第三节第三节DNADNA重组技术重组技术第一个第一个 DNA DNA 重组子重组子 （Paul Berg, 1972Paul Berg, 1972）EcoRIrecognitionsites phageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA分子生物学研究方法分子生物学研究方法DNA重组的一般步骤重组的一般步骤1.1. 从生物有机体基因从生物有机体基因组中，分离出带有目的组中，分离出带有目的基因的基因的DNADNA片段。片段。2.2. 将带有目的基因的外源将带有目的基因的外源DNADNA片段连片段连接到能够自我复制的并具有选择记号接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组的载体分子上，形成重组DNADNA分子。分子。分子生物学研究方法分子生物学研究方法3.3. 将重组将重组DNADNA分子转移分子转移到适当的受体细胞（亦到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一称寄主细胞）并与之一起增殖。起增殖。4.4. 从大量的细胞繁殖群从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重体中，筛选出获得了重组组DNADNA分子的受体细胞，分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增并筛选出已经得到扩增的目的基因。的目的基因。分子生物学研究方法分子生物学研究方法酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连片段连接成一个接成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌） 按按55到到33方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNADNA双链中的缺口双链中的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成补原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH5-OH末末端（进行末端标记实验或用来进行端（进行末端标记实验或用来进行DNADNA的的连接连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基团末端的磷酸基团重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶分子生物学研究方法分子生物学研究方法1.至少有一个复制起点，因而至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主至少可在一种生物体中自主复制。复制。2.至少应有一个克隆位点，以至少应有一个克隆位点，以供外源供外源DNA插入。插入。3.至少应有一个遗传标记基因，至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组以指示载体或重组DNA分子分子是否进入宿主细胞是否进入宿主细胞4.安全性安全性（一）特点（一）特点基因工程载体是一类可供外源基因工程载体是一类可供外源DNADNA插入并携带重组插入并携带重组DNADNA分子分子进入适当宿主细胞自主复制的进入适当宿主细胞自主复制的DNADNA分子。分子。一、载体一、载体分子生物学研究方法分子生物学研究方法（二）类型（二）类型1 1、质粒载体、质粒载体常用的克隆载体、双链环状的常用的克隆载体、双链环状的DNADNA分子（也有线性分子（也有线性的）、能独立地自我复制及转录。的）、能独立地自我复制及转录。作为克隆载体的质粒应具备以下特点作为克隆载体的质粒应具备以下特点: :分子量小，稳定存在，较高拷贝数；分子量小，稳定存在，较高拷贝数；遗传标志；遗传标志；内切酶点。内切酶点。分子生物学研究方法分子生物学研究方法（1）pBR322质粒载体质粒载体123来源于来源于pSF2124pSF2124质质粒转座子粒转座子Tn3Tn3的氨的氨苄青霉素抗性基苄青霉素抗性基因（因（ampampr r）来源于来源于pSC101pSC101质粒的四环素质粒的四环素抗性基因抗性基因（terttertr r）来源于来源于ColE1ColE1的派生质粒的派生质粒pMB1pMB1的的DNADNA复制起点（复制起点（oriori）分子生物学研究方法分子生物学研究方法（2）pUC质粒载体质粒载体氨苄青霉氨苄青霉素抗性基素抗性基因因(ampr)，大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖酶基因半乳糖酶基因( (lacZlacZ) )的启动的启动子及其编码子及其编码-肽链的肽链的DNADNA序列序列位于位于lacZlacZ基基因中的靠近因中的靠近5-5-端的一端的一段多克隆位段多克隆位点点( (MCS)MCS)区区段，它并不段，它并不破坏该基因破坏该基因的功能。的功能。来自来自pBR322pBR322质粒的复制质粒的复制起点（起点（oriori）分子生物学研究方法分子生物学研究方法（3）pGEM-3Z质粒质粒分子生物学研究方法分子生物学研究方法2 2、噬菌体噬菌体 （1 1）噬菌体的生物学特性）噬菌体的生物学特性溶菌周期溶菌周期指噬菌体将指噬菌体将DNADNA注入寄主细胞后很快环化，然后注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。( (烈性噬烈性噬菌体只具有溶菌生长周期菌体只具有溶菌生长周期) )溶源周期溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体中，注入寄主细胞的噬菌体DNADNA是整合到寄主细是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。( (温温和噬菌体具有溶源生长周期和溶菌生长周期和噬菌体具有溶源生长周期和溶菌生长周期) )分子生物学研究方法分子生物学研究方法（2 2）噬菌体噬菌体A. A. 生物学特性生物学特性 组成组成：蛋白质外壳和线：蛋白质外壳和线状双链状双链DNADNA分子组成。分子组成。 DNADNA长度为长度为48502bp48502bp，在，在分子两端各有分子两端各有1212个碱基的个碱基的单链互补粘性末端。当其单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的端的互补作用形成双链的环形环形DNADNA分子。上述通过分子。上述通过粘性末端互补形成的双链粘性末端互补形成的双链区被称为区被称为coscos位点位点（cohesive end sitecohesive end site）。）。分子生物学研究方法分子生物学研究方法 温和噬菌体温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。期。 复制复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是溶菌周期的早期是“”复制，晚期进行滚环复制复制，晚期进行滚环复制 基因组成基因组成 DNADNA至少包括至少包括6161个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1 13 3为非必须区段。为非必须区段。 分子生物学研究方法分子生物学研究方法B. B. 类型类型插入型插入型 （Insertion vectors Insertion vectors ）这种载体仅仅有一个可供外源这种载体仅仅有一个可供外源DNADNA插入的克隆位点。插入的克隆位点。如：如：gt10 gt10 、 gt11 gt11 克隆能力小，不到克隆能力小，不到10kb10kb置换型置换型 （Replacement vectorsReplacement vectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的DNADNA区段是区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNADNA取代。取代。如如CharonCharon 4 4 载体载体克隆能力大，克隆能力大，202025kb25kb分子生物学研究方法分子生物学研究方法（3 3）M13M13噬茵体噬茵体A.A.生物学特性生物学特性B.B.单链闭合环状噬菌体单链闭合环状噬菌体只能感染雄性细菌，外形只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组成丝状，基因组DNADNA长长约约6.4kb6.4kb，可分为，可分为1010个个区和区和507 507 bpbp基因间隔区基因间隔区（ISIS区），该区可以接区），该区可以接受外源受外源DNADNA的插入而不的插入而不会影响到噬菌体的活力。会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单这是该噬菌体能用于单链链DNADNA载体的重要前提。载体的重要前提。分子生物学研究方法分子生物学研究方法复制与增殖复制与增殖进入细胞内部的进入细胞内部的M13M13（）链（）链DNADNA，便，便起到一种模板的作用，合成出互补的起到一种模板的作用，合成出互补的（一）链（一）链 DNADNA。由此形成的双链形式。由此形成的双链形式的的M13DNAM13DNA，称为复制型，称为复制型 DNADNA。它按。它按形式进行几轮复制之后，基因形式进行几轮复制之后，基因 的产的产物便在物便在RFDNARFDNA的正链待定位点上作切割的正链待定位点上作切割反应，形成一个缺口。这样，反应，形成一个缺口。这样，M13M13基因基因组的扩增活动便正式开始启动。其基组的扩增活动便正式开始启动。其基本特点是利用大肠杆菌的本特点是利用大肠杆菌的DNADNA聚合酶聚合酶I I，以环形的，以环形的MI3MI3（一）（一）DNADNA为模板合成为模板合成 M13M13（）（）DNADNA。当。当DNADNA复制叉沿着模板复制叉沿着模板DNADNA分子转移到复制终点时，在基因分子转移到复制终点时，在基因编码产物的作用下，新合成的（十）编码产物的作用下，新合成的（十）DNADNA便会被切除下去，并进一步环化形便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的成单位长度的 M13M13基因组基因组DNA DNA 分子生物学研究方法分子生物学研究方法3 3、柯斯质粒载体、柯斯质粒载体柯斯柯斯质粒质粒(cosmid)(cosmid)又称又称粘粒，是由粘粒，是由DNADNA的的coscos区与质粒重新构建的载区与质粒重新构建的载体，具有质粒相同的结体，具有质粒相同的结构特点，为双链、环状构特点，为双链、环状DNADNA。“cosmidcosmid”一词是一词是由英文由英文“cos site-cos site-carrying plasmidcarrying plasmid”缩缩写而成的，其原意是指写而成的，其原意是指带有粘性末端位点的质带有粘性末端位点的质粒。因此我们说，所谓粒。因此我们说，所谓柯斯质粒其实是一类由柯斯质粒其实是一类由人工构建的含有人工构建的含有DNADNA的的coscos序列和质粒复制子的序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。特殊类型的质粒载体。 分子生物学研究方法分子生物学研究方法柯斯质粒柯斯质粒具有下列具有下列特点特点： 具有质粒载体的特性。具有质粒载体的特性。 带有带有噬菌体的粘性末端噬菌体的粘性末端(cos(cos区区) )。 一个或多个酶切位点。一个或多个酶切位点。 具有高容量的克隆能力。具有高容量的克隆能力。 非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装，非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装，因而有利于重组体的筛选。因而有利于重组体的筛选。 分子生物学研究方法分子生物学研究方法4 4、病毒载体、病毒载体类型：类型：1 1、重组型病毒载体、重组型病毒载体 2 2、无病毒基因的病毒载体、无病毒基因的病毒载体 复制缺陷型复制缺陷型 可复制型可复制型 复制缺陷型复制缺陷型组成：组成：1 1、病毒复制和包装元件、病毒复制和包装元件 2 2、病毒基因、病毒基因 3 3、插入的外源基因或元件、插入的外源基因或元件 4 4、病毒外壳、病毒外壳/ /外膜外膜 分子生物学研究方法分子生物学研究方法常用的病毒载体的特点：常用的病毒载体的特点：病毒载体病毒载体生物学特性生物学特性适用范围适用范围反转录病毒载体反转录病毒载体单链单链RNA病毒病毒810kb可感染分裂细胞；可感染分裂细胞；整合到染色体中；整合到染色体中；表达时间较长；表达时间较长；有致癌的危险；有致癌的危险；Exvivo基因治疗；基因治疗；肿瘤基因治疗。肿瘤基因治疗。腺病毒载体腺病毒载体双链双链DNA病毒病毒36kb可感染分裂和非分裂细胞；可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；外源基因表达水平高；表达时间较短；表达时间较短；免疫原性强；免疫原性强；Invivo基因治疗；基因治疗；肿瘤基因治疗；肿瘤基因治疗；疫苗。疫苗。AAV病毒载体病毒载体单链单链DNA病毒病毒5kb可感染分裂和非分裂细胞；可感染分裂和非分裂细胞；整合到染色体中；整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；可长期表达外源基因；在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高；织中表达较高；Invivo基因治疗；基因治疗；Exvivo基因治疗；基因治疗；遗传病基因治疗；遗传病基因治疗；获得性慢性疾病的获得性慢性疾病的基因治疗。基因治疗。HSV病毒载体病毒载体双链双链DNA病毒病毒152kb具有嗜神经性；可逆轴突传递；具有嗜神经性；可逆轴突传递；可潜伏感染；可潜伏感染；容量大；容量大；可感染分裂和非分裂细胞；可感染分裂和非分裂细胞；神经系统疾病的基神经系统疾病的基因治疗；因治疗；肿瘤的基因治疗。肿瘤的基因治疗。分子生物学研究方法分子生物学研究方法优点：优点：1 1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2 2、复杂的装配过程由细胞完成；、复杂的装配过程由细胞完成； 3 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。、不同的病毒载体具有不同的表达特点。分子生物学研究方法分子生物学研究方法二、质粒二、质粒DNADNA的提取的提取1 1、细菌的收获、细菌的收获含相应抗生素的液体培养基里培养含相应抗生素的液体培养基里培养1.5ml1.5ml离心管离心管离心沉淀细胞离心沉淀细胞2 2、细菌的裂解、细菌的裂解（1 1）碱裂解法）碱裂解法（2 2）煮沸法）煮沸法分子生物学研究方法分子生物学研究方法（1 1）碱裂解法）碱裂解法碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNADNA的方法，是根据的方法，是根据BirnboimBirnboim和和DolyDoly（19791979）以及）以及Ish-HorowiczIsh-Horowicz和和BurkeBurke（19811981）的）的方法修订而成。方法修订而成。优点优点：收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足：收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的多数的DNADNA重组操作。重组操作。基本原理基本原理：当菌体在：当菌体在NaOHNaOH和和SDSSDS溶液中裂解时，蛋白质与溶液中裂解时，蛋白质与DNADNA发发生变性，当加入中和液后，质粒生变性，当加入中和液后，质粒DNADNA分子能够迅速复性，呈溶解分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNADNA不复性而呈絮状，不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液离心时可沉淀下来。用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒中的质粒DNADNA。十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠（SDSSDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。分子生物学研究方法分子生物学研究方法纯化质粒纯化质粒DNADNA的方法通常是利用了质粒的方法通常是利用了质粒DNADNA相对较小及共相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯价闭环两个性质。例如，氯化铯- -溴化乙锭梯度平衡离心、溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNADNA，经过苯酚、氯仿抽提，经过苯酚、氯仿抽提，RNARNA酶消化和乙醇沉淀等简酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和单步骤去除残余蛋白质和RNARNA，所得纯化的质粒，所得纯化的质粒DNADNA已可已可满足细菌转化、满足细菌转化、DNADNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。三、质粒三、质粒DNADNA的纯化的纯化分子生物学研究方法分子生物学研究方法上清液上清液加入固体加入固体CsCl与与EtBr溶液溶液室温室温下超速离心下超速离心(45,000rpm）16小时小时穿孔取出穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭异丙醇抽提溴乙锭缓冲缓冲液透析除去残余液透析除去残余CsCl两倍体积冷乙醇沉淀两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥离心、洗涤、干燥氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法实验表明，在细胞裂解及实验表明，在细胞裂解及DNADNA分离的过程中，大分子量的细分离的过程中，大分子量的细菌染色体菌染色体DNADNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNADNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。这种差别对质粒这种差别对质粒DNADNA的纯化是十分有用的。的纯化是十分有用的。分子生物学研究方法分子生物学研究方法缺点缺点 通过氯化铯通过氯化铯- -EtBrEtBr密度梯度离心法虽然可密度梯度离心法虽然可以得到高纯度、高质量的质粒以得到高纯度、高质量的质粒DNADNA，但它但它操作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速操作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速离心机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌离心机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌物质，如果操作不慎，不仅会造成环境污物质，如果操作不慎，不仅会造成环境污染，还会危及实验工作人员的身心健康。染，还会危及实验工作人员的身心健康。分子生物学研究方法分子生物学研究方法 根据限制酶的识别切割特性，根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶催化条件及是否具有修饰酶活性可分为活性可分为、型三大类。型三大类。 类和类和类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖作用及依赖ATPATP的限制性内切酶活性。的限制性内切酶活性。 类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。异性切割末端。 类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。下来。 故故类和类和类酶在基因工程中基本不用。类酶在基因工程中基本不用。1 1、限制酶的类型、限制酶的类型四、四、DNADNA酶切酶切分子生物学研究方法分子生物学研究方法型酶型酶 型酶就是通常指的限制性内切酶型酶就是通常指的限制性内切酶. . 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；切割，产生特异的片段； 型酶分子量较小，仅需型酶分子量较小，仅需MgMg2+2+作为催化反应的辅助因子，作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序； 型内切酶切割双链产生种不同的切口型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出；端突出和平末端。端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。动了分子生物学的兴旺和发展。分子生物学研究方法分子生物学研究方法分子生物学研究方法分子生物学研究方法（一）（一） DNADNA的连接的连接1 1、DNADNA连接酶连接酶T4 DNAT4 DNA连接酶（需要连接酶（需要ATPATP作为辅助因子）主要用于：（作为辅助因子）主要用于：（1 1）连接）连接具有同源互补粘性末端的片段；（具有同源互补粘性末端的片段；（2 2）双链）双链DNADNA分子间的分子间的平端；（平端；（3 3）在双链平端的）在双链平端的DNADNA分子上添加合成的人工接头或适分子上添加合成的人工接头或适配子。配子。2 2、粘性末端连接、粘性末端连接连接后可能出现以下问题：（连接后可能出现以下问题：（1 1）载体自身环化，造成假阳性）载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将载体背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA 5- DNA 5- 端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；（生连接；（2 2）插入片段可双向插入；（）插入片段可双向插入；（3 3）插入片段可多拷贝）插入片段可多拷贝插入。插入。五、五、DNADNA的连接和转化的连接和转化分子生物学研究方法分子生物学研究方法3 3、平端连接、平端连接平端连接的优点是可用平端连接的优点是可用T4T4连接酶连接任何连接酶连接任何DNADNA平端，这对不同平端，这对不同DNADNA分子的连接十分有利。分子的连接十分有利。平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的较多的T4 DNAT4 DNA连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（）连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（）可促进平端连接反应。可促进平端连接反应。4 4、人工接头连接、人工接头连接5 5、利用适配子连接、利用适配子连接分子生物学研究方法分子生物学研究方法（二）重组（二）重组DNADNA的转化的转化1 1、转化转化指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态即容转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态即容易接受外源易接受外源DNADNA的状态，然后利用短暂热休克使的状态，然后利用短暂热休克使DNADNA导入细导入细菌宿主中。菌宿主中。此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。化效率高、适用于任何菌株。分子生物学研究方法分子生物学研究方法（1 1）将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（）将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（00）预处理的）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。步骤：步骤：（2 2）与转化混合物中的外源）与转化混合物中的外源DNADNA形成粘附在细胞表面的复合形成粘附在细胞表面的复合物。物。（3 3）立即将该体系转移到）立即将该体系转移到4242下做短暂的热刺激，复合物便下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。会被细胞所吸收。分子生物学研究方法分子生物学研究方法（5 5）涂布于选择性培养基中分离）涂布于选择性培养基中分离转化子。转化子。（4 4）在全培养基中生长一段时间）在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性使转化基因实现表达、细胞活性恢复恢复分子生物学研究方法分子生物学研究方法2 2、转染和感染转染和感染感染：在体外将噬菌体感染：在体外将噬菌体DNADNA包装成病毒颗粒，然后使其包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。感染受体菌。转染：在转染：在DNADNA连接酶作用下使噬菌体连接酶作用下使噬菌体DNADNA环化，再象重环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNADNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。 分子生物学研究方法分子生物学研究方法（一）抗药性标志的筛选（一）抗药性标志的筛选（二）（二）半乳糖苷酶系统筛选半乳糖苷酶系统筛选（三）菌落快速裂解鉴定法（三）菌落快速裂解鉴定法（四）内切酶图谱鉴定（四）内切酶图谱鉴定（五）通过聚合酶链反应筛选重组子（五）通过聚合酶链反应筛选重组子（六）菌落或噬菌斑原位杂交（六）菌落或噬菌斑原位杂交六、重组质粒的筛选和鉴定六、重组质粒的筛选和鉴定分子生物学研究方法分子生物学研究方法第四节第四节分子杂交技术分子杂交技术杂交杂交( (hybridization) hybridization) ：来源不同的来源不同的两条彼此的链重新缔两条彼此的链重新缔合成为双螺旋结构的过程。合成为双螺旋结构的过程。（注意与复性的区别）（注意与复性的区别）分子生物学研究方法分子生物学研究方法在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的的DNA或或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印吸印”上上去的，因此，核酸杂交也被称为去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交印迹杂交”。分子杂交是目前分子生物学最广泛应用的技术之一。利分子杂交是目前分子生物学最广泛应用的技术之一。利用此技术，可以求出特定基因的频率、基因组织的特点、用此技术，可以求出特定基因的频率、基因组织的特点、基因结构和定位、基因表达等。基因结构和定位、基因表达等。 电泳凝胶核酸印迹法、电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法菌落和噬菌斑印迹法分子生物学研究方法分子生物学研究方法E.M.Southern于于1975年首先设计出来的年首先设计出来的。材料：材料：尼龙滤膜尼龙滤膜硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜二乙氨基乙基纤维素滤膜（二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAEDEAE）步骤：步骤：第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上核酸印迹转移核酸印迹转移第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的标记的DNA探针进行杂交探针进行杂交一、一、SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交分子生物学研究方法分子生物学研究方法Southern BlottingSouthern Blotting的过程的过程1.1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNADNA2.2.通过电泳液的移动转移胶中的通过电泳液的移动转移胶中的DNADNA3.3.固定胶中的固定胶中的DNADNA4.4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测）预杂交和杂交（放射性和荧光检测）5.5.结果检测结果检测分子生物学研究方法分子生物学研究方法二、二、NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交是将是将RNARNA分子从电泳凝分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验核酸杂交的一种实验方法。方法。分子生物学研究方法分子生物学研究方法三、斑点杂交三、斑点杂交 分子生物学研究方法分子生物学研究方法Step 1. Antibody Recognitionof target protein/antigenStep 2. Secondary Antibodyrecognition of primary AbStep 3. Color Development四、四、WesternWestern印迹杂交印迹杂交分子生物学研究方法分子生物学研究方法五、原位杂交（教材五、原位杂交（教材P175P175） 组织原位杂交简称原位杂交（组织原位杂交简称原位杂交（in situ in situ hybridizationhybridization），），是在细胞保持基本形态的是在细胞保持基本形态的情况下将探针注入细胞内与情况下将探针注入细胞内与RNARNA或或DNADNA杂交，杂杂交，杂交反应在载物片上的细胞内进行。交反应在载物片上的细胞内进行。基本步骤是通过适当处理使细胞渗透性增加，基本步骤是通过适当处理使细胞渗透性增加，探针进入细胞内与探针进入细胞内与DNADNA或或RNARNA杂交、冲洗等。杂交、冲洗等。用放射自显影或免疫酶法或荧光显示杂交结用放射自显影或免疫酶法或荧光显示杂交结果。果。分子生物学研究方法分子生物学研究方法LocalizationofDNALocalizationofRNA分子生物学研究方法分子生物学研究方法六、基因芯片六、基因芯片基因芯片（基因芯片（Gene ChipGene Chip）通常指）通常指DNADNA芯片，芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。断样品中靶分子的数量。 ( (教材教材p.214-218)p.214-218)分子生物学研究方法分子生物学研究方法（一）基因芯片的种类（一）基因芯片的种类1 1、光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列、光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列2 2、微电子芯片、微电子芯片3 3、微量点样技术、微量点样技术4 4、其他技术、其他技术分子生物学研究方法分子生物学研究方法（二）应用领域（二）应用领域1 1、科研领域、科研领域2 2、生物制药领域、生物制药领域3 3、医学诊断、医学诊断分子生物学研究方法分子生物学研究方法七、酵母杂交技术七、酵母杂交技术（一）酵母双杂交技术（一）酵母双杂交技术1 1、基本原理、基本原理2 2、改进和发展、改进和发展( (教材教材p.206-208)p.206-208)分子生物学研究方法分子生物学研究方法分子生物学研究方法分子生物学研究方法（二）酵母单杂交技术（二）酵母单杂交技术1 1、酵母单杂交技术的原理、酵母单杂交技术的原理2 2、酵母单杂交技术的应用、酵母单杂交技术的应用分子生物学研究方法分子生物学研究方法第五节、基因扩增与定点突变技术第五节、基因扩增与定点突变技术一、聚合酶链式反应（一、聚合酶链式反应（PCRPCR）( (教材教材p.165-170)p.165-170)分子生物学研究方法分子生物学研究方法（一）（一）PCRPCR反应中的主要成份反应中的主要成份1 1、DNADNA模板模板2 2、dNTPsdNTPs3 3、引物、引物4 4、Mg+Mg+6 6、反应缓冲液、反应缓冲液5 5、DNADNA聚合酶聚合酶分子生物学研究方法分子生物学研究方法引物设计和选择目的引物设计和选择目的DNADNA序列区域时可遵循下列原则序列区域时可遵循下列原则：(1)(1) 长度约为长度约为16-30bp;16-30bp;(2)(2) G+C G+C含量通常为含量通常为40%-60%;40%-60%;(3)(3) 四种碱基应随机分布四种碱基应随机分布; ;(4)(4) 3 3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位(5)(5)核苷酸对应核苷酸对应, , 以减少由于密码子摆动产生的不配对以减少由于密码子摆动产生的不配对; ;(5)(5) 在引物内在引物内, , 尤其在尤其在33端应不存在二级结构端应不存在二级结构; ;(6)(6) 两引物之间尤其在两引物之间尤其在33端不能互补端不能互补; ;(7)(7) 5 5端可增加酶切位点端可增加酶切位点; ;(8)(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补引物不与模板结合位点以外的序列互补; ;(9)(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子。简并引物应选用简并程度低的密码子。分子生物学研究方法分子生物学研究方法Target Sequence（二）二）PCRPCR反应参数反应参数1 1、变性、变性分子生物学研究方法分子生物学研究方法Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 2535535332 2、退火、退火分子生物学研究方法分子生物学研究方法Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase3 3、延伸、延伸分子生物学研究方法分子生物学研究方法Target SequenceTarget Sequence4 4、循环次数、循环次数 分子生物学研究方法分子生物学研究方法片段扩增倍数片段扩增倍数 No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon分子生物学研究方法分子生物学研究方法（三）（三）PCRPCR产物的克隆产物的克隆1.1.平末端连接：由于平末端连接：由于TaqTaq DNA DNA聚合酶往往在聚合酶往往在PCRPCR产物产物33端加上多余的非模板依赖碱基，在用平末端连端加上多余的非模板依赖碱基，在用平末端连接克隆接克隆PCRPCR产物前，可用产物前，可用KlenowKlenow片段或片段或T4 DNAT4 DNA聚合聚合酶处理补平末端。酶处理补平末端。2. 2. 在在PCRPCR产物尾部加产物尾部加dTdT或或ddTddT：TaqTaq DNA DNA聚合酶会在聚合酶会在33端加上多余的非模板依赖碱基，而且对端加上多余的非模板依赖碱基，而且对A A优先聚优先聚合，所以合，所以PCRPCR产物末端的多余碱基大部分都是产物末端的多余碱基大部分都是A A。3. 3. 粘性末端连接：利用引物中附加在粘性末端连接：利用引物中附加在55端的限制酶位端的限制酶位点，直接将点，直接将PCRPCR产物经适当的限制酶切割后产生粘产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组性末端，与载体连接，产生重组DNADNA。 分子生物学研究方法分子生物学研究方法二、二、RT-PCR反转录反转录PCRPCR1 1、利用、利用mRNAmRNA作模板，作模板，在反转录酶的作用下，在反转录酶的作用下，合成合成cDNAcDNA。2 2、以以cDNAcDNA为模板，进为模板，进行行PCRPCR扩增反应。扩增反应。AAA(A)nAAA(A)nTTTTTTTTTTTT反转录酶反转录酶AAA(A)nAAA(A)nTTTTTTTTTTTTS1核酸酶核酸酶碱碱TTTTTTTTTTTTKlenow+dNTPsKlenow+dNTPs+ +缓冲液缓冲液TTTTTTTTTTTT双链双链cDNAcDNA分子生物学研究方法分子生物学研究方法三、定点突变（三、定点突变（site-directed mutagenesissite-directed mutagenesis）1 1、盒式诱变、盒式诱变(cassette mutagenesis)(cassette mutagenesis)，包括盒式取，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。( (教材教材p.197-200)p.197-200)分子生物学研究方法分子生物学研究方法2 2、寡核苷酸引物诱变、寡核苷酸引物诱变 分子生物学研究方法分子生物学研究方法3 3、PCRGPCRG与与PCRPCR诱变诱变 分子生物学研究方法分子生物学研究方法