心包，做 心包床：分离冠状动脉左旋及主动脉根部。放置相应直径电磁量计探头，分别测量冠脉 血流量及心出量。左心室尖部插管，连接压力换能器，测定左室内压，再经微分恻定左室内压上升最大速率。颈外静脉插管至冠状静脉窦，动脉插管，以血氧测定仪或血气分析仪分别测定冠状静脉血氧含量及动脉血氧含量，计算心肌耗氧量。股动脉插管测定动脉血压，以肢体导联观测标准导心电图并计算心率。公式算其他血流动力学指标：心搏出量、耗氧指数、心脏指数、冠脉阻力外周阻力及氧利用率等。将上述各项指标同步录于多道生理记录仪。 3. 注意点 本实验难度较大，耍具备成套精密仪器。、实验人员要经过严格训练，尽量减少对心肌功能的影响。分离主动脉根部、冠状动脉及相应电磁换能器、心尖部插管等是手术成功的关键。 (七)冠脉循环实验 1原理 冠脉流量是评价防治心肌缺血药物的重要指标。多年来，国内外对扩张冠状动脉的药物进行广泛、系统、深入的研究：，虽然能增加冠脉血流量的药物很多，但不一定都有防治心肌缺血的作用。研究中，应以多种指标综合分析，了解平衡两方面的变化，特别是净效应，才能获得准确的结论。冠脉流量测定分两种：即整体冠脉流量的测定和离体冠脉流量的测定。为了解药物对缺血区心肌实际供血情况，可在整体实验动物中进行冠脉侧支循环、心肌区域血流量、心肌营养血流的研究，从不同角度反映药物对冠脉循环的影响及防治心肌缺血的疗效。2方法 (1)犬冠脉循环实验法：冠脉血流量测定，手术方法与步骤同心脏血流动力学试验。实验动物开胸完成后，分离冠状动脉左旋支，放置适宜电磁流量探头，测量冠脉血流量测定动脉血压。实验结束后，取下心脏称重，以13心重作为冠脉旋支血流供血区域，计算每100g心肌每lmin血流量。 冠脉侧支循环研究方法：实验用健康成年犬，手术同前，开胸手术完成后，分离上动脉根部。放相应直径电磁流量计探头测量心输出量。在冠脉左前降支下13处，分离并结扎冠状动脉，于远端插入冠脉插管。分离颈总动脉插管，与冠脉插管相连形成旁路，灌注前降支远端。三通的第三臂接橡皮臂，以收集反流量，测量反流压。插前，静脉注入肝素750ukg。分离股动脉，插入动脉管，记录动脉血压。实验开始，阻断须总动脉向冠脉左前支的灌流。停灌后10 min，分别记录心输出量、冠脉反流量及反流压，动脉压及心率，作为给药前对照值，然后给予实验药物。给药后不同时间，分别纪录各值，反流量推算单位压力差下冠脉恻支血管流量(CVC)=反流量动脉舒张压，以此反映侧支血流阻力变化。 (2)冠状静脉窦血流量测定：通过测量冠状静脉窦血流量，反映冠脉血流量的变化，约60的冠脉血经冠脉窦流入右心房。利用冠状静脉窦插管直接抽血测定血氧含量，计算出心肌耗氧量及氧摄取率。 注意事项：本法研究药物对犬或猫的冠状静脉窦流出量、心肌耗氧量的影响，简单方便，作为初筛抗心绞痛药物，能从供血与耗氧两力面来评价。 (3)Rb测定心肌营养血流量：冠脉血流除了通过毛细血管为心肌提供营养性血流外，一部分血流经动静脉吻合支分流人静脉，两者构成冠脉总血流量。为寻找治疗冠心病药物，观测心肌营养性血流量及冠脉总血流两者配合更有意义。铷与钾为同族元素，理化性质相似，均可通过血流进入心肌胞，血流越大，撮取量越多。Rb半衰期为195日，易于测定，对心肌有特殊的亲和力，摄取量为骨骼肌的2，5倍，故适用于测定心肌营养血流量。 方法：取体重24g的健康小鼠分组，给药或对照药后隔一定时间，根据待试药物的药代动力学过程确定，从尾静脉注射RbCl生理盐水溶液o1ml(400010000脉冲min)，5s注入，注射后30s，立即处死动物，取心脏，用生理盐水冲洗4次，每次l0ml。然后将心脏置玻璃研钵内磨成匀浆，放特制铝箔小皿内，在普通灯下烘干，用射线自动标器计数。以每个心脏放射性占注入总放射性的分数为指标，观察小鼠心肌摄取Rb量的多少。 注意：为防污染，全部操作在盘内进行实验后一并处理。Rb量及动物处死时间要准确，井将心脏的动静脉全部剪掉。每只动物取心脏时所用剪刀、镊子齐用套以防不同动物间相干扰。 (4)心肌区域血流量测定：放射微粒法测定心肌区域血流量的原理是利用放射性素标记的微粒注入左心房，循环的微粒几乎全部组织固定，故微粒流人每个器官的量(以放射性表示)与该器官血流成正比。 区域性心肌血流量的操作方法是用羰化塑料微球悬于含o01吐愠80的生理盐水内，使用的置旋涡混合器I2min，取微球500万，用生理盐水稀释到l0ml，10s内注入麻醉开胸犬左房导管，再用10ml盐水冲洗导管：注射微球的同时用恒速泵以6-7mlmin的速度从插人动脉弓的导管连续取3份参考样品，每份40s。实验结束时取出心，剔除表面的脂肪、血管与心瓣膜，将左窒壁切割成每份重12g的组织块，每块分成内膜下、中间与外膜下心肌层。用多导Y能诺分析仪记心肌与参考血样品的放射。汁算心肌区域性血流量。 根据阻断冠脉前后心肌组织内血流量的变化减少25以上者为缺血，减少大于75者为严重缺血区。用以研究药物对心肌缺血时不同部位，不问层次的心肌血流量的影响。 (5)离体心脏冠脉灌流法：哺乳动物离体心脏，插管人动脉灌流肘，灌流液须经冠状动脉经右心房流出心脏，故流出量可代表冠脉流量，在灌注压不变的条件下，其流量可反映冠脉阻力的变化。 方法：雄性大鼠，体重200-250g，腹腔注射06戊巴比罢钠45mgkg麻醉仰位固定，分离侧股静脉，注入肝素125u，剪开胸暴露心脏，动脉第支头臂动脉发出处近端横断，速将心脏投入4C灌流液，冲洗冠状动脉中的残留血液，将心脏移至lallgendoff灌流装置F端，以KrebsHenseleit液灌流。待心脏跳动规则后，在肺动脉起始处剪一小口，以利冠状血回流液排出。心脏表面放置铂电极，连接电刺激，用于心脏起搏。灌注约15rain后，连续测定每分钟冠脉流量3次：待恒定后开始给药，H量筒收集流出记录给药前后及给药后每lmin流出量。同叫可测定心肌耗氧星及其他生化指标的变化。 注意事项：药物的pH及无机离子含量血接近生理值，否则酸性药液可增加冠脉流量，须用与药物同样pH及无机离子的对照剂。 实验中供氧，温度、灌流压力及灌液PH要固定不变。灌流液必须用新鲜蒸馏水临时配制。冠脉血管阻力受血管张力影响，受心肌紧张度对心血管支持力的影响。药物抑制心肌收缩力，可使血管阻力降低冠脉流量增加，假阳性。为排除这种影响，可先心脏纤颤，然后观察约物对冠脉流量的影响。用6V直流电产生的断续感应电震直接刺激心脏，或用方形波刺激器刺激，也用交流电刺激引起心纤颤，然后测定每lmin冠脉流量的变化。(八)心肌氧代谢实验 在心肌代谢中，氧的供需占有重要地位，供氧不足，耗氧增加是缺血性心脏病的主要矛盾。左心室心肌耗氧量为每分钟810ml100g(心肌)，工作负荷增加时每分钟可达40ml100g(心肌)。停心肌供氧，经3次收缩即出现缺氧，因此，心肌耗氧测定是研究防治冠心病药物的重要指标。心肌氧代谢的研究方法约分为三类。 1直接测定 心肌耗氧星测定，在电磁流量汁测定冠脉血鼓的同叫反复多次测定动脉血及冠状静脉窦血氧量。可计算心肌耗氧。心肌氧张力测定，极谱仪的铂电极插入丌胸犬的心肌，连续纪录心肌氧张力的变化。心肌缺血时内膜下血流及氧张力下降甚于心外股，缺血什损伤及坏死也较外层心肌严重，因此，用双暴露电极测定左心室外内膜下氧张力变化以研究药物的影响，更有意义。能选择性增加心膜下氧张力的药物或措施，对缺血性心肌都有保护作用。这方法仪器昂贵，国内尚未广泛应用，离体心脏心肌片或心肌组织及体外培养心肌细胞耗氧量测定，离体心脏灌流，分别测定流人液及流小液的含量，可算出心肌耗氧。或用瓦氏呼吸器测定心肌的耗氧量。或测氧仪直接测定心肌片的耗氧量。方法简便，结果稳定。 2 间接测定 张力时间指数，根据心肌耗氧量与心脏做功有密切关系的原理，间接推测心肌耗氧量的变化。 心肌耗氧指数，根据左心室需氧量决定于心率及收缩压的原理，间接推算心肌耗氧量的变化。 正性肌力作用 ，心肌收缩力、心肌缩短速度与心肌耗氧呈线形关系，凡有正性肌力作用或延长射血时间者，均增加心肌耗氧量，可根据药物指标的影响推测心肌耗氧量的变化。 3 心肌耐缺氧实验 增加心肌供血(供氧)或减少能量(氧)消耗，维持能量氧)代谢平衡，可提高心肌耐缺氧能力，国内常用耐缺氧实验综合评价些药物的作用。离体心脏灌流耐缺氧实验，用不同程度的低氧或无氧流液灌流离体心脏，观察心脏功能、形态及生化指标的变化，可反映离体心脏对不同缺氧程度的耐受能力以及药物的影响，并可用于受体作用的研究，但易受体外环境的影响，须严格拧制实验条件。大鼠心肺灌流耐缺氧实验，此法除可反映离体心脏的耐缺氧能力和药物作用外，可同时测定血压、心输出、心房压及静脉压等各项指标，说明这些因素与心肌耐缺氧之间的关系以及药物的作用。实验方法较前者复杂，但可获得较多信息，对药物研究有定实用价值。体外培养心肌细胞耐缺氧实验，利用体外的人或动物心肌细胞，模拟临床缺血性心脏病形成缺氧缺糖性损伤的细胞病理模型，用于研究药物对心肌细胞缺氧能力的影响与前述方法结合。可从器官、组织及细胞水平反映药物对心肌耐缺氧能力的影响。其他，小鼠常压或减压缺氧实验，方法简单，应用广，反映整体(特别是脑组织)的耐缺氧能力，但特异性差，不能反映心肌的耐缺氧力，易受镇静、催眠或刺激性药物的影响，出现假阳性。用小鼠或大鼠测定速度、存活时间及死亡时余存氧含量，可以较准确的反映出整体动物的耗氧速度及药物的影响，较前者精细，但亦不能直接说明心肌的耐氧能力，耗氧速度。4，其他 心肌代谢除氧的摄取利用外，尚包括碳水化合物，脂肪、蛋白质等方面。深入研究药物对这方面的影响，是必要的。酶学研究如磷酸肌酸酶(CPK)可以定量地反映心肌损伤的程度，乳酸脱氧酶及天冬氨酸转氨酶(AST)等，也常用以反映心肌损伤度。测定动脉血，冠状静脉或缺血区血液乳酸或钾的含量，较心电图及血流动力学更敏感的反映心肌缺氧程度及药物的影响。两者升高说明心肌缺氧。 下面重点介绍几种常用方法。 (1)心肌耗氧量直接测定法：经冠状静脉窦和颈总动脉插管，抽取冠状静脉和颈总动脉血，以血氧测定仪或血气分析仪直接测定血氧含量算心肌耗氧量。可与实验中同时测定的其他血流动力学指标如冠脉血流量、血压、心电图等连续描记于生理记录仪，进行比较研究。 方法：健康成年犬，戊巴比妥钠(30mgkg)静脉麻醉开胸手术同前，从颈外静脉插冠状静脉窦，同时颈总动脉插管。药前及药后不同时间抽取血样进行血氧测定，与其他血流动力学指标同时纪录相比较。 注意事项：熟练掌握冠状静脉窦插管技术，保持导管在冠状静脉窦内正确位，以保证血流通畅。取血量要适度，避免抽取血量过多而造成缺血。(2)氧电极测定心肌耗氧率的方法：氧电极怯测定系利用氧在极化电压下溶解的氧被还原而产生电流。所以当测定系统将电极与被测溶液用能通过气体分子的聚乙烯薄膜隔开后，在一定极化电压下电极中测的电流量将只反映破测系统弥散过来的氧，故与被测溶液中的氧分压成正比，与组织的耗氧成反比，从而可以反映组织的代谢活动。 方法：大鼠或家兔随机分组，给药或对照液后，分别测定心肌耗氧量或结扎冠状动脉形成心肌缺血。再经定时间后处死动物，取心肌梗死区及对照区心肌组织，于冰浴上切、称重，加入心肌孵液，于37恒温水浴平衡，然后将孵育液注入测氧仪，测氧分压，孵育前后的氧分压差值即为该组织的耗氧值。实验时，每份样本检测23次，取其均值。 注意事项：本法为整体实验，离体测定，可对正常心脏或缺血心脏进行不同部位的心肌耗氧量测定，反映药物对正常及缺血心肌耗氧的影响，方法简便，快速、易普及，但影响因素较多，嘛醉、呼吸状态及供氧情况，心肌标本的处理从测氧条件的控制，仪器的稳定性与灵敏以及实验环境温度的变化等，均可影响实验结果作用。 (3)非特异性方法：小鼠常压耐缺氧实验法 方法：将lo个250ml或500ml的磨口广口瓶放入钠石灰10g，上垫滤纸。然后每瓶放人一只小鼠，各组动物分别给生理盐水或药物。将小鼠放入瓶后，将徐有凡士林的瓶盖盖紧，记录时间，观察各组动物存活时间。可用玻璃干燥器代替广口瓶。用纸板隔为小格，每格放入小鼠一只，干燥器内放入一定量的钠灰或氢氧化钠氯化钙等量，用以吸收水分和二氧化碳。或用装有氧电极的橡皮塞塞紧瓶，使氧电极与瓶内气体接触，连接测氧仪，可测出瓶内氧量变化，反映耗氧速度。 注意事项：此法特异性较差，大脑比心肌对缺氧更为敏感，很多有中枢抑制的药物或刺激性约物腹腔注入可减少动物活动，降低机体耗氧量，也能延长存活时间，出现假阳性结果。 (4)小鼠低压耐缺氧实验法，本法与常压耐缺氧实验法相似，但将小鼠放入密封的低压容器内。厥脱证药一、实验设计的医学基础 厥脱证是指邪毒内陷或内伤脏气、气阴耗竭或亡津失血所致的气血逆乱，正气耗脱的一类症证。厥证是指邪热内陷或阴寒内盛所致的四肢逆冷病证。脱证为阴阳气血衰竭的危重证候，厥证由轻转重致脱，脱证早期可为厥，厥脱不同于单纯的厥证或脱证，是由厥至脱，厥脱并见的临床综合病证，以手足厥冷，大汗淋漓，脉微欲绝，神志烦躁，淡漠或昏迷为临床表现。临床厥脱证已有较明确的辨证指标和治疗准则。厥脱证分为寒厥证、热厥证、阴脱证，阳脱证、气血两脱和阴阳俱脱证等。厥脱各证互相转化，热厥证外感温热病，热毒内陷高热致厥，进一步发展，热毒炽盛、内攻脏腑、阴液大耗而致阴脱证，也可热伤气阴，阴阳离决，阳气暴脱而致阳脱证。阳脱证治疗以回阳救逆固脱为主；阴脱征治疗以益气养阴固脱为主。根据辨证原则，可分为气阴两亏，阳气暴脱，真阴耗竭，热毒炽盛，心气不足，气滞血瘀等六型，各型之间可以互相挟杂。 厥脱证的临床表现相当于现代医学的各种休克和循环衰竭。引起的原因多种如久血性、感染性、心源性、创伤性，过敏严重性休克等。休克是一种急性循环功能不全综合征，是有效血液循环不足，使全身组织和重要脏器的血液灌注不足，导致组织缺血缺氧，微循环淤滞，代谢索乱和脏器功能障碍等一系列改变。二、药效学研究的实验设计 (一)对厥脱证动物模型的治疗作用试验 1常用动物模型 (1)失血性休克模型：用动脉急性放血的方法，急性失血达总血量的1520时，就发生休克，待血压降至53kPa时便达到难逆性克。可选犬、猫进行试验，大鼠及兔较差。 (2)感染性休克模型：用活菌、内毒素或脓毒病灶复制感染性休克模型，可选用小鼠、大鼠，兔、猫，犬等。 (3)心源性休克模型：用理化等有害刺激，损伤心肌，造成局部心肌坏死；结扎冠状动脉的主要分支，造成心肌缺血性梗死；将塑料微球注入到冠状动脉内，造成冠状功脉栓塞；在心导管上附上不锈钢电极，插入到冠状动脉，通以弱电流，造成冠状动脉血栓及心肌缺血性栓塞等造成心源性休克动物模型。可选用犬、猫、小型猪等。 (4)创伤性休克模型：用止血带造成动物肢体缺血引起创伤性休克；反复锤动物腿部肌肉；用木板及钳持续挤压动物腿；牵扯肠襻；损伤胸腔器官等均可引起创伤休克。常用动物有小鼠、兔、猫等。 (5)过敏性休克模型：用抗原物质致敏动物后，注入相同的抗原，就可引起急剧的休克反应。最常用的动物是豚鼠，其次是兔、大鼠、小鼠，犬等。 (6)肠系膜上动脉夹闭性休克模型：夹闭肠系膜上动脉，引起肠道缺血，当一段时间后，恢复血液供应，此时即引起休克。可选大鼠、免等。 (7)其他类型休克：烧伤、疼痛、胰岛素休克、微循环障碍、弥漫性血管内凝血等动物模型，亦可适当选用。 2 观察指标 (1)模型动物死亡率：小动物休克模型以休克动物死亡率的影响评价有效性。 (2)相关指标：如与休克病理性情况改善相关的血流动力学和血液生化学等。 3方法学评价 上述各种方法造成的模型，可根据新药的主治和功效选。阳脱证临床上以神志淡漠、面色苍白，四肢厥冷，冷汗淋漓为主证，兼息微唇绀，脉微欲绝或不能触及，血压下降，尿少，与临床“阳脱证”的表现相近似的动物模型如：感染性休克晚期、失血休克晚期及心源性休克模型等。气血两脱，由急性失血引起，即失血亡阴之脱证，用失血性休克代偿期和失代偿早期作为气血两脱证的动物模型，如为失代偿晚期，属阴阳俱脱证。阴脱证与感染休克脱水症状相似，可用肠道致病菌感染动物，造成严重泄泻，脱水；亦可用内毒素或脓毒病灶引发休克，烧(烫)伤性休克动物亦可作为阴脱型模型。 (二)其他试验 1. 血压及微循环 因为阳脱证(亡阳)和阴脱证(亡阴)，均血压和微循环异常，必须进行血压从微循环的观察。 2. 血流动力学、心功能及重要内脏血流量 药物对整体动物血流动力学和心功能以及对心、脑、肾等重要内脏血流量的影响，关系到药效作用，应进行这方面试验。 3根据不同休克动物模型，增加有关病因的试验 (1)治疗邪毒内陷之脱证的药物：除进行上述有关休克模型外，还做祛邪相关的试验，如抑苗、抗病毒、对抗毒索、抗炎、解热等试验。扶下相关的试验，如抗应激能力试验、免疫功能试验、物质代谢试验及内分泌功能试验等。 (2)治疗心气十足的药物：可增加心功能衰竭模型、心功能测定及血流动力学等有关试验。 (3)治疗与气脱类似的过敏性休克药物：或增加过敏试验等内容。 (4)治疗剧烈疼痛致脱的药物：可增加镇痛等试验。 4其他 还有重要脏器血流量如脑、肾及冠状动脉血流量的测定、自由基测定及各种酶的测定、电镜微观结构观察等对阐明厥脱证药物的机制是必需的。 (三)阳性对照药 阳脱证治疗以回阳救逆固脱为上，可用参附汤、四逆汤、参附注射液、参附青注射液等作对照；阴脱证治疗以益气养阴固脱为主，如生脉散、参麦散、生脉注射液、茶麦注射液等作对照。也可用多巴胺等作对照。 三、动物模型建立方法 (一)厥脱症失血性休克模型 1原理 以动脉急性放血、急性失血达血量的15-20时，就可发生休克，待血压降至53kPa(40mmHg)时便达到休克。 2 操作方法 将麻醉猫股动脉插管并连接储血瓶供放血和储血用，用肝素钠10mgkg抗凝，开始放血每分钟为2ml，当血压低于10kPa，改为分钟O5ml，放血使血压降至53kPa，此时为失血代偿期。如血压下降，抬高储血瓶回输出血液，待储血瓶内最大放血量的40的血液自动回输机体时作为失代偿朋，总放血量为2030mlkg，此时再将全部放出的血液输回机体，同时静脉注射试验给药，对照组以等量生理盐水静脉滴人。阳性药组以多巴胺进行比较。观察血压、呼吸、心电图、最大放血量、存活率等。 3造模成功指标和药物疗效观察 放血使血压降至5. 3kPa(40mmHg)，此时为失血代偿期，此时给予治疗厥脱证新药，同时输血液，血压可回升，动物可存活。 4 注意点 (1)放血速度不宜过快，否则会突然死亡。 (2)如动物进入失代偿期晚期，此时将全部放出的血液输回机体，仍有95-98动物死亡。 (二)感染性休克模型 1原理 内毒素是细菌重要的致病因子之一，在微量时引起发热，大量进入血液则引起循环衰竭造成厥脱证而致死亡。 2操作方法 用大肠杆菌内毒素或内毒素静脉注射造成感染性中毒性休克，可用小鼠、大鼠、兔、猫、犬等。麻醉犬静脉注射大肠内毒素，观察中毒性休克血流动学的变化和抗休克作用，亦可进行血液生化及酶学指标观察。 3造模成功的指标和药物疗效观察 内毒素注射初期，DAP，MAP，指标下降迅速。15min时，各指标有不同程度回升，60min后，冉度出现降低，维持在休克时的水平药效根据给药后上述指标情况，观察给药后2h内，2h从3h后，外周血压指标情况，应与对照组有显著差异。 4注意点 (1)实验用大肠杆菌内毒素可由干燥大肠艾希菌制备，经毒力测定后封装在安钵内，保存备用。细菌内毒素种类很多，常用的大肠杆菌、鼠伤寒杆菌、各种痢疾杆菌、马流产杆菌等制配方法、纯度及动物敏感性不同，其毒力不同，如鼠伤寒杆菌内毒素对小鼠的LD50为3mgkg左右，而黏质沙雷杆菌者达35mgkg。实验前必须测定所选内毒素对所用品系动物的毒力。 (2)自制内毒素可选用高毒力菌株增菌培养后刮下菌苔，然后按WestphaI热酚法制备。也可用加热杀死的高毒力阴性细菌苗悬液作粗制内毒素。 (3)静脉注射内毒素所致小鼠死多发生于24h内，宜在24h内记录小鼠死亡时间。 (三)心源性休克模型 1原理 用犬冠状动脉前降支分段结扎，结合冠状插管阻流，使心肌缺血缺氧，心肌细胞受损，心肌收缩性能及心脏泵血功能明显下降，全身血压下降，使重要器官血液灌注不足而处于休克状态。 2 操作方法 用犬以戊巴比妥钠25mgkg静脉注射麻醉，分离股动脉与股静脉，静脉插管连接二通，一侧供输液，一侧供给药。做气管插管，接人工呼吸机。正中开胸，剪开心包，冠状动脉前降支末梢、根部下分别用小圆针穿入细丝线。股静脉导管上连流量计探头，将冠状窦插管与导管另一端相连；从心耳剪小口迅速插入冠状窦插管，用粗线将心耳与插管扎上；从心底部沿房室沟将插管插入冠状窦；轻轻扎住插管防止滑，保持回流导管畅通。颈外静脉插入高敏感度压力换能器达右心房测中心静脉压(CVP)，左股动脉测平均动脉压。左颈总动脉插入压力换能导管直至左心室测左室压峰值；同时测左室压力变化速率正负最大值左室舒张末期压(NEDP)。用体温仪测下体温。同时测心电图(ECG)和心率(HR)和冠状窦血流量(SCBF)，各项指标均记录于多道生理记录仪。 3 造模成功的指标和药物疗效观察 待犬MAP稳定在10kPa以上时，每隔5min顺次结扎冠状动脉前降支末梢、中部与根部，5-10min后阻断冠状窦血流。待MAP下降至93kPa或原血压(10-13kPa)的70以下者视为休克。从第一次结扎到MAP降至休克水平的平均时间为764min，休克动物ECG均发生缺血性改变，MAP、LVSP均显著下降，BT降低，CVP、LVEDP 上升但无明显统计学意义。 药效可根据绐药后能否使休克动物MAP增加，使LYEDP与冠状血管阻力(CVR)和CVP下降，同时可用阳性药多巴胺作对照。 4注意点 (1)麻醉不能过深，动物MAP低于10kPa时弃去不用。 (2)操作过程中尽量避免损伤血管，出血点应结扎或烧灼止血。 (3)冠状插管不可插入太深，方向应与心脏房室曲线吻合。 (4)结扎冠状动脉部位的次序不能错先结扎根部易引起动物死亡。 (5)多巴胺(DOP)是公认的治疗心源性休克有效药物之一，能明显改善本休克模型心肌收缩性能与心肌供血，升高血压等。 (四)创伤性休克模型 1原理 以定重力自一定高度自由落下，造成股骨粉碎性骨折，用止血带造成动物体缺血再灌注损伤；反复锤击动物肌肉等均引起创伤性休克。 2操作方法 取健康家兔，腹腔注入乌拉坦麻醉，颈总动脉插管经生理记录仪监测血压，左股动脉插管以备取血样。创伤组以一定重力自一定高度自由落下，造成兔右侧股骨中段粉碎性骨折；防治组创伤方法同上，创伤前l0min和创伤后即刻静脉注入被试药物；对照组插管手术同上，但不造成创伤。三组动物血样时间均相等。 3造模成功的指标和药物疗效观察 创伤组动物实验后2h血压降至682kPa，明显低于防治组(1176kPa)和对照组(135kPa)，血浆乳酸脱氢酶和组织蛋白酶活性以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量均显著高干防治组和对照组，同时心、肺、肾及胃黏膜等组织MDA含量和钙含量较防治组和对照组明显增高。创伤组动物肺湿干重量比明显高于对照组，肺泡表面活性物质显著减少，创伤组动物胃黏膜见点状、条索状和片状缺损，并有血现象。 4. 注意点 (1)每次造成创伤的物体重量、高度、创伤部位，严重程度要一致。 (2)取样时间要相等，测定各项指标要精确。(五)肠系膜上动脉夹闭性(sMAO)休克模型 1 原理 休克的发生可能与肠道缺血再灌注时自由基及其他多种毒物质的产生有关。自由基不仅导致肠组织的脂质过氧化损伤，也可造成肠外生命器官如心、肺、肝等组织的脂质过氧化损伤，自由基参与此休克时的细胞损伤过程。 2操作方法 取纯系大鼠，体重250g左右，用133乌拉坦与l氯醛糖混液0 6ml100g(体重)腹腔注射麻醉，气管插管，自主呼吸。左颈总动脉插三通开关，按压力换能器，连于二道生理记录仪记录血压。右颈外静脉插管供给药用。腹部正中切于，生理盐水纱布保护下分离出肠系膜上动脉，以上创伤动脉夹夹闭，关闭腹腔，动物全身肝素化(80ul100g(体重)，关闭动脉1h后松夹。给药组可在松夹前20min右侧颈外静脉注入试验药物。通过塑料三通左颈总动脉取血，分别测定夹闭前、松夹后1h、2h三个时间的全血谷胱肽过氧化物酶活力。至松夹2h，取动物心、肝、肾准确称量1g，测定GSH活力，按DTMB直接法测定。以Folim酚试剂法作蛋白定量。对照组用等容量生理盐水。其余条件均同给药组。 3造模成功的指标和疗效观察 造模成功的动物在松夹即刻，松1h、2h MAP、脉压均下降。全血及心、肝、肾组织活力降低。受试药物应能使MAP升高，全血及心、肝、肾组织GSH-Px活力明显升高。 4 注意点 在分离大鼠肠系膜上动脉时，尽量避免出血或过多牵拉。用无创伤动脉夹闭要完全。作匀浆前心、肝、肾组织尽量剪碎，匀浆时每次时间和频率要保持一致。必需注意各试剂的配制和保存方法，以免影响结果。按酶学反应的温度、PH和时间进行，同时须准确计时和读数。心律失常药 一、实验设计的医学基础 心律失常是指心脏活动节律不正常。正常情况下，心搏的激动起源于窦房结，节律基本规则，频率有定范围，沿窦房结左右心房心室的传导途径，以一定的速度传播到左右心室。凡偏离这种正常心律的心脏搏动都属心律失常，它由心脏中节律性或激动传导障碍或二者同时失常引起。心律失常同时涉及心脏电活动和机械性搏动的节律，但虽明显最精确地从心脏电活动的改变中反映出来，因此心电图是反映心律的最重要最直接的指标。心脏的功能、血供、神经调节等任项异常均部分或完全引起心律失常，如各种器质性心脏病、全身性疾病(感染、缺氧、中毒、电解质紊乱、药物作用)、某些系统疾病(甲亢、颅内出血等)、麻醉、胸腔手术、自主神经功能失调等。 中医学中类似心律失常症状的描述散见于心悸、怔忡、眩晕、昏厥等病症中，病位以心为主，与肝、脾、肾、胃等关系密切，表现为虚(气、血、脏腑)、实(瘀、滞、痰饮)两类，虚多见于气血不足，阴阳失调和血脉瘀阻等原因引起。 心律失常的治疗首先是确定病因，明确心律失常的发病因素及其相互关系，在治疗病因的同时根据需要治疗心律失常。现代医学抗心律失常的药物主要分为四类：钠通道阻断剂，它主要抑制内向快速除极，钠流动，从而延长动作电位上升速度，主要分为三个亚类：In除极作用中等，而复极延长，如奎尼丁、普鲁卡因酰胺、双异丙肾上腺素等；Ib兼有促进K外流作用，除极作用弱，复极作用缩短(对PR、QPS、QT无影响)，如利多卡因、美西律、妥卡尼、苯妥英钠；lc除极作用强，复极作用甚小，如普罗帕酮、氟卡胺、Lorcninine等。类为肾上腺素能受体阻滞剂，如Nadolol、Pindolol、Sotolol、Timolol等。类为复极化抑制剂，如胺碘酮、Stolol等。类为钙通道调节剂，阻断钙通道Ca内流，使心肌细胞去极化减慢。 中医可用补益养血、滋阴和阳疏通血脉等方药，防治“脉结代”，具抗心律失常的作用。受试中药的其他相关药效作用如补益、理气等，可根据受试物的情况而增加。二、药效学研究的实验设计 (一)对心律失常模型的防治作用 1常用的动物模型 主要两类模型。 过速型心律失常模型。 (1)电刺激心脏诱发心律失常：适度的电刺激接近自然异位冲动，可诱发心律失常。 (2)外科手术或机械损伤形成的心律失常：由传导延缓和折返激动以及舒张自动除极和异常自律性所致。包括：冠状动脉结扎形成缺血性心律失常；冠状两期结扎形成心律失常。 (3)化学药物诱发的心律失常：常用的有肾上腺素诱发的心律失常。肾上腺素兴奋受体，心脏自律性、传导性、应激性及心率提高，诱发室性心律失常，氯仿诱发小鼠的心室纤颤。可能与自主神经及具递质释放、或肾上腺髓质分泌肾上腺索，以及对心脏的直接作用有关。乌头碱诱发的心律失常。能使钙通道开放，促进细胞去极化，加速起搏点的自柞性，形成多源性异位节律，缩短不应期。弧心苷诱发的心律失常。直接抑制NaK-atp酶，使心肌细胞内Na多K少，使心室自律性增高。氯化钡诱发的心律失常。增加蒲氏纤维Na内流，提高舒张期去极化的频串。氯化钙诱发的心律失常。钙增加能降低蒲氏纤维的兴奋性显著增加普通心肌的去极化，导致局部传导阻滞，并增加冲动扩散的不齐。乙酰胆碱诱发的心律失常。缩短动作电位及不应期，使心肌不同部位兴奋的扩散不一致，导致折返形成。 缓慢型心律失常模型 (1)维拉帕米(异博定)诱发小鼠缓慢型心律失常：抑制心肌细胞内Ca流，抑制房结和减慢房室传导。 (2)麻酐剂诱发的心动过缓模型：尿酯能阻断中枢神经突触传递，对心脏也有抑制作用，麻醉后出现一过性心率减慢，多在10min内恢复正常。 (3)烟碱诱发的心动过缓模型：烟碱先兴奋后抑制血管运动中枢、交感神经节、肾上腺髓质及颈动脉化学感受，表现心率减慢、血压下降、窦性停搏等。 2观察指标 纪录ECG，也可用心电示波器进行监测观察项目有心律失常(室性早搏VP、室性心动过速VT)出现的时间，心律失常程度，药物作用的维持时间，恢复窦性心律动物数动物总数。房颤或室颤发生率和死亡率。、度房室传导阻滞。 3方法学评价 (1)动物：小动物(大鼠、豚鼠、家兔、猫)的心室纤颤有自发恢复的可能，因为冲动在比较短的通路中，可能在仍处不应期的区域内消失，异常兴奋波将不可能形成环形运动。豚鼠心脏地对心血管药物的感受与人相似，兔耳静注给药方便，适宜在不麻酢条件实验，猫对作用于心脏的药物感受性较好，体格健壮，适宜作开胸手术，固定电极等试验，大鼠易得但对强心甘不敏感。大动物(狗、猴、猪)心室纤颤很难自然恢复，研究病因狗最适宜，猪的冠状血管系统与人相似，现在越来越多地采用小猪以冠状动脉结扎的方法形成心律失常。 (2)整体动物形成的心律失常在麻醉或清醒状态下实验，不仅能观察受试物的作用，后者还能观察受试物的毒性。离体心脏标本也可形成心律失常。 (3)心律失常的恢复通常以恢复窦性心律，连续30min下再复发为恢复；心律失常持续时间以自心律失常一直到恢复窦性心律为止，减去中间间断的恢复时间。 (4)结扎冠脉、大鼠静注乌头碱形成的心律失常模型较稳定和持久，可供实验治疗，其他模型多用于预防给药。 (5)当心律失常持续叫间较短，无法进行实验治疗时，采取先行给药物，再造成心 律失常，在同样条件下，比较对照组与给药组形成心律失常的时间、程度、持续时间或诱发心律失常所用化学物质的剂量等，这可视为预防给药的保护作用。考察治疗作用可选择能维持心律失常较长叫间的动物模型，心律失常发展的相对稳定阶段绐受试药物，观察指标，判断疗效。 (二)其他试验 1 离体豚鼠右心室乳头肌实验 离体豚鼠右室乳头肌标本固定在改良台氏液灌流槽中，给与基本节律电刺激，稳定1-2h后，对窦房组织进行微电极探查，找出窦房结搏起细胞，并使动作电位稳定，开始实验测定及记录。实验采用常规心肌细胞内微电极技术。基本节律刺激的参数为波宽1ms，频率1Hz，强度为阈强度的2倍，对同一细胞分别纪录和测试给药前、后和冲洗的动作电位变化ERP的变化，将细胞分组给予奎尼丁50ug和待测药物。 2 离体家兔窦房结起搏细胞动作电位 将制好的家免窦房结标本固定在充以95O2+5CO2的R-L液灌流槽中稳定1-2h，对窦房结进行微电极探查，找出窦房结起搏细胞，并使动作电位稳定，然后分别纪录细胞在给与待测药物前、后和洗后的动作电位变化，比较：MPR、APD、SRVP4、SEF和APA。 (三)阳性对照药 与已知公认临床疗效较好的类似药进行对照，最好选用作用类别相似的中药成药，也可酌情用疗效明确的西药及新药。 受试药给药方法中至少有一种与临床相同。如果受试药为中药提纯物，水溶的可用静注或具他注射方法，如系中药粗制剂，一定要灌胃或注入十二指肠内，口服或灌胃通常在形成心律失常前1h或更长时间给药，腹腔注射或十二指肠注入应在1015min前，皮下、肌内注射通常在20-30min前给药。三、动物模型建立方法 (一)电刺激脏诱发心律失常 1原理 适度电刺激完全是可逆的，不损伤心肌，比其他方法更接近自然的异位冲动，可因刺激电极度所按位置不同诱发房性和室性心律失常，随刺激强度不同可引起早搏。心动过速、扑动或纤颤可连续实验24h。 2方法 猫雌雄不拘，体重23kg，戊巴比妥(35-45mgkg)腹腔注射麻醉，气管插管，接人工呼吸，开胸腔，切开心包膜，将作电极用的钢制小夹分别置于心尖部和右心室底部(或心尖部左侧房室交界处)或用双极分别插在左室及心耳进行连续刺激，刺激参数为波宽1mm，频率20Hz，当电流强度为025mA时引起早搏，15mA引起室性心动过速，18mA引起室性过速和扑动，2. 5mA引起室性纤颤。也可固定电流渐加快频率，以测定阈值。还可以电压为室颤的指标，每3min重复刺激，以两次的平均电压为对照值。家兔2kg左右，乌拉坦12gkg，皮下注射麻醉仰位固定，胸正中开胸，避免损伤胸膜，保留自发呼吸，剪开心包，以正负电极分别夹住左室心尖和上方，连接电子刺激器，频率64Hz，波宽l0ms，从4V开奸，每次刺激30s，每隔2min刺激一次，每次递增2V，观察产生心室纤颤的电压，作为对照，15min后静脉注射药物，给药后5min、15min、30min按上法测试心室纤颤的电压，进行统计处理。 (二)冠状动脉结扎形成心律失常 1原理 结扎冠状动脉前降支30min，再灌注45min造成心肌急性缺血再灌注损伤模型。再灌注期间尤其是再灌注即刻至3min内出现病理性Q波，室性早搏和心动过速。复灌心律失常的发生机制可能为多个因素共同作用的结果，主要与心肌细胞电生理改变，肾上腺受体增加多，自由基损伤，钙超负荷及钙反常现象有关。 2方法 大鼠戊巴比妥钠50mgkg皮下注射麻醉，用动物人工呼吸机作人工呼吸，通气量为250mlmin，于左前胸45肋间开胸，轻压胸廓挤出心脏，于肺动脉圆锥左缘，左心耳下沿用无损伤缝合针2或0号涤纶线缝于冠脉左前降支下，把心脏放回胸腔，静脉注射生理盐水或受试药物后5min，将自径为3mm长5mm的橡胶管与冠状动脉左前降支结扎，造成心肌缺血。5min后剪断缝线，取下橡胶管，使冠脉重新得到血液的灌流，在示波器监视下纪录给药前后、复灌前后ECG，纪录复灌15min内室性心动过速、室颤及心跳停止发生中。 (三)氯仿诱发小鼠的心室纤颤 1 原理 氯仿诱发小鼠纤颤可能与自主神经及其释放的递质有关，因为这种心律失常能被阿托品等M胆碱受体阻断剂或肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔所对抗。将节后抗胆碱药与受体阻断剂适当配伍，则抗氯仿性心室纤颤的作用显著增强。当小鼠吸入一定量的氯仿后会诱发心室颤动，小鼠的心室颤动只数可以反映氯仿致小鼠心律失常的发生率。 2方法 小鼠，雌雄各半，分组；给待测药物，一定时间将小鼠放入倒扣的500ml烧杯中，其内放入浸有3ml氯仿的人棉球(以后每换1只鼠加05ml)。经230min后小鼠麻醉躺下，呼吸渐抑制。待呼吸刚刚停止后，立即将小鼠取出，纪录心电图或削胸检查心室纤颤阳性率。 (四)乌头碱诱发的心律失常 1原理 乌头碱引起心律失常的作用机制复杂，它直接兴奋心肌使心率加快；中毒量的乌头碱可使支配心脏的自主神经功能紊乱。电生理实验证明乌头碱能加速心肌细胞Na内流，促进细胞膜去极化，诱发异位节律点，缩短不应期，而导致心律失常，由于乌头碱诱发的心律失常较持久，可以实验治疗，也可以预防给药。 2，方法 大鼠麻醉分组，纪录正常ECG后静脉注射乌头碱25ugkg快速注射，5s注射完001，025m1100g(体重)，出现心律失常稳定10min后静脉注射待测药物、阳性对照药和等容量生理盐水。观察心律失常持续时间。静脉注射乌头碱25ugkg，稳定后大都出现短阵发性室性过速，或室性过速。 (五)强心苷诱发的心律失常 1原理 毒毛旋花苷G等强心甘直接抑制Na、K-ATP酶，使心肌细胞内失钾，导致心肌组织的静息电位和最大舒张电位减小(负值变小)，而引起心肌自律性增高；使蒲氏纤维与心室肌接合部位单向传导阻滞，而引起折返；中毒量的强心苷可引起暂时性去极化，导致振荡后电位而引起异位节律出现室性早搏。毒毛旋花苷G对心脏的毒性表现为室性早搏(VP)、室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)、心肌停搏(CA)。 2方法 豚鼠雌雄各半分组，皮下注射乌拉坦12gkg麻醉后，将豚鼠背位固定手术台上，记正常导ECG，接心电示波器，随时监测心电变化。做肌静脉插管，一侧与恒速输液泵相连，准备恒速注射毒毛旋花苷G每分钟1ug100g(体重)，另侧给治疗药物或等容量的生理盐水，静脉注射3min后，开恒速泵，每分钟或必要时(心电图变化明显或心脏将要停跳前)记录心电图至心跳停止。算出出现VP、VT、VL和CA所用毒毛旋花苷G剂量，将给药组与对照组相比，经统计处理求出P值。 (六)氯化钡诱发的心律失常 1原理 氯化钡能通过增加慢通道内流，增加心率而诱发心律失常，水合氯醛与氯化钡产生协同作用，诱发大鼠出现双向性心律失常。抗心律失常药能延缓心律失常的发生或缩短心律失常持续时间。 2方法 大鼠雌雄各半，分组。皮下注射水合氯醛02gkg麻醉，背位固定手术台记录正常ECG。分别静脉注阳性药(奎尼丁5mgkg)和受试药5min后立即快速(3s注完)静脉注射氯化钡lmg/kg并纪录ECG，立即出现双向心动过速，渐变成室性早搏，而渐恢复正常窦性心律，记录心律失常持续时间。 (七)氯化钙诱发的心律失常 1 原理 氯化钙诱发心律失常的作用机制较复杂，心脏的不同部位对钙敏感性不同。当钙增加时，能降低蒲氏纤维的兴奋性，但却显著增加普通心肌的去极化，导致局部传导阻滞，并增加冲动扩散的不齐，而诱发心律失常。高钙还能使心室肌动作电位第二相完全消失，蒲氏纤维动作电位的时程却无改变，使心室兴奋期的恢复不一致，而引起心律失常。肾上腺素能神经与诱发的心律失常也有关。 2 方法 大鼠雌雄各半，分组。分别给予受试药物、阳性对照药(如奎尼丁10mgkg)和等容量的生理盐水，定时间快速静脉注射氯化钙110mgkg(3s注完)。观察发生心室纤颤和死亡的动物数。 (八)异博定诱发的小鼠心动过缓 1原理 维拉帕米能阻滞心肌细胞慢通道，抑制ca向细胞内流，对心脏能阻碍慢反应电活动；能抑制窦房结的自律性，减慢心率；亦能延长房室结的有效不应期减慢房室传导。静脉注射过量或过快可引起心动过缓，房室传导阻滞，甚至心脏停搏。 2方法 小鼠雌雄各半分组，以10尿酯20mg10g体重麻醉，尾静脉注射维拉帕米80ug10g(浓度为2. 5mgml)，经10s左右的潜伏期山现心动过缓和房室传导阻滞，主要为心动过缓，度或度房室传导阻滞，可持续10min左右。 结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！83