核医学核医学核医学核医学第六章第六章 体外标记免疫分析体外标记免疫分析体外标记在核医学中的地位体内体内诊断：断：脏器器显像像功能功能测定定诊断断体外体外诊断：断：放射分析放射分析临床核医学床核医学 治治疗：131131I I治治疗甲亢甲亢核医学核医学实验核医学：核医学：利用核技利用核技术探索生命探索生命现象的本象的本质和物和物质变化化规律律体外标记免疫分析体外标记免疫分析是一门综合性学科，也是一门边缘学科。是集基础医学、实验医学及临床应用于一体的学科。在当前的各种免疫诊断技术中，标记免疫分析是最活跃、发展最快的一个领域。4体外标记免疫分析概念：概念： 是利用放射分析方法或其派生的相关非放射分析技术测定生物样品中微量生物活性物质含量的一类分析方法。5体外标记免疫分析特点：特点：利用抗原抗体结合反应的特异性，加上各种标记物（标记抗原或抗体）的可测量性来达到方便敏感地检测各种体内微量生物活性物质，包括内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等。6体外标记免疫分析鼻祖: (Yalow,July 19, 1921 ) 美国科学家美国科学家YalowYalow和和BersonBerson。于于19561956年年创建的建的放射免疫分析放射免疫分析(RIA)(RIA)，测定人血定人血浆胰胰岛素素获得成功。得成功。树立了超微量物立了超微量物质体外体外标记免疫分析的里程碑。免疫分析的里程碑。 19681968年，年，MilesMiles和和HalesHales建立了建立了免疫放射分析免疫放射分析(IRMA)(IRMA)。7体外标记免疫分析获奖: 在在1977年年Yalow和和Berson因因创建了放射免建了放射免疫分析，使微量物疫分析，使微量物质的的测定成定成为可能，而荣可能，而荣获诺贝尔生物医学生物医学奖 。8体外标记免疫分析v贡献献:随着基础医学和相关技术的发展，在RIA标记抗原竞争性抑制结合、IRMA标记抗体非竞争性结合的理论基础上，相继派生出许多其它的标记免疫分析方法，如酶标记免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析等多种形式、多种反应模式的综合性标记免疫分析体系，并广泛应用于基础医学、临床医学、教学及科研诸多领域，有力地推动了医学科学的发展。9体外标记免疫分析发展展: 电化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析化学发光标记免疫分析时间分辨荧光免疫分析酶标记免疫分析放射受体分析放射受体分析免疫放射分析免疫放射分析放射免疫分析放射免疫分析10体外标记免疫分析竞争放射结合分析：竞争放射结合分析：标记抗原，抗体限量标记抗原，抗体限量非竞争放射结合分析：非竞争放射结合分析：标记抗体，抗体过量标记抗体，抗体过量分分 类类11第一节体外标记免疫分析的基本原理第一节体外标记免疫分析的基本原理12体外标记免疫分析基本原理:非竞争性非竞争性(标记抗体标记抗体)IRMA体体外外标标记记免免疫疫分分析析竞争性竞争性(标记抗原标记抗原)RIA13放射免疫分析（RIA）原理v放射免疫技放射免疫技术是是标记抗原与未抗原与未标抗原抗原竞争有限量争有限量的抗体，然后通的抗体，然后通过测定定标记抗原抗体复合物中放抗原抗体复合物中放射性射性强度的改度的改变，测定出未定出未标记抗原量。抗原量。14放射免疫分析（RIA）原理Ag 待待测抗原抗原+ *Ag + Ab *AgAb + *Ag (标记抗原抗原) (特异性抗体特异性抗体) (标记抗原抗体复合物抗原抗体复合物) (游离的游离的标记抗原抗原) AgAb + Ag 抗原抗体复合物抗原抗体复合物放射免疫分析（放射免疫分析（RIA）原理）原理标记抗原(*Ag)和非标记原(Ag)与限量抗体(Ab)竞争结合。*Ag和Ag具有相同的与 Ab结合的能力15RIA(RIA(竞争结合反应竞争结合反应) )原理示意图原理示意图AgAg*AbCFAg*BFB/F. *Ag:定量、足量定量、足量 . Ab:限量、特异限量、特异. *Ag和和Ag具有相同的免疫活性具有相同的免疫活性. Ag+ *AgAb的有效结合位点的有效结合位点. *Ag和和Ag通过竞争的方式与通过竞争的方式与Ab结合，随着结合，随着Ag增加，增加， *Ag与与Ab结合结合形成的形成的*AgAb复合物的量减少复合物的量减少16放射免疫分析（放射免疫分析（RIARIA）实验操作步操作步骤：加加样（Ag，* *Ag，Ab) 混匀，温育（反混匀，温育（反应达到平达到平衡）衡）分离分离测量量数据数据处理，理，质量控制量控制17测量测量复合物量复合物计数示意数示意图：光子光子(射射线能能)与与闪烁体的作用体的作用 闪烁体体(光脉冲、光能光脉冲、光能) 光光电倍增管倍增管(电能能)前置放大器前置放大器(电脉冲脉冲)电子探子探测仪（计数数单位是探位是探测器器输出的出的电脉冲数，脉冲数，CPM或或CPS）1819RIA(RIA(竞争性结合竞争性结合) )标准品剂量反应曲线标准品剂量反应曲线依所测得的复合物的放射性计数依所测得的复合物的放射性计数(CPM)，对比标准品剂量反应曲线，求知待测品的含量，对比标准品剂量反应曲线，求知待测品的含量20免疫放射分析(IRMA)原理单位点：位点：Ag + *Ab (Ag-*Ab) + *Ab 抗原（待抗原（待测） 标记抗体抗体抗原抗原标记抗体复合物抗体复合物双位点：双位点：Ad-Ag + *Ab Ad-Ag-*Ab固体抗体固体抗体-抗原（待抗原（待测） 标记抗体抗体固体抗体固体抗体-抗原抗原-标记抗体复合物抗体复合物21IRMA(非竟争结合)反应原理22IRMA(非竟争结合)剂量反应曲线23RIA RIA IRMA IRMA 的区别的区别方法方法RIARIAIRMAIRMA1.1.标记标记* *AgAg* *AbAb2.2.免疫反应式免疫反应式Ag+Ag+* *Ag+Ab Ag+Ab * *Ag-Ab+AgAg-Ab+AgAg+Ag+* *Ab Ab A Ag-g-* *Ab+Ab+* *AbAb3.Ab3.Ab限量限量过量过量4.4.竞争竞争竞争竞争非竞争非竞争5.5.测量复合物测量复合物* *Ag-AbAg-AbAg-Ag-* *AbAb6.6.测量物计数值与标本含量测量物计数值与标本含量呈反比呈反比呈正比呈正比7.7.标准曲线形态标准曲线形态8.8.灵敏度灵敏度较低较低高高9.9.测量范围测量范围较窄较窄较宽较宽24第二节体外标记免疫分析的基本试剂和基本技术25基本试剂和基本技术基本试剂和基本技术. 标准品、准品、质控品控品. 特异性抗体特异性抗体. 示踪示踪剂(标记品品). 分离技分离技术26 . 标准品准品 (1)化学化学结构构: 应与待与待测物具有相同的化学物具有相同的化学结构构 (2)化学化学纯度：高度度：高度纯化化 (3)化学度量：化学度量： 准确准确 (4)稳定性：不易定性：不易变质、不易降解、不易降解27. 特异性抗体特异性抗体 (1)亲和力大和力大 (2)高滴度高滴度 (3)特异性特异性强 (4)可可长期保存期保存28. 示踪示踪剂（标记品）品）（1）高比活度）高比活度（2）生物活性与免疫活性与）生物活性与免疫活性与标记前一致前一致（3）化学）化学纯度度95%（4）稳定性好：定性好：标记品不易脱落品不易脱落29. 分离技分离技术-要求要求(1)结合部分与游离部分尽可能完全分开合部分与游离部分尽可能完全分开(2)非特异性非特异性结合率（合率（NSB%）低，小于）低，小于5%(3)分离的成分便于分离的成分便于测量量(4)分离效果不受外界分离效果不受外界环境影响境影响(5)分离分离试剂操作操作简便、价廉易得便、价廉易得30微孔滤膜法微孔滤膜法盐析法盐析法活性炭吸附法活性炭吸附法磁化颗粒法磁化颗粒法双抗体法双抗体法固相分离法固相分离法分离方法分离方法31323334353637第三第三节体外体外标记免疫分析的免疫分析的类型型38体外标记免疫分析的类型体外标记免疫分析体外标记免疫分析放射性核素标记免疫分析(RIA、 IRMA)酶标记免疫分析发光标记免疫分析(化学发光标记免疫分析化学发光酶免疫分析电化学发光免疫分析)时间分辩荧光免疫分析39放射性核素标记免疫分析放射性核素标记免疫分析概念：概念：一种将放射性核素一种将放射性核素测量的高灵敏性、高精确量的高灵敏性、高精确性和抗原抗体反性和抗原抗体反应的高特异性相的高特异性相结合的体外合的体外测定定超微量（超微量（10-910-15g）物）物质的新技的新技术。40放射性核素标记免疫分析分类:竞争性竞争性(标记抗原标记抗原,抗体限量抗体限量)RIA非竞争性非竞争性(标记抗体标记抗体,抗体过量抗体过量)IRMA放放射射性性核核素素标标记记41放射性核素标记免疫分析优缺点：缺点：自自1959年年Yalow和和Berson创建的放射免疫分析（建的放射免疫分析（RIA）具有具有灵敏度高、特异性灵敏度高、特异性强、简便便实用、成本低廉用、成本低廉等等优点。点。为生物医学的微量物生物医学的微量物质分析开分析开创了新的了新的领域。域。发展到目前展到目前为止止由此衍生出了各种各由此衍生出了各种各样的的标记免疫分析技免疫分析技术。虽然然RIA仍有仍有较广泛的使用市广泛的使用市场和价和价值，但其方法学上，但其方法学上固有的弱点使固有的弱点使发展受到一定限制。如必展受到一定限制。如必须使用放射性同位素使用放射性同位素作作为标记物，存在人物，存在人为的因素影响的因素影响较大、大、辐射防射防护及防止及防止污染的染的问题，试剂盒使用盒使用时间短，可短，可测量范量范围相相对较窄，窄，难以以实现操作及操作及测量的自量的自动化等。化等。42酶标记免疫分析（EIA）v概念：概念：是是应用用酶标记抗体（抗原）与抗原（抗体）抗体（抗原）与抗原（抗体）产生特异性反生特异性反应，根据，根据酶对底物的底物的显色反色反应而定而定量分析待量分析待测抗原或抗体含量。抗原或抗体含量。v分分类:均相均相EIA：酶增增强免疫分析（免疫分析（EMIT）非均相非均相EIA:酶联免疫吸附分析法（免疫吸附分析法（ELASA）43时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)概念：概念： 是应用镧系元素标记抗是应用镧系元素标记抗原或抗体，利用紫外线或激原或抗体，利用紫外线或激光使其发射荧光，结合波长光使其发射荧光，结合波长和时间两种分辨技术的微量和时间两种分辨技术的微量分析方法。分析方法。常用镧系元素：常用镧系元素：铕、铽、钐、镝铕、铽、钐、镝特点：特点：分析范围宽分析范围宽 灵敏度高灵敏度高专一度高专一度高稳定性强稳定性强123444发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析 （CLIA）电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(ECLIA)化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析(CLEIA)分类分类45化学发光标记免疫分析 （CLIA） 化学发光免疫技术：化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法。化学发光免疫分析是将化学发光系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或定性检测。46发光Y Y Y YY Y磁微粒被测抗原+抗体+带吖啶酯标记物抗体Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y冲洗后- 夹心法（1）加入H2O2（pH10）47化学发光标记免疫分析 （CLIA）概念：概念：利用化学反应中释放大利用化学反应中释放大量自由能产生激发态中间量自由能产生激发态中间体，当其退激到基态时，体，当其退激到基态时，发射出光子，对这些光子发射出光子，对这些光子量进行测量从而进行定量量进行测量从而进行定量分析抗原含量。分析抗原含量。常用发光剂：常用发光剂：鲁米诺类、吖啶酯类鲁米诺类、吖啶酯类特点：特点：灵灵敏敏度度高高特特异异性性强强重重复复性性好好测测定定范范围围宽宽123448化学发光酶免疫分析(CLEIA)v是将是将高特异性的高特异性的酶标记免疫分析技免疫分析技术和具有高灵和具有高灵敏度的化学敏度的化学发光分析技光分析技术相相结合的一种合的一种标记免疫免疫分析方法。分析方法。v发光光剂：金：金刚烷v特点：特点：标记结合稳定标记结合稳定发光持续时间长发光持续时间长有利于测定有利于测定12349辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 50电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(ECLIA)(ECLIA)简介：介：是新一代是新一代标记免疫分析技免疫分析技术，与其它，与其它标记发光免疫分析的原理不同，是一种在光免疫分析的原理不同，是一种在电极表面由极表面由电化学引化学引发的特异性化学的特异性化学发光反光反应，采用更，采用更为理想理想的的标记物，使用磁性分离及物，使用磁性分离及电激激发等新技等新技术，进一步推一步推动了了发光免疫分析的光免疫分析的发展，展，是目前最先是目前最先进的化学的化学发光免疫光免疫测定系定系统。51电化学发光免疫分析(ECLIA)v原理：原理：以以电化学化学发光光剂三三联吡吡啶钌标记抗体（抗原），与抗体（抗原），与待待测标本中抗原（抗体）本中抗原（抗体）产生免疫反生免疫反应形成复合物以三形成复合物以三丙胺丙胺(TPA)为电子供体，在子供体，在电场中因中因电子子转移而移而发生特生特异性化学异性化学发光反光反应，它包括，它包括电化学化学发光和化学光和化学发光反光反应两个两个过程。程。 特点特点准确性好准确性好多元检测多元检测均相测量均相测量稳定性好稳定性好灵敏度高灵敏度高52 在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗原(抗体)，在反应体系内待测标本与相应的抗体(抗原)发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。53 Ru(bpy)32+为标记物物v三三联吡吡啶钌为水溶性、高水溶性、高稳定性的小分子，可以定性的小分子，可以确保确保电化学化学发光的高光的高稳定性，并且无噪音干定性，并且无噪音干扰。v三三联吡吡啶钌结构构简单,分子量小，所以，易于分子量小，所以，易于标记到任何物到任何物质（如抗原、抗体、核酸，等）上，并（如抗原、抗体、核酸，等）上，并且且对原物原物质的生物活性及免疫活性影响小。的生物活性及免疫活性影响小。vTPA是是ECL中的中的电子供体子供体，氧化后生成的中氧化后生成的中间产物是形成激物是形成激发态Ru(bpy)32+化学能来源。化学能来源。电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(ECLIA)的标记物的标记物54电化学发光免疫电化学发光免疫(ECLIA)(ECLIA)反应模式图反应模式图55电化学发光免疫分析测定示意图56第四第四节体外体外标记免疫分析的免疫分析的质量控制量控制57质量控制的目的v近期目的：近期目的：通通过对测定定结果的分析，果的分析，对本次本次测定的定的质量量作出作出评价，并按照价，并按照预定的要求决定定的要求决定结果的取舍。果的取舍。v远期目的：期目的：通通过对不同批不同批测定定结果的比果的比较，发现造成成造成成误差的原因，从而改差的原因，从而改进实验条件或条件或设计，以提，以提高高质量。量。58分析误差*系系统误差差标准品准品误差差加加样误差差测量量误差差*随机随机误差差样品的采集与制品的采集与制备59质量控制指标.精密度精密度.准确度准确度.灵敏度灵敏度.特异性特异性.稳定性定性60精密度v用同一用同一实验方法多次方法多次检测同一同一样品所得品所得结果的一致果的一致性，又称重复性。性，又称重复性。v常表示常表示测量量结果中的随机果中的随机误差大小。差大小。v常用常用变异系数、异系数、标准差准差值等表示。等表示。61准确度v测定定值与真与真值之之间的符合程度的符合程度v由系由系统误差和随机差和随机误差叠加决定差叠加决定v用回收率及健全性来用回收率及健全性来评价价62灵敏度测定方法的最小定方法的最小检测量量影响因素：抗体影响因素：抗体亲和力和特异性、和力和特异性、标记品的比活度品的比活度抗原的免疫原性以及反抗原的免疫原性以及反应方式和温育条件等。方式和温育条件等。确定方法：零确定方法：零标准管法、准管法、t值检验法、粗略估法、粗略估计法。法。63特异性v决定于抗体决定于抗体对被被测物物质的的专一性一性v常用交叉反常用交叉反应来表示来表示64稳定性v指指实验批批间的重复性的重复性v常用最大常用最大结合率（合率（B0%）非特异性非特异性结合率（合率（NSB%）标准曲准曲线直直线回回归参数（参数（a、b、r）标准曲准曲线结合率（合率（ED）等指）等指标评价价65质量控制评价系统v实验室内部室内部质量控制量控制(IQC)v实验室室室室间质量控制量控制(EQC)66v包括从采集包括从采集标本、收集、本、收集、转运运标本到本到发出出报告告的全的全过程中，能及程中，能及时发现检测过程中出程中出现的各的各种种误差，分析差，分析产生原因，找出解决生原因，找出解决办法，以确法，以确保保检测质量。量。v检测、控制、控制检测方法的精密度，并方法的精密度，并检测其准确其准确度的改度的改变，提高常，提高常规测定工作的批定工作的批间、批内、批内检测结果的一致性。果的一致性。实验室内部质量控制实验室内部质量控制(IQC)(IQC)67实验室间质量控制(EQC)v由第三方机构（由第三方机构（质量控制中心）量控制中心）组织实施施v提高各提高各实验室之室之间检测结果的可比性果的可比性v由一个由一个单位提供方案及外部位提供方案及外部质量平价用的量平价用的统一一样品，分品，分发到各参加到各参加单位位进行行检测，然后将所，然后将所得得结果反果反馈于于负责单位位进行整理分析、行整理分析、评价，价，用以促用以促进检测质量的提高和量的提高和资料的可比性。料的可比性。实验室间质量控制实验室间质量控制(EQC)(EQC)6869