目标导航预习导引1.能进行PCR技术的基本操作。2.能记住PCR的原理。3.能说出PCR的应用。目标导航预习导引一二三四五一、PCR原理1.细胞内DNA复制所需基本条件DNA分子能准确复制的原因有哪些?提示:DNA双螺旋结构提供模板;碱基互补配对。目标导航预习导引一二三四五2.子链延伸的方向(1)DNA的两条链是反向平行的,通常将DNA的羟基末端称为3端,而将磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3端延伸DNA链,因此,DNA复制需要引物。(2)DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。3.DNA分子复制的人工控制(1)双链的解开是进行DNA复制的前提。在体外可通过控制温度来实现。在80100的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。(2)当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链,称为复性。目标导航预习导引一二三四五(3)PCR利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。(4)由于PCR过程的温度高,会导致普通的DNA聚合酶失活,后来耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用,大大增加了PCR的效率。(5)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行,需提供:DNA模板,分别与两条模板链相结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。二、PCR的反应过程1.PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。2.在循环之前,常要进行一次预变性,以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。3.过程(1)变性:在温度上升到90以上时,双链DNA解聚为单链。(2)复性:当温度下降到50左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸:当温度上升到72左右时,合成新的DNA链。4.从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合,进行DNA的延伸,这样,DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。目标导航预习导引一二三四五目标导航预习导引一二三四五三、实验操作在PCR实验中,通常要用到微量离心管。具体操作时,用微量移液器依次加入各种组分。目标导航预习导引一二三四五四、实验注意事项1.为避免外源DNA等因素的污染,所用仪器、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。2.缓冲液和酶应分装成小份,并在-20储存。3.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种成分后,移液器上的枪头都必须更换。所有成分加入后盖严离心管口的盖子。4.混匀后要离心处理,使反应液集中在离心管底部,再放入PCR仪中进行反应。你知道乙肝病毒基因诊断盒所需的大量乙肝病毒基因是怎样获得的吗?提示:采用PCR技术对乙肝病毒基因进行迅速扩增产生的。目标导航预习导引一二三四五五、DNA含量的测定1.理论上DNA扩增呈指数增长,即一条DNA片段循环n次后产物DNA的数目为2n,但实际可能会有诸多因素影响DNA含量,所以需要对DNA含量进行测定。2.DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA的含量有关,可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。知识梳理典例透析比较细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)知识梳理典例透析知识梳理典例透析题型一题型二题型一 PCR的原理及应用【例题1】下列关于PCR的描述,不正确的是()A.PCR技术的原理是DNA复制B.PCR是一酶促反应,需耐高温的解旋酶和DNA聚合酶C.一个DNA片段经PCR扩增,理论上可以形成2n个DNA片段(n代表循环次数)D.PCR利用了DNA的热变性来控制DNA的解聚与结合解析:PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,以极少量的DNA为模板,DNA聚合酶从引物的3端连接脱氧核苷酸,短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝。PCR利用DNA的热变性原理来解旋,不需要解旋酶。答案:B知识梳理典例透析题型一题型二反思领悟DNA复制时要解螺旋,细胞内DNA的解旋需要解旋酶催化,而体外DNA复制时一般是加热解旋。知识梳理典例透析题型一题型二题型二 PCR技术操作【例题2】下列有关PCR操作过程的叙述,错误的是()A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20储存C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换解析:为了防止外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌;所用的缓冲液及酶应分装成小份保存,并使用一次性枪头,即A、B、D三项均正确;PCR所用的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化,而不能迅速融化,C项错误。答案:C