细胞工程 番茄与马铃薯同是茄科植物，但不是同属番茄与马铃薯同是茄科植物，但不是同属的植物。番茄的果实和马铃薯的块茎是我们的植物。番茄的果实和马铃薯的块茎是我们经常食用的蔬菜。马铃薯的块茎生长在土壤经常食用的蔬菜。马铃薯的块茎生长在土壤中。中。 人们曾经有这样一个幻想：让一株植株人们曾经有这样一个幻想：让一株植株地上部分结番茄，地下部分长土豆。这个幻地上部分结番茄，地下部分长土豆。这个幻想可能实现吗？想可能实现吗？一、细胞工程的概念 细胞工程是指应用细胞生物学和分子细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的生物学的原理和方法原理和方法，通过，通过细胞水平或细细胞水平或细胞器水平胞器水平上的操作，按照人们的意愿来上的操作，按照人们的意愿来改改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一的一门综门综合科学技术。合科学技术。细细胞胞工工程程应用的原理和方法应用的原理和方法细胞生物学和细胞生物学和分子生物学分子生物学细胞水平或细胞器水平细胞水平或细胞器水平 按照人们的意愿来按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品或获得细胞产品概念概念分类分类植物细胞工程植物细胞工程研究的目的研究的目的研究的水平研究的水平动物细胞工程动物细胞工程前者前者是是细细胞水平胞水平或或细细胞器水平胞器水平上生物技术上生物技术, ,后者后者是是分子水平分子水平上的生物技术。上的生物技术。克隆多莉羊技术是克隆多莉羊技术是 水平上的技术水平上的技术 培育抗虫棉是培育抗虫棉是 水平上的技术。水平上的技术。细胞工程与基因工程相比：细胞工程与基因工程相比：细胞细胞分子分子思考思考: : 为什么植物的一个花瓣能培养为什么植物的一个花瓣能培养出完整的植株呢？出完整的植株呢？细胞具有全能性细胞具有全能性1 1、定义：、定义： 具有某种生物具有某种生物全部遗传信息全部遗传信息的的任何一个任何一个细胞细胞，都具有，都具有发育成完整生物体发育成完整生物体的潜能。的潜能。 2 2、原理：、原理： 生物体的任何一个细胞都包含有该物种生物体的任何一个细胞都包含有该物种 所特有的所特有的全套遗传物质全套遗传物质，都有发育成为，都有发育成为 完整个体所必需的全部基因，从理论上完整个体所必需的全部基因，从理论上 讲，生物体的每一个活细胞都应该具有讲，生物体的每一个活细胞都应该具有 全能性。全能性。 3 3、大小：、大小： 二、细胞的全能性受精卵受精卵生殖细胞生殖细胞体细胞体细胞植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞二、细胞的全能性 当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于而处于离体状态离体状态时，在时，在一定的营养物质、激素和其他一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。整的植株。 在生物的个体发育中，由于基因在特定时在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，此，要实现细胞的全能性，首先首先必须使生物体必须使生物体的细胞处于的细胞处于离体状态离体状态。 为什么生物体内的细胞没表现全能性，而为什么生物体内的细胞没表现全能性，而是分化成不同的组织或器官呢？是分化成不同的组织或器官呢？基因选择性表达的结果基因选择性表达的结果植物细胞表现全能性的必要条件：离体培养离体培养提供营养物质、激素及其他适宜条件提供营养物质、激素及其他适宜条件那么要如何把植物的一个花瓣培育成那么要如何把植物的一个花瓣培育成完整的植株呢？完整的植株呢？植物的组织培养植物的组织培养1 1、实验原理：、实验原理：离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞一定的营养物质、激一定的营养物质、激素素脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织再分化再分化含有含有不同激素不同激素的分化培养基的分化培养基胚状体或丛芽胚状体或丛芽试管苗试管苗外植体外植体：从活植物体：从活植物体上切下进行培养的那上切下进行培养的那部分组织或器官部分组织或器官三、植物的组织培养三、植物的组织培养植物组织培养的条件：植物组织培养的条件：适宜的适宜的养料养料( (无机盐、水、无机盐、水、蔗糖等）和激素，适宜的蔗糖等）和激素，适宜的温度温度和和无菌无菌条件条件植物组织培养的培养基定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基质定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基质无机营养成分无机营养成分：C C、H H、O O大量元素及部分微量元素大量元素及部分微量元素有机营养成分有机营养成分 ： 含含N N物质：包括维生素和氨基酸物质：包括维生素和氨基酸 碳源：碳源：2%2%5%5%的蔗糖的蔗糖 琼脂：用于凝固形成固体培养基琼脂：用于凝固形成固体培养基 激素：生长素和细胞分裂素激素：生长素和细胞分裂素 PH PH值：值：5.05.06.06.02 2、实验流程、实验流程 P34 P34实验实验制备外植体制备外植体接种接种脱分化培养脱分化培养再分化培养再分化培养试管苗试管苗正常植株正常植株实验关键：实验关键：（1 1）全程）全程无菌操作无菌操作（包括接种用具、接（包括接种用具、接种环境、接种材料、接种过程、培养过种环境、接种材料、接种过程、培养过程）。程）。（2 2）取材：应选择含）取材：应选择含形成层形成层的部分，易的部分，易诱导形成愈伤组织。诱导形成愈伤组织。（3 3）植物激素的）植物激素的比例适当比例适当。试管苗大规模培养试管苗大规模培养植物组织培养的概念： 植物组织培养就是在植物组织培养就是在无菌和人工控无菌和人工控制制条件下，将条件下，将离体离体的植物器官、组织、的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给细胞，培养在人工配制的培养基上，给予予适宜的培养条件适宜的培养条件，诱导其产生，诱导其产生愈伤组愈伤组织、丛芽织、丛芽，最终形成，最终形成完整的植株完整的植株。因为不同种生物之间存在因为不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能的有性杂交方法是不可能做到这一点的。做到这一点的。 于是，科学家试图用这两种植物的体于是，科学家试图用这两种植物的体细胞进行杂交，来实现这一美妙的设想。细胞进行杂交，来实现这一美妙的设想。 这幅番茄这幅番茄马铃薯图马铃薯图利用传统有性杂交方法能利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？实现吗？为什么？理想图理想图 19721972年卡尔森等通过两个烟草品种之间年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。 1978 1978年梅尔彻斯年梅尔彻斯(Melchers)(Melchers)等首次获得等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种“马铃薯番茄马铃薯番茄”。 植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术1 1、概念、概念 将不同种的植将不同种的植物体细胞，在一定物体细胞，在一定条件下融合成条件下融合成杂种杂种细胞细胞，并把杂种细，并把杂种细胞培育成新的植物胞培育成新的植物体的技术。体的技术。 四、植物体细胞杂交技术四、植物体细胞杂交技术杂杂种种植植株株融合融合的原的原生质生质体体ABAB再再生生出出细细胞胞壁壁脱脱分分化化愈愈伤伤组组织织再再分分化化2 2、过程、过程植物细胞的融合植物细胞的融合植物组织培养植物组织培养植物细胞植物细胞A A原生质体原生质体B B原生质体原生质体A A杂杂种种细细胞胞ABAB去去 壁壁去去 壁壁人人工工诱诱导导融合完成融合完成的标志的标志植物细胞植物细胞B B 四、植物体细胞杂交技术四、植物体细胞杂交技术植物植物A A细胞细胞植物植物B B细胞细胞去壁去壁原生质体原生质体A A原生质体原生质体B B原生质体融合原生质体融合融合体融合体再再 生生 壁壁杂种细胞杂种细胞脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株去壁的常用方法：去壁的常用方法：酶解法（酶解法（纤维素酶、果胶酶纤维素酶、果胶酶等）等） 原生质体融合原生质体融合 方法：方法：物理法：离心、振动、电刺激等物理法：离心、振动、电刺激等 化学法：聚乙二醇（化学法：聚乙二醇（PEGPEG） 过程：原生质体融合过程：原生质体融合 + + 组织培养组织培养再分化再分化 融合的细胞中，两两融合的细胞有几融合的细胞中，两两融合的细胞有几种？对融合的细胞如何处理得到所需杂交种？对融合的细胞如何处理得到所需杂交细胞。细胞。3 3种（种（AA,AB,BBAA,AB,BB）；需进行筛选。）；需进行筛选。4 4、意义（与传统有性杂交相比）：、意义（与传统有性杂交相比）： 克服了克服了不同种生物远缘杂交不亲和不同种生物远缘杂交不亲和的的障碍；打破了物种之间的生殖隔离；扩大障碍；打破了物种之间的生殖隔离；扩大了遗传重组范围。了遗传重组范围。3 3、原理：、原理： 细胞膜的流动性；植物细胞全能性细胞膜的流动性；植物细胞全能性思考与探究1 1、为什么、为什么“番茄番茄马铃薯马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？主要原因是：主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃，所以马铃薯薯番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互遗传物质的表达受到相互干扰，干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。地下结马铃薯就是很自然的了。 白菜白菜白菜白菜“白菜甘蓝白菜甘蓝”同普通白菜相比，具有生长期短、同普通白菜相比，具有生长期短、耐热性强和易于贮藏等优点。耐热性强和易于贮藏等优点。紫甘蓝紫甘蓝思考：白菜、甘蓝是二倍体，那么获得的思考：白菜、甘蓝是二倍体，那么获得的白菜白菜甘蓝是几倍体？甘蓝是几倍体？四倍体四倍体白菜甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝 若若A A含有含有2N2N条染色体，条染色体，2 2个染色体组，基个染色体组，基因型为因型为AabbAabb，B B含有含有2M2M条染色体，条染色体，2 2个染色个染色体组，基因型为体组，基因型为ccDdccDd，则新植株应为四倍，则新植株应为四倍体，其体细胞中染色体数为体，其体细胞中染色体数为2N+2M,2N+2M,基因型基因型为为AabbccDdAabbccDd。所采用技术所采用技术的理论基础的理论基础 植植物物细细胞胞工工程程通通常常采采用用的的技技 术术 手手 段段 植物组织培养植物组织培养 植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物细胞的全能性植物细胞的全能性小结小结比较植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术所属所属范畴范畴原理原理步骤步骤意义意义联系联系无性繁殖无性繁殖细胞全能性细胞全能性脱分化脱分化再分化再分化保持优良性状；繁殖保持优良性状；繁殖速度快、大规模生产；速度快、大规模生产；提高经济效益提高经济效益杂交技术应用了组织培养杂交技术应用了组织培养克服不同种生物远源克服不同种生物远源杂交的障碍杂交的障碍去除细胞壁去除细胞壁融合形成杂种细胞融合形成杂种细胞组织培养组织培养细胞膜流动性细胞膜流动性细胞全能性细胞全能性染色体变异、基因重组染色体变异、基因重组动物细胞工程动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体制备单克隆抗体制备动物体细胞动物体细胞核移植技术和克隆动物核移植技术和克隆动物动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植核移植动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术其它动物细胞工程的基础其它动物细胞工程的基础一、动物细胞培养的应用和概念：一、动物细胞培养的应用和概念：1 1、概念：、概念：动物细胞培养动物细胞培养就是从动物有机体中取就是从动物有机体中取出相关的出相关的组织组织, ,将它分散将它分散成成单个细胞单个细胞, ,然后然后, ,放在放在适宜的适宜的培养基培养基中中, ,让这些让这些细胞生长和增殖细胞生长和增殖. .2、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖定义：定义：人们通常将人们通常将动物组织动物组织消化后消化后的的初次培养初次培养称为原代称为原代培养。培养。胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理取出组织取出组织胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎剪碎单个细胞单个细胞细胞悬液细胞悬液转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长贴壁生长长成单层细胞。长成单层细胞。有有接触抑制接触抑制现象）现象）。原代培养原代培养3 3：过程：过程图示图示原代培养原代培养强调一：细胞贴壁过程强调一：细胞贴壁过程细胞贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、表面光滑、无毒、 易于贴附。易于贴附。当贴壁细胞分裂生长到当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时表面相互接触时, ,细胞就细胞就会停止分裂增殖，这种现会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制强调二：接触抑制 定义：定义： 当原代培养的细胞处于当原代培养的细胞处于接触抑制后接触抑制后, , 用用胰蛋白酶胰蛋白酶处处理理, ,使细胞从瓶壁上使细胞从瓶壁上脱离脱离下来下来, ,然后加入新的培养液然后加入新的培养液, ,将将细胞分离稀释细胞分离稀释, ,并并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内从原培养瓶内转接到新的培养瓶内, ,这这个过程称个过程称传代培养传代培养. .（分瓶培养的过程分瓶培养的过程）传代培养传代培养细胞株：传代细胞一般能传到细胞株：传代细胞一般能传到40-5040-50代，代，遗传物质一般不会发生改变遗传物质一般不会发生改变，叫细，叫细胞株。胞株。细胞系、细胞株（细胞系、细胞株（了解即可了解即可）细胞系：传代细胞系：传代5050代以后不能再传下代以后不能再传下去，部分细胞去，部分细胞遗传物质发生了改变遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。能连续传代，获得不死性，叫细胞系。3 3、总结：动物细胞、总结：动物细胞培养过程培养过程动物胚胎或幼龄动物的动物胚胎或幼龄动物的组织、器官组织、器官配置细胞悬液配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理剪碎用胰蛋白酶处理1010代细胞代细胞转入培养瓶转入培养瓶40-5040-50代细胞代细胞传传代代培培养养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液稀释加培养液稀释传代传代1010代以内，代以内，遗传物质不改变，遗传物质不改变，保持保持正常正常二倍体核型二倍体核型。传代传代10-5010-50代左右，增长缓慢以代左右，增长缓慢以至于完全停止，至于完全停止，部分细胞核型可部分细胞核型可能发生变化能发生变化（遗传物质可能改变（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？为什么用胰蛋白酶处理？分瓶分瓶传代培养传代培养原代培养特点：原代培养特点：细胞贴壁、细胞贴壁、接触抑制接触抑制继续传代培养少部分细胞继续传代培养少部分细胞获得不获得不死性死性，细胞突变细胞突变，遗传物质已经遗传物质已经改变改变，等同于癌细胞等同于癌细胞。细细胞胞株株：一一般般说说遗遗传传物物质质未未改改变变细细胞胞系系：遗遗传传物物质质已已改改变变原原代代培培养养4.4.动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件: :1 1）无菌无毒）无菌无毒 的环境：的环境： 适宜的温度：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为人和哺乳动物细胞最适温度为36.50.5。适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4液体合成培养基：（液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）因子、（水、无机盐、微量元素）等；通等；通常还需加入常还需加入血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。4 4）气体环境：）气体环境：2 2）营养：）营养：3 3）温度和）温度和pHpH：“95空气空气+5CO2”的混合气体培养箱。的混合气体培养箱。氧氧气是细胞代谢必须的；气是细胞代谢必须的； CO2维持培养维持培养液的液的PHPH。对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理；无菌处理；培养液培养液中中添加抗生素添加抗生素防止培养过程中污染；防止培养过程中污染；定期更定期更换培养液换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。造成危害。问题问题3 3：为什么用胰蛋白酶处理？：为什么用胰蛋白酶处理？问题问题1 1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题问题2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。 问题问题4 4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适动物细胞培养的最适PH值为值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适，胰蛋白酶作用的适宜宜PH为为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜，胃蛋白酶适宜PH为为2.胃蛋白酶在胃蛋白酶在PH为为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。的动物细胞培养中无活性。问题问题5 5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。问题问题6 6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？组培培养基有何独特之处？问题问题7 7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？终培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。维生素和动物血清等。独特之处有：独特之处有：1 1、液体培养基、液体培养基 2 2、成分中有动物血清等、成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体不能发育成新的动物个体问题问题8 8、动物细胞培养的原理：、动物细胞培养的原理： 细胞增殖。细胞增殖。问题问题9 9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在1010代以内，为什么？代以内，为什么？1010代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。5.5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用: :1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞3.3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.4.细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 细胞的全能性细胞的全能性细胞或细胞产物细胞或细胞产物新个体或细胞产物新个体或细胞产物培养结果培养结果获得细胞获得细胞或或细胞产物细胞产物快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：定义： 动物核移植是将动物的动物核移植是将动物的一个细胞一个细胞的细胞核的细胞核, ,移入一个已经移入一个已经去掉细胞核的卵母去掉细胞核的卵母细胞中细胞中. .使其重组并发育成一个使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎, ,这这个新的胚胎最终发育为个新的胚胎最终发育为动物个体动物个体. .3、分类：分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程度低，恢复其全度低，恢复其全能性相对容易。能性相对容易。动物体细胞分化动物体细胞分化程度高，恢复其程度高，恢复其全能性十分困难全能性十分困难2、原理：原理： 动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性4、体细胞核移植过程、体细胞核移植过程-示动物克隆示动物克隆-无性繁殖无性繁殖1.）克隆羊多）克隆羊多利培育过程：利培育过程：黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎胚胎移植胚胎移植另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利注意：注意：克隆动物性状克隆动物性状与供体动物完全一样吗？与供体动物完全一样吗？不完全一样！不完全一样！因为：因为：一、供体动物只提供细胞核，一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如而细胞质中的遗传物质（如线粒体线粒体DNA）来自于受体卵）来自于受体卵母细胞母细胞.二、生物的性状不仅与遗传二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。物质有关，还受环境的影响。供体供体受体受体代孕代孕受体受体黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核a重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利1、写出、写出ab所代表细胞工程名称：所代表细胞工程名称：a表示：表示： b表示表示: 2、实施细胞工程时，所、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：母细胞的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。表达全能性的物质和营养条件。3 3、多利面部毛色是：、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。根据遗传学原理说明判断依据。4 4、若黑面绵羊的基因型为、若黑面绵羊的基因型为AA,AA,白白面绵羊的基因型为面绵羊的基因型为aaaa，则克隆羊，则克隆羊的基因型为的基因型为 核移植核移植胚胎移植胚胎移植白色白色多利全部的核基因都来自白面绵羊多利全部的核基因都来自白面绵羊aa 取供体细胞取供体细胞传代培养传代培养1010代代以内的细胞以内的细胞. .为什么？为什么？用的是去用的是去核的减数核的减数第二次分第二次分裂中期细裂中期细胞（胞（M中中期期）为什）为什么？么？激活方法：激活方法：激活目的：激活目的：促融方法：促融方法：电刺激电刺激胚胎移植至胚胎移植至代孕受体内代孕受体内 妊娠、分娩妊娠、分娩2.）核移植流程）核移植流程供体：优质高产奶牛供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）母细胞的采集与培养） 1.体积大，易体积大，易操作。操作。2.含有含有促使细胞核表促使细胞核表达全能性的物达全能性的物质和营养条件。质和营养条件。4.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景1. 1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白2. 2.改良动物品种改良动物品种 3. 3.治疗人类疾病，作为供体治疗人类疾病，作为供体4. 4.更深入了解胚胎发育及衰老过程更深入了解胚胎发育及衰老过程看书看书P49-50页页5.体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题1、克隆技、克隆技术本身本身还不成熟，成功率低；不成熟，成功率低；2、克隆胚胎、克隆胚胎经常出常出现遗传发育育问题； 许多克隆多克隆动物表物表现出出遗传和生理缺陷，和生理缺陷，如体型如体型过大，异常肥胖，大，异常肥胖，发育困育困难，脏器缺陷，免疫失器缺陷，免疫失调等。等。3、克隆人的社会、克隆人的社会伦理理问题；1 1、定义：、定义：两个或多个不同的细胞融合成一个细两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。胞的过程。一、动物细胞融合一、动物细胞融合杂交细胞：杂交细胞：融合后形成的具有原融合后形成的具有原来来两个或多个细胞遗传信息两个或多个细胞遗传信息的的单单核细胞核细胞成为杂交细胞成为杂交细胞。动物细胞融合2、诱导融合的因素诱导融合的因素生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒诱导融合诱导融合. .( (利用灭活仙台病毒是动物细利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。胞融合所特有的。) ) 化学法：化学法：聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG诱导融合诱导融合. . 物理法：物理法：电激电激融合融合病毒颗粒黏病毒颗粒黏 附细胞表面附细胞表面细胞膜连接细胞膜连接细胞膜被细胞膜被 病毒颗粒穿通病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂种细胞3、动物细胞融合技术的应用细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。为可能。利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。人们获得抗体的传统方法是人们获得抗体的传统方法是? ?将抗原注入动物体将抗原注入动物体, ,然后从动物血清中提取抗体然后从动物血清中提取抗体这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么? ?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？能否用单个能否用单个B B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？抗体呢？B B淋巴细胞在体外不能无限增殖。淋巴细胞在体外不能无限增殖。二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备思考思考单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备极富创造性的方案极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的将能够产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增和具有无限增殖能力的殖能力的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。米尔斯坦米尔斯坦( (英国英国) )和科勒和科勒( (德国德国) )因此在因此在19841984年获诺贝尔年获诺贝尔奖。奖。杂交杂交杂交杂交 细胞细胞细胞细胞灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞经免疫经免疫经免疫经免疫的小鼠的小鼠的小鼠的小鼠提取提取杂交瘤杂交瘤杂交瘤杂交瘤细胞细胞细胞细胞第一次筛选第一次筛选第一次筛选第一次筛选用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基第二次筛选第二次筛选第二次筛选第二次筛选能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养体外培养体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体1.1.动物特异性免疫动物特异性免疫2.2.分离分离B淋巴细胞（淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意）。注意B淋巴细淋巴细胞是一个系列。（胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）3.3.细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式:（BB;BG;GG）4.4.第一次筛选：在第一次筛选：在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞（只有（只有BG杂交瘤细胞存活。但杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：杂交瘤细胞也是一个系列：如如B1G,B2G-BnG。而。而BB,GG在此培养基上不能存活。）在此培养基上不能存活。）5.5.第二次筛选：在第二次筛选：在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列 ，每孔每孔只放一个杂交瘤细胞。只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进每个杂交瘤细胞，并进行行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是所需要的杂交的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。瘤细胞。6.6.选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射到或注射到小鼠腹腔小鼠腹腔内增殖内增殖。7.7.提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：、单抗的制备过程要点：3 3 3 3）、为何要进行两次筛选？）、为何要进行两次筛选？）、为何要进行两次筛选？）、为何要进行两次筛选？4 4）、如何进行第）、如何进行第2 2次筛选？次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第第1 1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2 2次筛选得次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：问题强化：1 1）、本过程利用了哪些原理？）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有不仅具有B B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体本领，因而可以获得大量单克隆抗体1、作为诊断试剂作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等体内肿瘤的定位等, ,与常规抗体相比与常规抗体相比, ,具有具有准确、高效、准确、高效、简易、快速简易、快速特点特点.2、用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗。主要用于癌症治疗。生物导弹：生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体抗癌细胞的单克隆抗体+ +放射性同位素放射性同位素+ +化学化学药物或细胞毒素药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）胞位置，原位杀死癌细胞。）2 2、单克隆抗体的优点：、单克隆抗体的优点： 特异性强，灵敏度高，可大量制备。特异性强，灵敏度高，可大量制备。3 3 3 3、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用