第十一章 基因治疗广义的基因治疗目前是指体细胞基因治疗，即把具有防治潜能的外源基因（目的基因）通过合适载体，转移到患者的有关器官组织的细胞中，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗方案的内容，一般包括目的基因的选择和制备、靶细胞的选择、基因转移、目的基因的表达调控、治疗效果的评价等。基因治疗的策略包括基因修正、基因修补、基因添加、基因替代、基因失活五大类型。第一节 基因治疗的发展及研究概况1967年，Nirenberg首先提出基因工程可用于人类疾病治疗的设想。1981年Cline对2名重症-地中海贫血患者进行了基因治疗，但未成功。1990年9月，美国国立卫生研究院研究人员FterchAnderson和MichaelBlease，将腺苷酰脱氨酶基因转移到一个4岁小女孩的淋巴细胞内。第二节 基因诊断与基因治疗基因诊断(Genediagnosis)又称DNA诊断或DNA探针技术或基因探针技术，是以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常,从而达到诊断疾病的一种方法。基因诊断的途径和方法基因诊断的途径和方法基因诊断的主要途径包括异常基因的直接检测和间接检测（基因连锁分析）两类。异常基因以及序列的直接检测：1.异常基因的缺失、插入、重排,以及短串连重复顺序的重复数量，在这些情况下，DNA的变化较大，常可用Southern印迹杂交方法或PCR方法进行检测。(1)Southern印迹杂交用于基因探测的基本过程印迹杂交用于基因探测的基本过程Southern印印迹迹杂杂交交常常用用于于探探测测DNA的的限限制制性性内内切切酶酶图图谱谱。通通过过检检测测某某个个体体特特定定基基因因及及旁旁侧侧区区域域限限制制性性内内切切酶酶图图谱谱的的变变化化，可可判判断断是是否否发发生生了了明明显显的的DNA重重排排。具具体体方方法法图示如下图示如下：组织或细胞含已知基因的重组质粒菌株基因组DNA质粒DNA限制酶酶解及电泳分离限制酶酶解及电泳分离回收含已知基因的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜标记的探针预杂交杂交洗膜放射自显影图图用用Southern印迹杂交方法进行基因诊断的基本步骤印迹杂交方法进行基因诊断的基本步骤（2）聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）聚合酶链反应(polymerasechainreactionPCR)或称体外扩增，是一个使用两个特异的寡聚核苷酸引物在体外酶促合成特异DNA顺序的方法。基本的PCR反应体系包含：模板DNA、引物、DNA聚合酶、4种dNTP、Mg+2和缓冲液。引物是根据需扩增的DNA片段两端的序列设计并人工合成的，分别位于DNA分子的两条单链上，彼此方向相对。所用的TaqDNA聚合酶是热稳定的，即经过反复加热仍保持活性。2.点突变的检测点突变的检测在PCR方法问世以前，检测基因点突变以及少数核苷酸的缺失或插入，主要靠DNA顺序测定，而进行DNA测序的前提是获得基因克隆，这对大量样品的基因诊断几乎是不可能的。在PCR基础上发展的若干其它技术，有力地促进了这些突变的检测。下面介绍一些常用的方法。（1）PCR和限制酶酶解当突变涉及到某个限制性内切酶识别位点改变时，可对被测样品PCR产物，用适当限制性内切酶酶切后进行电泳分离，根据酶切片段长度，判断突变是否存在。（2）PCR产物的寡聚核苷酸探针杂交及反向杂交产物的寡聚核苷酸探针杂交及反向杂交对被测样品PCR产物进行等位基因特异的寡聚核苷 酸 探 针 杂 交 （ allele-specificoligonucleotidehybridization，ASOH)，是检测点突变最常用的方法，基本上适用于任何情况的点突变。一般制备两套点样膜，分别与经过标记的具有正常顺序和具有某突变顺序的寡聚核苷酸探针杂交。与正常顺序寡聚核苷酸探针而不与具有某突变顺序的寡聚核苷酸探针杂交者判断为不含某突变，与具有某突变顺序的寡聚核苷酸探针而不与正常顺序寡聚核苷酸探针杂交者判断为某突变的纯合子，与两种探针均杂交者判断为某突变的杂合子。一个变更的方法是将具有不同突变的ASO探针固定在滤膜上进行反向杂交，通过标记待测个体DNAPCR扩增产物，即可同时鉴定待测个体的基因突变状况。在设计PCR引物时，使其中的一个引物涉及突变位置并使突变点正好处于引物的3末端。由于PCR过程中引物延伸是从引物3端开始的，如3末端碱基与DNA模板互补，PCR正常进行。得到特定长度的扩增片段。如3末端碱基不与DNA模板互补，则不能得到特定长度的扩增片段。53引物引物I引物引物II53引物引物I引物引物II引物引物II为为3碱基特异引物碱基特异引物（3）等位基因特异的等位基因特异的PCR（allelespecificPCR,ASPCR）(又称又称3碱基特异碱基特异PCR)这一方法是用含浓度递增的变性剂（如尿素或甲醛或二者并用）的聚丙烯酰胺凝胶进行DNA片段的电泳分离。在某一变性剂浓度下，DNA的一个区域（结构域）发生变性，局部双螺旋解离成单链，迁移速度明显下降。由于不同碱基顺序的片段在不同部位发生变性，两个具有相同长度但具有不同碱基顺序的DNA片段，可以彼此分开。如果变性剂的梯度平缓，此技术的灵敏度足以将相差一个碱基对的DNA片段分开。（4）变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoreses,DGGE）（5）PCR和单股构象多态性和单股构象多态性(singlestrandedconformationpolymorphism,SSCP)分析分析把PCR后获得的双股DNA加热变性后形成单链DNA，相同长度的DNA单链由于碱基顺序不同，它们在中性聚丙烯酰胺凝胶中可有不同的构象而导致电泳速度的不同，这种现象称为单链构象多态性。PCR产物变性后经由SSCP分析，可能有效的检出DNA顺序变异。不是所有的核苷酸序列改变都引起可检测的单链构象改变，因此SSCP方法并不能鉴别所有的突变。双脱氧指纹法是将双脱氧末端终止法与SSCP结合起来的分析技术。其方法是用一侧引物对PCR产物进行双脱氧末端终止法测序反应，用一个ddNTP参入反应，产生长短不一的单链DNA，然后进行SSCP分析。可分别使用两侧的PCR引物，获得一端平齐的长度不等的DNA单链。DDF方法克服了SSCP分析时因DNA长度影响SSCP显示的困难，通过一种双脱氧核苷酸产生异质性的单链DNA，使其中长度合适的DNA片段显示SSCP改变。（6）PCR和双脱氧指纹法和双脱氧指纹法(dideoxyfingerprinting,DDF)（7）PCR和核苷酸错配的化学裂解和核苷酸错配的化学裂解（chemicalcleavageofnucleotidemismaches）这一方法的原理与Maxam-GilbertDNA化学裂解法测序基本一致。其步骤是把先PCR产物进行32P末端标记，然后变性，再把仅一端带有放射性标记的单链DNA进行12组碱基特异的裂解反应（可根据测序时所用5组，G、（AG）、C、（CT）、AC选择）。例如，用硫酸二甲酯对G残基进行部分修饰后再用热哌啶溶液处理，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影，可检测是否发生了涉及G的突变首首先先把把PCR产产物物经经5末末端端标标记记后后，再再变变性性成成仅仅一一端端带带有有同同位位素素标标记记的的单单股股DNA，然后进行后序步骤。然后进行后序步骤。仅一端带有同位素的单股DNA32PACACTGAACGTTCATGTCGAme32PACACTGAACGTTCATGTCGAme32PACACTGAACGTTCATGTCGAme32PACACTGAACGTTCATGTCGAme32PACACT32PACACTGAAC32PACACTGAACGTTCAT32PACACTGAACGTTCATGTC聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射性自显影DMSO处理用热哌啶溶液处理，使被修饰的G残基脱落并使糖磷酸主链发生水解（8）PCR产物的测序产物的测序在获得PCR产物后，可以直接测序或把PCR产物克隆到M13载体或质粒载体（如T载体）上用末端终止法测序以判断基因突变。为了获得更好的PCR产物直接测序结果，有时采用所谓不对称PCR方法。即在一个PCR反应体系中，把一个引物减少到常规用量的1/50左右（称为限制性引物）。这样，在前十几个循环中，扩增合成一定量的双股DNA，限制性引物被逐渐耗尽。在后十几个循环中，只有加入了常规量的那个引物与模板形成复合物并发生链延伸，只合成单股DNA，可以此单股DNA为模板用末端终止法测序。在一些情况下，直接检测基因突变具有一定困难。如：1）某些遗传病具有多种突变类型；2）一些疾病相关基因只知在染色体上的位置，但未克隆分离，对基因结构及导致疾病的分子机制尚不清楚；3）致病基因尚未确定。这时可用连锁分析进行间接的基因诊断。连锁是指一个基因（或一段DNA顺序）与另一基因在同一染色体上并且位置接近，因此二者可在一起被遗传，前者可作为后者的遗传标志。DNA多态性是进行基因诊断和疾病相关基因定位时最常使用的遗传标志。(二二)间接的基因诊断间接的基因诊断多态性连锁分析多态性连锁分析2.1 2.1 基因治疗的概念基因治疗的概念基因治疗的最初含义是指遗传病的基因替代治疗，即将正常基因通过某种途径转入到由于该基因缺陷而患有某种遗传病的患者体内，从而达到治疗该遗传病的目的。目前广义的基因治疗是指体细胞基因治疗，即把具有防治潜能的外源基因（目的基因），通过合适载体转移到患者的有关器官组织的细胞中，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗是一种治疗和预防遗传性疾病和多因素疾病的方法。遗传病的基因治疗是指通过遗传工程手段，将正常基因（最好包括表达所需的调控顺序）导入该基因有缺陷的遗传病患者体内，使导入基因发挥作用，或使缺陷基因能在原位得以校正或修复，从而纠正基因缺陷导致的各种异常表现。目前，基因治疗已经扩大到一些由遗传因素和环境因素共同决定的疾病，如癌症等的治疗。如通过转入与刺激宿主细胞产生对肿瘤细胞的免疫应答相关的基因，或直接抑制或杀伤肿瘤细胞相关的基因治疗癌症，通过转入与某种疾病病因相关的功能基因治疗该病等。（一）基因治疗的概念（一）基因治疗的概念(二）基因治疗的必要条件二）基因治疗的必要条件开展某种疾病的基因治疗必须具备的必要条件为：1）对从DNA水平上的发病机制已经清楚或至少有一定了解；2）要转移的基因已经克隆分离，对此基因及表达产物有详尽的了解；3）该基因正常表达的组织可以在体外进行遗传操作，或者该基因能在其它可允许体外操作的组织内表达。但是要实现较为理想的基因治疗，还必须达到如下条件：1）外源基因可有效导入靶细胞；2）外源基因能在靶细胞中长期稳定存留；3）导入基因能适量表达；4）导入基因的方法及所用载体对宿主细胞安全无害；基因治疗的基本条件基因治疗的基本条件1.用现行各种治疗方法治疗无效，或疗效不用现行各种治疗方法治疗无效，或疗效不佳。佳。2.已经在已经在DNA水平上明确发病机理水平上明确发病机理3.有关的基因已经克隆有关的基因已经克隆4.该基因可在体外进行操作该基因可在体外进行操作5.只需低水平表达即可治愈或改善疾病只需低水平表达即可治愈或改善疾病6.表达水平不需严格控制表达水平不需严格控制年纪轻，体重小，有严重的症状，年纪轻，体重小，有严重的症状，有少量相关蛋白，未产生该蛋白抗体，没有其他任有少量相关蛋白，未产生该蛋白抗体，没有其他任何严重疾病，自愿，何严重疾病，自愿，能很好配合。能很好配合。基因治疗的疗效考核与安全性基因治疗的疗效考核与安全性基因治疗第一例成功的报告基因治疗实例基因治疗实例重症联合免疫缺陷重症联合免疫缺陷（SCID）重重 症症 联联 合合 免免 疫疫 缺缺 陷陷 （ Severe combinedimmunodeficiency disease，简简称称SCID），患患者者缺缺乏乏正正常常人人体体免免疫疫功功能能，其其染染色色体体上上编编码码腺腺苷苷酸酸脱脱氨氨酶酶（简简称称ADA）的的基基因因发发生生突突变变所所致致。由由于于ADA是是嘌嘌呤呤代代谢谢中中的的一一种种酶酶，该该基基因因缺缺陷陷将将导导致致患患者者身身体体细细胞胞中中脱脱氧氧腺腺苷苷的的累累积积，达达到到高高浓浓度度时时脱脱氧氧腺腺苷苷将将对对免免疫疫系系统统细细胞胞（如如T-细细胞和胞和B-细胞）产生毒性。细胞）产生毒性。1990年年，美美国国第第一一次次对对SCID病病人人作作基基因治疗，其步骤为：因治疗，其步骤为：1将将正正常常ADA基基因因与与反反转转录录病病毒毒载载体体相连，构建重组病毒表达载体。相连，构建重组病毒表达载体。2从从患患体体体体内内分分离离有有免免疫疫缺缺陷陷的的T淋淋巴细胞。巴细胞。3用用重重组组病病毒毒感感染染体体外外培培养养的的T淋淋巴巴细细胞胞，使使正正常常ADA基因插入到基因插入到T淋巴细胞基因组中。淋巴细胞基因组中。4培养细胞并确认该基因正常表达。培养细胞并确认该基因正常表达。5将将含含有有正正常常基基因因的的T淋淋巴巴细细胞胞回回输输到到患患者者的的骨骨髓髓组组织织中中。经经5-6个个月月的的基基因因治治疗疗，患患者者体体内内T淋淋巴巴细细胞胞的的数数量量恢恢复复到到正正常常水水平平，体体内内ADA酶酶几乎达到正常水平。免疫功能得到恢复几乎达到正常水平。免疫功能得到恢复。2.2 2.2 基因治疗方案的内容基因治疗方案的内容基因治疗试验研究的方案包括以下内容:第一、进行目的基因的制备,可通过人工合成、基因文库分离及逆转录等方法获得；第二、慎重地选择靶细胞,要选择那些容易获得且生存期长,在体外转染后能方便、安全地回输体内，并且在体内易成活的靶细胞；第三、将目的基因导入靶细胞是基因治疗的重要步骤,主要通过生物和理化方法；第四、目的基因表达的调控,包括基因转录前的调整、转录、mRNA 的翻译及蛋白产物的加工等复杂过程；第五、目的基因产物活性与表达量的鉴定，以判断治疗的效果。基因治疗过程的示意图基因治疗的类型基因治疗的类型1体细胞基因治疗是指把外源基因导入患者的体细胞，以治疗或预防基因接纳者个人的疾病，只有特定的个体受益，但不能遗传给后代。目前正在开展的基因治疗主要是体细胞基因治疗。2种系细胞的基因治疗种系细胞的基因治疗是指在生殖细胞（精子、卵子或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因以校正遗传缺陷。如果正常基因能整合到基因组，则引入的外源基因能遗传给后代。与体细胞相比，利用种系细胞转移基因的优点是可以把目的基因转移到机体的所有组织，包括精子和卵子，而被转移基因可以遗传给后代。但种系细胞的基因治疗尚未在人类中开展，因为要改变人类生殖细胞涉及许多伦理学问题。此外，在技术上也有很大的困难，一是很难诊断有缺陷的受精卵，二是在生殖细胞中引入外源基因时存在引起新的插入突变的危险。体细胞基因治疗的策略体细胞基因治疗的策略1.基因的取代或补偿1)取代导入正常基因顺序，替换突变基因顺序，使缺陷基因在原位得以校正。使用的方法是同源重组（或叫基因打靶），对校正基因编码区和调控区的突变均适用。这是理想的基因治疗，但在技术上极其困难，一是同源重组率极低，二是所获得的被校正过的细胞可能因分化、死亡而消失。目前此策略的作用还很有限。2)补偿将目的基因导入有基因缺陷的患者适当的细胞或组织中，以便为患者提供所缺少的正常基因表达产物。如是发病机制尚不清楚的多基因疾病，则是为患者提供可以纠正其表型的基因产物。它适用于基因编码区突变或调控区突变，也适用于多基因病的表型纠正和肿瘤、传染病的免疫刺激治疗。2.导入外源基因以抑制或活化内源基因表达导入外源基因以抑制或活化内源基因表达1）抑制导入外源基因的目的是为了降低有关内源基因过高的表达水平，以使患者的病状得以改善。2）活化导入外源基因的目的在于提高内源基因的表达水平，进而达到治疗目的。3导入寡聚核苷酸以抑制内源基因通过向体细胞内注入寡聚核苷酸来控制内源基因表达也已被认为是一种较有希望的基因治疗方法。目前主要见于肿瘤的基因治疗研究。1)反基因方法：注入与特定基因中做为模板转录合成mRNA的DNA链互补的寡聚核苷酸阻断转录。2)反义方法：注入与特定mRNA互补的寡聚核苷酸阻断翻译。3)注入特定的寡聚核苷酸：做为分子引诱物起作用以隔绝低浓度的转录因子或做为核酶（ribozyme）起作用切开靶RNA。二二基因转移的技术方法基因转移的技术方法（一）转染（一）转染（transfection）1.磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法把供体DNA溶解在Hepes溶液中，然后缓慢加入Na2HPO4CaCl2溶液，供体DNA便被包裹在磷酸钙溶液中，这种共沉淀可被细胞吞噬，外源基因便导入了受体细胞。2.DEAE-Dextran法法将DNA溶液溶解在TBS含Tris、K、Na等缓冲液中，与二乙胺乙基葡萄糖（DEAE-Dextran）混合，滴加到受体细胞表面，供体DNA便会进入受体细胞。3.脂质体转染法脂质体转染法脂质体是由磷脂、胆固醇或其它脂类形成的一种可以高效包装DNA的人造单层膜。由于它的结构和性质与细胞膜极为相似，因而二者易于融合，DNA则由于细胞的内吞作用而进入细胞。4.电穿孔法（电穿孔法（electroporation）将供体DNA与受体细胞混匀，在高压电场作用下，给细胞一个电脉冲，引起受体细胞出现瞬间可逆性开启，外源DNA便乘机通过膜孔进入细胞。5.基因枪法基因枪法将DNA与人类无明显毒副作用而对DNA有良好吸附能力的微细金粒结合，在高压电场的作用下，金粒以极高的速度带入人体外的细胞内或直接带入人体内。6.超声波法超声波法超声波可对细胞膜直接作用，使细胞膜的通透性增高，DNA可通过扩散作用进入细胞。本法对于悬浮和贴壁生长的细胞均适用，并且超声波可通过培养瓶瓶壁发挥作用。7.受体介导法受体介导法此方法依赖于受体和配体间的特异结合所介导的细胞内吞作用而将外源基因导入细胞。一般是将DNA与多聚物（如多聚赖氨酸）结合而浓缩，在结合以一定的配体即可用于基因转移。不过效果仍不理想。(二二)微注射法微注射法是指通过显微镜注射法把DNA注入细胞。此法比较适于生殖细胞的基因治疗（如受精卵的注射）。虽然也可以注射到体外培养细胞，但在单位时间内所能处理的细胞数非常有限，因此对需要大量细胞的体细胞基因治疗工作不太适用。2.2.1 2.2.1 正常基因的选择和制备正常基因的选择和制备正常基因，即用于纠正靶细胞基因的外源性目的基因。2.2.2 2.2.2 细胞因子基因细胞因子基因（一）干扰素基因（二）白细胞介素类基因（三）肿瘤坏死因子(TNFa)（四）粒细胞-集落刺激因子(GM CSF)2.2.3 2.2.3 病毒基因病毒基因病毒基因的作用是促进肿瘤细胞的抗原表达,使肿瘤细胞膜表达某些病毒抗原，使肿瘤细胞更具“异己性”,从而加速肿瘤消退的免疫反应。2.2.42.2.4 抑癌基因抑癌基因目前在抑癌基因中以Rb和p53在抗肿瘤基因治疗中研究较多。2.2.52.2.5 肿瘤药物基因肿瘤药物基因（一）肿瘤药物敏感基因(又称药敏自杀性基因)。（二）肿瘤药物增敏基因。 （三）肿瘤药物耐受基因。 2.2.6 2.2.6 主要组织相容性复合体主要组织相容性复合体( (MHC)MHC)基因基因该基因通过促进肿瘤抗原表达,提高机体对肿瘤的免疫力来治疗肿瘤。2.3 2.3 靶细胞的选择靶细胞的选择基因治疗的靶细胞可以是生殖细胞也可以是体细胞。在各种靶细胞中，造血干细胞是最受重视和最常用的靶细胞。2.4基因转移基因转移 基因转移方法可分为直接体内法(in vivo) 和间接体内法(ex vivo)。 基因转移技术按载体又可分为四大类:病毒载体法非病毒性生物载体法非生物性载体法非载体法。2.4.1直接体内法直接体内法直接体内法是将外源基因直接导入人体内通过体内（通过体内（invivo）基因转移的途径基因转移的途径体内（又称直接体内）基因转移是一种将插入目的基因的表达载体稍加处理后就直接导入体内的方法。皮肤、肌肉、肝、血流、肺等可能作为基因转移的靶子位点。在上述基因转移技术中，脂质体法、基因枪法、受体介导法等均可应用于直接体内法。所用的DNA材料可以是：1)插入了目的基因的表达载体的裸露DNA，将其溶解于PBS，生理盐水或高渗蔗糖中即可直接用于注射；2)将DNA或RNA先与脂质、多聚体或颗粒金等介质结合成复合物形式，再通过直接注射或用基因枪导入体内；3)在一定的包装细胞系中包装好的复制缺陷型病毒颗粒。此种方法的优点是简便、省时省力，能很快观察到外源基因的表达及作用，因此人们乐于采纳和应用。但缺点和不足也很多，比如DNA在体内不易进入细胞，易被降解，以病毒颗粒的形式导入人体则易引起免疫反应和被补体灭活。这些对外源基因的转移效率和持续表达都是不利的。2.4.2 2.4.2 间接体内法间接体内法间接体内法是指先从病人身上取得靶细胞, 将外源基因在体外转染病人细胞后, 再将转染的靶细胞输回病人体内。通过回体（通过回体（exvivo）基因转移的治疗途径基因转移的治疗途径通过回体（又称间接体内）基因转移实现体细胞基因治疗的基本途径是：1)从个体供者中收集组织或细胞移植物，进行组织培养以确立原始的细胞培养物；2)把实验的治疗基因或标记基因转移到这些细胞（上述基因转移方法多可应用）；3)把转基因的细胞进行选择或富集培养几天至23周；4)自体移植这些转染的细胞到实验动物或受试病人的靶器官。2.4.3 2.4.3 非载体间接体内法非载体间接体内法（1）体外电穿孔法（2）显微注射法（3）磷酸钙共沉淀法（4）同源重组2.4.4 2.4.4 病毒性载体转移技术病毒性载体转移技术人的外源基因包装在缺陷型病毒中感染细胞，经培养后再输入病人体内进行治疗（一） 逆转录病毒载体（Retrovirus，RV）（二）腺病毒载体（Adenovirus, AV）病毒载体介导的基因转移病毒载体介导的基因转移1反转录病毒反转录病毒(Retrovirus,RV)反转录病毒被认为是实现基因治疗最有希望的载体之一，其主要优点是：基因转移的效率高，细胞宿主范围较广泛，DNA整合效率高于其它病毒载体等。用于基因治疗的反转录病毒载体是把源于莫洛尼氏小鼠白血病病毒（Mo-MLV）前病毒DNA经过适当的改造并插入质粒后构建而成。这种改造原则上应当保留病毒的长末端重复顺序（longterminalrepeat,LTR）和病毒包装时必须的顺序（y），但基因组中编码组特异抗原（sequences encoding group-specific antigens,GAG）也即病毒内部结构蛋白（internalstructureproteins）的基因、编码反转录酶（sequencesencodingreversetranscriptase，POL）以及编码病毒封皮蛋白（sequencesencodingtheenvelopeproteins，ENV）的基因可以去除。载体中可插入以治疗或实验为目的的基因（最好带有自己的调控顺序）及药物选择基因（如能产生对新霉素抗性的氨基葡萄糖磷酸转移酶基因neo）。这样的重组体在转化普通细胞后并不能产生病毒颗粒（因为只能产生病毒载体RNA而不能产生病毒蛋白），只有在转染特定的反转录病毒包装细胞系后才能产生病毒颗粒。包装细胞系中已经整合了经过改造的反转录病毒前病毒基因组（称为助病毒），最重要的改造是除去了病毒包装所必须的y顺序。包装细胞对于反转录病毒载体的安全性和高效性至关重要。自从1983年麻省理工学院Mulligan研究组构建第一个反转录病毒包装细胞系-2以来，人们在增大重组反转录病毒宿主范围、提高病毒滴度及降低产生有复制能力病毒危险性等方面不断改进。概括地说，反转录病毒包装细胞系可分为以下三代。包装细胞第一代包装细胞系以-2为代表，细胞中整合的莫洛尼氏白血病病毒（MLV）前病毒基因组缺失了包装信号，它能够提供包装蛋白，自身因缺乏了包装信号而不能形成病毒颗粒。但是，在有外源性RV（具有包装信号）感染的情况下，只要前者与包装细胞中已整合的MLV基因组发生一次与包装信号有关的重组，即可产生有复制能力的病毒，安全性较差。由于-2细胞是由缺失了包装信号的单向性（ectropic）MLV前病毒基因组转化而来，以此包装细胞系包装出来的病毒颗粒仅能感染小鼠及相近的啮齿类，因此在人类的基因治疗中受到限制。第二代包装细胞以PA317为代表。Miller等对双向性（amphotropic）反转录病毒（Am-MLV）前病毒基因组进行了改建，剪除了包装信号、与前病毒形成有关的env终止密码子3端部分顺序，及与前病毒整合有关的5LTR的5末端，3LTR区的部分顺序由SV40的polyA信号顺序取代，用改建的多病毒基因组转染3T3细胞后得到了稳定整合的pA317包装细胞系。由于有了这些突变，pA317需与RV发生至少两次重组后才可能产生具有复制能力的病毒，安全性明显好于-2。由PA317包装的重组反转录病毒能感染鼠、兔、猪、犬、猴及人等广泛宿主。第三代包装细胞由两种质粒转化而成，gag-pol和env分别由不同质粒携带，均缺乏包装信号，3LTR的部分顺序均由SV40的polyA信号顺序取代，因此包装细胞中的前病毒基因组顺序必须与RV间独立地发生四次以上的重组才能产生有复制能力的重组病毒，安全性进一步提高。此代包装细胞系有-CRE、-CRIP、GPE86、GPam12以及几种人源性的RV包装细胞系，即以293细胞为基础的双嗜性包装细胞系stablehuman(293)basedamphotropicpackagingcelllineUSVg、Kat等。重组反转录病毒载体在转染反转录病毒包装细胞后可获得重组病毒颗粒（图），用于感染靶细胞或组织，达到转移基因的目的。运用反转录病毒载体进行基因治疗也存在许多缺点，如只能感染处于分裂状态的细胞，载体容量小（8kb），目的基因在未分化的细胞中常丢失等。此外转移基因的随机整合也可能有导致癌基因活化以及功能基因失活的潜在危险。2腺病毒腺病毒(Adenovirus,AV)腺病毒载体也是近几年发展较快应用较广泛的病毒载体之一，其原因之一是AV比较安全，它在进入细胞后不能整合到染色体上，因此没有激活原癌基因和使功能基因失活的危险。AV的另一重要优点是其不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞，这一特性允许它可在分化的以及有最低（或无）分裂能力的细胞中进行感染并使转基因得以表达。AV载体的缺点是其免疫原性较强，易受机体免疫系统的中和作用而失活，不能整合到宿主细胞基因组也使得外源基因表达持续的时间很有限，AV载体插入外源DNA的能力也有限（7kb）。在缺乏AV的情况下，AAV显示出一种潜伏的感染图案，当用AAV和AV共感染时，导致裂解感染，产生AAV粒子。潜伏的AAV感染已被证明对在体外转导DNA到各种细胞型（无论分裂的和未分裂的细胞）都是有效的。AAV的一个重要特性是其基因组整合到人基因组中时具有高度特异性，在人染色体19q13.4-ter部位有一个单一的整合位点。这一发现说明，AAV载体在人类基因治疗中可能被使用来进行位点特异的整合。可以说AAV具有AV基因转移的高效性和RV基因表达的持续性，而且减少了RV随机整合可能导致的危险,因此在基因治疗研究中的应用会越来越广泛。AAV的缺点是其转基因的装载能力。完全的病毒基因组仅有4.7kbDNA，插入外源DNA的长度自然也非常有限。（三）腺相关病毒载体(Adeno-associated Virus, AAV)图：腺病毒相关病毒载体系统图：腺病毒相关病毒载体系统HSV是嗜神经组织的，有把基因转移到中枢神经系统的潜能，可能会在神经系统疾病的基因治疗中发挥作用，因而受到人们重视。HSV基因组是长152kb的双股DNA分子。此病毒融合到神经元的膜上并被转运到核。复制周期由潜伏期和裂解期组成。在潜伏期，病毒基因组被压缩并且至少 两 个 潜 伏 相 关 的 启 动 子 （ latency-associatedpromoters,LAPs）被活化。在裂解期，病毒被复制并产生病毒粒子。（四）单纯疱疹病毒载体（Herpes Simplex Virus, HSV）HSV基因组中约30kb的DNA可被外源DNA替代而不显著影响复制、包装和感染活力。因此估计外源基因的最大插入为20kb或略长些）。但HSV基因组较大的尺寸使得它较难进行遗传操作。HSV载体不能整合到宿主细胞基因组，因此表达持续的时间有一定限度。此外，HSV基因组中包含大量功能基因，在基因治疗中使用重组HSV载体的安全水平尚待进一步观察。5痘病毒（痘病毒（Poxvirus,PV）痘病毒在人类历史上已经广泛应用，因此使用痘病毒做为基因转移载体的安全性是勿容置疑的。痘病毒基因组DNA长达186kb,推测外源基因的容量可达30kb。痘病毒可感染非分裂的细胞，因此可适用的细胞型比较广泛。其缺点是不能整合入细胞基因组，故外源基因表达的时间不能持久，载体过大，受免疫系统的影响也较大。近年来出现了更多的病毒载体,如杆状病毒、EBV、牛痘病毒、VSV 和CMV 等。腺病毒多赖氨酸DNA复合体2.4.5 2.4.5 非病毒性生物载体非病毒性生物载体（1）线粒体DNA（2）哺乳动物人工染色体（mammalian artificial chromosome, MAC)（3）人类人工染色体(human artificial chromosome, HAC)（4）人类天然小染色体(human micro chromosome, HMC)2.5 2.5 目的基因的表达调控目的基因的表达调控2.5.1 2.5.1 组织特异性表达的转录调控组织特异性表达的转录调控2.5.2 2.5.2 诱导性转录调控诱导性转录调控2.5.3 2.5.3 增增强强子、静息子子、静息子 2.5.4 2.5.4 反式激活效反式激活效应 第三节 基因治疗的策略3.1 3.1 基因修正（基因修正（Gene correctionGene correction）是正常外源基因瞄准缺陷基因，通过同源重组，特异性原位修复基因缺陷，而对靶基因组不加任何改变。这是一种理想的基因治疗方法，但由于技术困难，重组率低（10-510-7）而应用受限。3.2 3.2 基因修补（基因修补（Gene Gene augmentationaugmentation）也称基因增加或追加，是目前应用最多的一种可行方案。将正常外源基因导入靶细胞。如酶类、具有治疗意义的生物活性物质基因，以弥补体内缺陷的基因成分或其表达。3.3 3.3 基因替换（基因替换（Gene Gene replacementreplacement）用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。3.4 3.4 基因失活（基因失活（Gene Gene inactivationinactivation）利用反义技术能特异性地封闭基因表达，抑制一些有害基因的表达，达到治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。3.5 3.5 基因添加基因添加根据治疗的需要，可以向靶细胞输入原本没有的基因类型，改变靶细胞的细胞识别，或改变细胞内代谢途径，或通过产物调节靶基因的表达水平等等。3.6 3.6 基因治疗的分子机理基因治疗的分子机理3.6.1免疫调节（免疫调节（Immuneadjustment）3.6.2RNA干扰（干扰（RNAInterference，RNAi）3.7 3.7 基因药物靶向治疗基因药物靶向治疗基因药物是指利用基因序列数据，经生物信息学分析、高通量基因表达、高通量功能筛选和体内外药效研究开发得到新药候选物。3.7.1 3.7.1 基因疫苗基因疫苗基因疫苗是指用编码抗原的基因制成的疫苗。利用基因枪将基因疫苗直接给机体接种后可在机体内表达，表达产生的蛋白质作为抗原诱导机体产生特异的免疫反应，使机体获得对该抗原的免疫力。3.7.2 3.7.2 反义反义RNA RNA 药物药物反义RNA（antisense RNA）是一类能与特异mRNA互补的小分子量、可扩散的DNA转录物，它能够从翻译水平、转录水平和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表达。3.7.3 3.7.3 三链三链DNA DNA 药物药物脱氧寡核苷酸能与双螺旋dsDNA专一性序列结合，形成三链DNA，来阻止基因转录或DNA复制，此脱氧寡核苷酸被称为三链DNA形成脱氧寡核苷酸（TFO）。为了与作用在mRNA翻译水平的反义RNA的反义技术相区别，将三链DNA技术称之为反基因技术。3.7.4 3.7.4 几种大有希望的其它基几种大有希望的其它基因医学产品因医学产品人们吃了经过基因改造的蔬菜或水果，就会促使体内产生适当的抗体，从而使人对某些抗原具有一定的免疫力。3.8 3.8 自杀性基因治疗自杀性基因治疗自杀基因是一种阴性选择性标记基因，可以在体内将无毒性的前体药物转化为有毒性药物。第四节 基因治疗的应用目前基因治疗对象不再限于单基因缺陷遗传性疾病，还广泛用于恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、自身免疫疾病等多基因疾病以及AIDS等重大传染性疾病的防治；基因治疗技术与传统的药物治疗方法的区别也缩小了。4.1 4.1 造血细胞疾病的基因治疗造血细胞疾病的基因治疗4.2 4.2 心血管疾病的基因治疗心血管疾病的基因治疗4.3 4.3 风湿性关节炎的基因治疗风湿性关节炎的基因治疗4.4 4.4 肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗4.5 4.5 AIDSAIDS的基因治疗的基因治疗4.6 4.6 X X染色体遗传的染色体遗传的SCIDSCID（SCID-XSCID-X）的基的基因治疗因治疗第五节 基因治疗药物的安全性评价基因药物作为一种全新的新型药物，其安全性的评价分为特异性和非特异性两种。非特异性评价和所有的普通药物评价一样；特异性评价主要是指对载体安全性和表达蛋白毒性的评价。基因药物安全性评价的内容包括：（1）单次剂量毒性研究（2）重复剂量毒性研究（3）表达产物的组织分布研究（4）药学安全性研究（5）生殖系统安全性研究（6）基因毒性研究基因治疗研究的现状基因治疗研究的现状1990年BleaseRM和AdersonWF首次成功地进行了基因治疗实践。他们用反转录病毒载体把腺苷脱氨酶（adenosinedeaminase,ADA）基因导入重症联合免疫缺陷病（severecombinedimmunodeficiencydisease,SCID）患者的T淋巴细胞内，再把细胞回输到患者自身体内，观察到患者淋巴细胞增加，ADA含量升高，免疫功能恢复。自从1990年以来，基因治疗研究广泛开展。目前已有美国、中国、法国、荷兰、意大利、英国、日本、加拿大、奥地利、新西兰、瑞士、波兰、西班牙、芬兰、埃及等近20个国家开展了基因治疗研究。至1999年8月，以注册的基因治疗方案396个，受试者近3278个。在涉及的疾病中，肿瘤和获得性免疫缺陷综合症（acquiredimmuno-deficiencysyndrome,AIDS）占了主导地位。其次是多种单基因遗传病。在多因素疾病中还有外周动脉血管再生、动脉血管狭窄、类风湿性关节炎以及流感等。这些基因治疗研究涉及的基因转移载体以反转录病毒载体占了近50，其次为各种形式的质粒（非病毒转移系统）占20以上，使用腺病毒载体的占约10，使用腺病毒相关病毒载体的占2，使用单显性疱疹病毒的占约0.3%。我国在遗传病的基因治疗方面也开展地比较早。1991年7月，我国开始进行HEMB（血友病B，凝血因子IX突变）的基因治疗。从一批志愿接受基因治疗的HEMB患者中选择了两兄弟（伴性遗传）进行治疗。效果明显，1994年通过卫生部的评审。2000年年3月月8日，日，FDA公布严格管理基因治疗的公布严格管理基因治疗的新措施。新措施。不要急功近利，不要急功近利，不要诱导公众的过高期望，不要诱导公众的过高期望，不能由此全盘否定基因治疗，不能由此全盘否定基因治疗，应当以更严格的态度审视它。应当以更严格的态度审视它。2001年年9月，江苏省科技厅公开招标月，江苏省科技厅公开招标“肿瘤生物学与基因治疗的临床创新研究肿瘤生物学与基因治疗的临床创新研究”