病理新技术在子宫颈病理新技术在子宫颈CIN的应用的应用河南省人民医院病理科 孔令非病理学新技术oFISHo原位杂交o免疫组织化学o生物传感器o荧光原位杂交荧光原位杂交Fluorescence in situ hybridizationo原理原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况FISH操作样本预处理样本预处理 脱蜡，脱水及水化，消化，脱蜡，脱水及水化，消化，探针、样本变性探针、样本变性 78 78 探针样本杂交探针样本杂交 45-50 45-50杂交后洗涤杂交后洗涤结果观察结果观察FISH FISH 探针种类探针种类CSP着丝粒探针着丝粒探针GLP特异性位点探针特异性位点探针染色体整臂探针FISHFISH探针的类型探针的类型l 全染色体涂抹探针全染色体涂抹探针 （WCPWCP）l 染色体计数（着丝粒）探针染色体计数（着丝粒）探针（CSPCSP）l 位点特异性探针（位点特异性探针（GLPGLP） l单色特异性探针单色特异性探针l双色分离重排探针双色分离重排探针l双色双融合易位探针双色双融合易位探针 IgHBcl2IGH/BCL2探针探针14（灰）号和（灰）号和18号（黑）染色体号（黑）染色体IgH基因基因Bcl-2基因基因杂交杂交正正 常常 异异 常常融合融合基因扩增基因扩增双色双融合易位探针双色双融合易位探针( IGH/BCL2( IGH/BCL2） FISHFISH的特点的特点操作简单 检测快速 结果易观察灵敏性和特异性高可检测样本种类多 空间定位精确FISH检测在临床中的应用o产前诊断o血液病检测o实体瘤检测端粒，端粒酶及作用o端粒是真核细胞染色体末端的特殊NDA-蛋白结构，其DNA含大量TTAGGG重复序列，在进化中高度保守oDNA酶不能复制线性DNA（端粒是线性DNA）o大多数体细胞的端粒会随周期性复制而缩短，最终达到一个使染色体完整性丧失的临界点，细胞增殖停止；许多肿瘤细胞端粒酶活性增高，是肿瘤细胞增殖的关键步骤o作用：n保护染色体基因组免受降解或重组n为染色体末端提供一种可消耗的非编码序列，以缓解或取消末端复制所带来的染色体DNA进行性缩短o生殖细胞具有端粒酶活性，其端粒不随年龄增加而缩短，故成为永生细胞o端粒酶由RNA，DNA及蛋白质组成，本质是一种逆转录酶o端粒酶活性决定于端粒酶RNA（human telomerase RNA, hTERChTERC)和端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase, hTERThTERT)nhTERC是端粒长度稳定的直接因素o保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期有活性和潜在的继续增殖能力o人端粒酶基因位于3q26.3，该基因的扩增可阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生 宫颈脱落细胞及组织学FISH探针CSP3TERChTERChTERC基因定位于基因定位于3q26.33q26.3 3 3号染色体着丝粒信号号染色体着丝粒信号All the three centers obtained similarly increasing trend of hTERC positive rates according to the severity of cervical lesions, for both cytological results and pathological diagnosis. 中国8350例子宫颈病变TERC扩增TBSTBS分级分级正常正常/ /炎症炎症ASCUSASCUSASC-HASC-HLSILLSILHSILHSILTERCTERC基因扩增发生率（基因扩增发生率（% %）4.64.613.513.528.628.625.225.287.787.7病理分级病理分级正常正常/ /炎症炎症CIN 1CIN 1CIN 2CIN 2CIN 3CIN 3浸润癌浸润癌TERCTERC基因扩增发生率（基因扩增发生率（% %）4.2-10.64.2-10.626.826.865.465.483.183.193.593.5hTERC检测临床意义o伴有hTERC基因扩增的癌前病变的病人有52%96%的恶变可能。 o可预测CIN1/CIN2 向CIN3发展的风险因素，其灵敏度是100% ， 特异性是 70%. oFISH是早期诊断和风险预测的有效手段(AJP April 2005, Vol. 166, No. 4)ohTERChTERC基因检测在宫颈癌和宫颈癌前基因检测在宫颈癌和宫颈癌前病变诊断中有重要价值病变诊断中有重要价值n魏丽惠，李亚里，吴瑞芳，陈忠，屠铮，江静，李静然o北京大学人民医院妇科，北京，中国o中国解放军总医院妇科，北京，中国o北京大学深圳医院妇产科，深圳，中国o犹他大学医学遗传学科，盐湖城，美国o该研究显示，采用FISH技术检测hTERC基因扩增可在宫颈细胞学玻片上进行，具有无创性和客观性的特点，敏感度和特异度高，在宫颈癌和宫颈癌前病变的诊断中有重要价值。hTERC基因的异常扩增可能成为宫颈病变恶性进展的早期标记物。o北京协和医院郎景和教授点评：北京协和医院郎景和教授点评：n在液基细胞学检查和检测人乳头状瘤病毒筛查宫颈癌的同时，检测hTERC基因，有望成为协助宫颈癌和宫颈癌前病变诊断及预测癌前病变是否向子宫颈癌发展的重要指标，而造福广大妇女。细胞非典型性发育异常细胞非典型性发育异常细胞非典型性发育异常细胞非典型性发育异常细胞癌变细胞癌变阻止细胞正常凋亡阻止细胞正常凋亡高危型高危型HPVHPV持续性感染持续性感染人类染色体端粒酶基因人类染色体端粒酶基因(hTERC)(hTERC)扩增扩增致癌基因致癌基因E6/E7E6/E7编码的原癌蛋白表达编码的原癌蛋白表达TERC基因的扩增可阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生 P16P16表达表达E7结合结合RBE6结合结合p53o随着宫颈病变级别增加，hTERC的阳性率增加ohTERC阳性率n正常或炎症组 4.2-10.6%nCIN1组 26.8% nCIN2组 69.23%nCIN3组 83.58%n宫颈癌组 95.65% 正常及正常及CIN1CIN1的的hTERChTERC基因阳性率明显低于基因阳性率明显低于CIN2CIN2及以上者，及以上者，P P 0.010.01 ohTERC诊断CIN2或CIN2以上病变n敏感度 81.40%n特异度 95.04%n阳性预测值 70.00% n阴性预测值阴性预测值 97.29% 97.29% Human Papilloma Virus(HPV)o环状双链DNA病毒o超过120种亚型o其中的72种亚型可引起肛门及生殖器疾病oLow risk (LR-HPV): 6,116,11,40,42,44,54,61,70,72,81,40,42,44,54,61,70,72,81oHigh risk (HR-HPV): 16,18,16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,731,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,828,82 HPV的生物学状态: 游离或整合o在HPV感染的早期或瞬间感染，HPV基因组以游离的环状DNA形式存在于宿主细胞核中。 (Condyloma and CIN-1)o持续的HPV感染，使其DNA整合进宿主DNA，标志着恶性转化。 (CIN2lesions)o持续性的HPV感染几乎总是发生在两种上皮的交界处（宫颈移行带、肛门和口咽）oHPV通过宫颈鳞腺交界处感染基底细胞o或HPV通过微创伤直接感染基底细胞oo临床治疗需要破坏移行带，而不仅仅是病临床治疗需要破坏移行带，而不仅仅是病变本身变本身HPV 检测及预后预测价值o阴性预测价值(NPV)约 99%nwomen not infected with HR-HPV have 1% chance to have HSIL lesiono阳性预测价值(PPV) 根据患者的年龄:n30: PPV gradually increased with age and persistent HPV infection原为杂交法o用标记的HPV探针在组织上或细胞上进行原位的杂交，并进行显色o特异性最强o敏感性高o直观o可结合组织学或细胞学形态o探针有：6/11, 16/18, 31/33导流杂交法o扩增所取样本的DNAo放在固定好基因探针的基因芯片上（21种亚型包括13种高危亚型16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,68及5种低危亚型6, 11, 42, 43,44和3种中国人群常见的亚型53,66,CP8304型进行杂交o探针标记Biotin及碱磷酶o用NBT/BCIP进行显色o结果呈蓝紫色o判定标准判定标准RLU/CutoffRLU/Cutoff的比值的比值 n 1 = 1 = 阳性阳性, 50, 50以内的数值对病情的严重程度并没有指示性，以内的数值对病情的严重程度并没有指示性，但但5050的数值对病情的严重程度的估计有指导意义。的数值对病情的严重程度的估计有指导意义。n 1 = 1 =阴性，表示未检出阴性，表示未检出1313种高危型种高危型HPV DNAHPV DNA序列或标本中不含序列或标本中不含有高危型有高危型HPV DNAHPV DNA序列，又或者其浓度水平在测定方法的检测限序列，又或者其浓度水平在测定方法的检测限度以下，不能除外潜伏感染；度以下，不能除外潜伏感染；n如果接近但小于如果接近但小于1.01.0且被怀疑有高危型且被怀疑有高危型HPVHPV感染，应该重新采集标感染，应该重新采集标本。本。 HC-II的应用条件oHPV test 不适用的情况：n细胞学显示异型增生时n年龄30岁的女性,细胞学检查结合HPV testHPV检测方法的比较原位杂交导流杂交基因捕获HC-II原理在原位进行HPV DNA的杂交提取DNA进行PCR，进行膜杂交DNA分解，DNA-RNA杂交，抗体捕获，特点组织学及细胞学涂片上原位显示分型HPV具体分型显示HPV,无病毒负荷的提示只显示高危病毒感染，不具体分型，可提示病毒的负荷敏感性及特异性敏感性+特异性+敏感性+特异性+敏感性+特异性+取材组织或细胞涂片阴道分泌物阴道分泌物生物传感器技术o24种HPV亚型，其中低危8种（ 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 70 ），高危16种（ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 ,81 ）o可检测HPV的载量o子宫颈细胞中HPV的情况 单独感染 混合感染（2、3，6种HPV型）子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染HPV检出率1(导流杂交）病毒种类1HR-HPV检出率2（HC-II)尖锐湿疣92%6,11,31,52低级别CIN89%16,31,18,52,33,6,1174.93%高级别CIN100%16,33,52,1891.72%鳞状上皮增生33%6,11,16,1843.29%1.北京军区总医院病理科2.解放军总医院妇产科CIN中需注意的问题oCIN病变也可表现为鳞状上皮的表面上皮显著的不典型增生，而非基底层细胞，是CINI的病理基础oCIN病变累及腺体n一般：鳞状上皮CINIII，进一步向下发展延伸至腺体，但未突破基底膜n少数：鳞状上皮CINII，腺体鳞化也呈CINII，这时为表达腺体的改变，诊断为CINII累及腺体n个别：在腺体鳞化的基础上出现不典型增生，甚至出现的不典型增生的程度超过表面鳞状上皮绝大多数的HPV感染可回退SpontaneousSpontaneousregressionregressionSpontaneousSpontaneousregressionregressionCancerHigh-grade High-grade dysplasiadysplasiaLow-grade dysplasiaLow-grade dysplasiaSubclinical HPV infectionSubclinical HPV infectionUS CasesUS Cases300,000300,00011,00011,0001,400,0001,400,00030,000,00030,000,000 HPV infectionHPV infectionCervical CancerCervical CancerSpontaneousSpontaneousSpontaneousSpontaneous regression regression regression regression持续性HPV感染导致CIN2-3 oLSIL LSIL 一般由瞬间一般由瞬间HPVHPV感染引起感染引起oHSIL HSIL 发生在那些持续性发生在那些持续性HR-HPVHR-HPV感染感染2 2年以上的年以上的患者患者o大多数年轻的女性大多数年轻的女性(30 yrs)(30 yrs)的的HPVHPV感染为暂时感染为暂时性的，将被自体免疫系统清除性的，将被自体免疫系统清除oHPVHPV持续性感染一般发生在老年女性持续性感染一般发生在老年女性HPV感染与机体免疫反应o阴道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗体，酸性环境及锌离子等组成第一道防线o子宫颈鳞状上皮（复层上皮）形成天然屏障，组成第二道防线o内在的非特异性免疫防御系统即炎症反应，构成第三道防线o局部的细胞免疫监视，可启动接触性级连反应，放大传递信号，形成针对壳蛋白L1的特异性细胞免疫反应o大多数的HPV感染细胞将成为HPVL1抗原递呈细胞；细胞毒T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞可识别此细胞，并通过免疫监视和免疫清除杀灭细胞CytoReacto用敏感的非同位素核酸杂交和免疫组织化学及免疫细胞化学的方法检测子宫颈细胞中HPV L1 蛋白的存在，可用于细胞学涂片，组织学切片的检测。o广谱的HPV L1抗体可识别大多数的HPV L1蛋白（ 6, 11, 16, 18, 31, 33, 42, 51, 52, 56，58）。 基本原理特点o多聚物微球结合非同位素标记HPVL1DNA探针与多聚酶混合物（固态杂交液）o解链及杂交过程与抗原修复过程合并o标记物为碱性磷酸酶，底物为AECo原为杂交与免疫组化反应颜色重叠，提高敏感性20-30倍o可检测出0.01pgHPV L1蛋白o细胞核阳性表达（核膜及核）oHPV L1HPV L1的存在表明的存在表明HPVHPV病毒感染处于游离状病毒感染处于游离状态或瞬时感染期态或瞬时感染期ooHPV L1阳性与异常细胞学的回退密切相关o在在 HPV(+) HPV(+) 的病人中，的病人中，HPV L1HPV L1的缺失，提示的缺失，提示存在存在HPVHPV的持续感染，并有向高级别的持续感染，并有向高级别CINCIN发展发展的趋势的趋势oo特别有意义的是，在HR-HPV(+)的病人中，HPV L1阳性提示HPV以游离状态存在，发生高级别CIN的机率极低HPV L1检测的临床意义 p16检测的意义op16是cyclin依赖性激酶抑制剂，抑癌基因，可抑制CDK4、CDK6活性，降低RB的磷酸化，增强RB的功能，抑制E2F-1的释放，从而抑制细胞周期oE7结合RB，释放E2F-1，促使细胞周期oE2F-1的聚集（RB的磷酸化的结果）导致p16的增加op16的高表达提示HPVE7的存在小小 结结ooCINCIN的发生及发展与的发生及发展与HPVHPV的感染直接相关的感染直接相关n nHPV CINHPV CINHPV CINHPV CINn nCIN = HPVCIN = HPVCIN = HPVCIN = HPVooCINCIN分为：分为：CIN ICIN I、IIII、IIIIII；TBSTBS：Ascus, LSILAscus, LSIL，HSILHSILo临床常用的HPV检测方法（HC-II，导流杂交）n阴道小环境的HPV感染状况n间接代表子宫颈HPV感染状况n不知HPV的生物学存在状况o生物传感仪检测子宫颈组织和细胞中的HPV类型oTERC基因扩增表明细胞的增殖活性增强，提示病变向恶性发展的原动力存在op16的检测可提示HR-HPV感染，并整合宿主DNAo子宫颈组织和细胞中HPV L1检测阳性，提示机体免疫可清除HPV病毒感染细胞，使CIN病变向良性发展u液基薄层细胞制片技术n真空负压吸引，膜式采集技术n重力沉降技术n离心沉降技术n其他u特点：n标本保存时间长，更完整，结构更清晰n细胞数量更多n细胞平铺，不重叠n更利于观察，不易漏观察n可重复制片u应用范围：1.子宫颈细胞学检查2.体液细胞学检查（胸腔积液、腹腔积液、尿液、脑脊液及灌洗液等）3.分泌物细胞学检查（痰液）u优势：明显提高阳性细胞检出率u前提：具备丰富诊断经验的病理医师是关键国外细胞学医师需要获得医师资格证、病理医师资格证以后，再经过2-3年的专科培训才能从事细胞学诊断，并担负相应法律责任国内正在规范，从事细胞学诊断必须有医师资格证并注册到病理诊断o1988年，美国国家癌症研究所在马利兰州的Bethesda召开了病理细胞学会议，提出子宫颈细胞学报告的新分类，即Bethesda报告系统（The Bethesda System,TBS）The Bethesda system for Reporting Cervical Cytology(TBS)o根据根据20012001年第三届国际年第三届国际BethesdaBethesda工作会议要求工作会议要求o由著名细胞病理学家由著名细胞病理学家SolomonSolomon和和NayarNayar编著编著o是目前有关子宫颈细胞学分类和诊断标准中最新，最权威的是目前有关子宫颈细胞学分类和诊断标准中最新，最权威的o该系统的该系统的3 3个基本原则：个基本原则：n在不同病理学家及病理科必须是统一的，可重复的，并富有灵活性在不同病理学家及病理科必须是统一的，可重复的，并富有灵活性n能反映对子宫颈肿瘤的最新认识能反映对子宫颈肿瘤的最新认识n能将病理的有关临床信息传递给患者能将病理的有关临床信息传递给患者oTBS的改变是基于临床的进展和对宫颈癌生物学行为研究的进展o废弃“诊断(diagnosis)”，而使用“判读(interpretation)”或“结果(result)”一词o病人的最终诊断及处理方案不仅依靠细胞学结果，还需整合病史、临床发现及其他实验室结果（ASCUS,HSIL)o细胞学结果只是代表形成最终诊断的一个重要因素子宫颈细胞学诊断标准的变迁o20世纪40年代初，巴氏创建了子宫颈细胞学检查方法并提出巴氏分级报告系统(以癌为中心)o20世纪50-70年代，认识了原位癌和不典型增生，并分为轻、中、重o20世纪70年代，Richart提出子宫颈上皮内瘤变(CIN)，认为不典型增生的细胞在本质上与原位癌的细胞无差异，是同一疾病过程在上皮内连续的、不同程度的病变，两者有共同的病因、生物学特征和自然病程，具有演变为癌的潜能，为浸润癌的前期病变。TBS的问题oTBS与TCT的关系？oAUS-US的发现率？oHPV，滴虫及霉菌检出阳性率低？HPV L1HPV Cytology TestHPVPrecancerCancer 子宫颈癌的预防策略Currently:Future?HPV DNA Test VaccineCytology Test谢谢！谢谢！