显微镜技术细胞的分离和培养细胞组分的分离和纯化技术 细胞化学和细胞内分子示踪技术 细胞功能基因组学技术（Functional genomics） 其他技术（Other techniques） 显微成像技术帮助人们在不同的层次观察和研究组织、细胞的活动及其规律。 光学显微镜光学显微镜显示显微结构（microscopic structure）,分辨率极限为0.2m。 电子显微镜电子显微镜显示亚微结构（submicroscopic structure）或称超微结构(ultrastructure），分辨率极限为0.2nm 。（一）显微镜技术（一）显微镜技术常用的光学显微镜普通光学显微镜 (light microscope)相差显微镜 (phase contrast microscope)微分干涉差显微镜 (differential interference contrast microscope)荧光显微镜 (fluorescent microscope)激光扫描共聚焦显微镜 (laser scanning confocal microscope)光学显微镜 相差显微镜 利用光的衍射和干涉特性，将穿过样品的可见光的相位差转换为振幅差（明暗差），提高样品结构的明暗对比度。四种不同的光镜成像技术下显示的成纤维细胞图像。 A.亮视野显微镜 B.相差显微镜C.Normarski相差显微镜 D.暗视野显微镜光学显微镜 荧光显微镜A 激光经过针孔聚焦于样品的一点上。B 从样品点上发出的荧光聚焦于针孔到达检测器。C 从样品的其他部位发出的光线不能聚焦于针孔处，检测器无法检测，因此不能成像。激光扫描共聚焦显微镜图像及计算机三维重建图像荧光显微镜与共聚焦显微镜的成像效果对比常用的电子显微镜透射电子显微镜 (transmission electron microscope)扫描电子显微镜 (scanning electron microscope)高压电子显微镜 (high voltage electron microscope)扫描隧道显微镜 (scanning tunneling microscope)原子力显微镜 (atomic force microscope)透射电镜：细胞内部微细结构扫描电镜：样品的表面形态电镜与光镜的光路原理类似，光源为电子束，透镜为电磁场。 扫描隧道显微镜、X线衍射技术和原子力显微镜等成像方法使研究者能在分子水平探索细胞的微细结构及其功能。使器官和细胞在模拟体内环境的实验状况下生长，有利于探索生命的基本活动规律并获得大量的特定的细胞。 （二）不同类型细胞的体外培养 细胞体外培养所需的条件无菌操作温度，O2，CO2，培养基原代培养和细胞建系原代培养 基本方法：组织块法，消化法，悬浮培养法 应用：药物测试，细胞分化等实验；建立可长期培养的细胞系。细胞建系 来源于原代培养 能够在体外进行有限或无限的传代次数 为研究提供大量的遗传性质稳定的细胞材料细胞传代，冻存和复苏 细胞融合（cell fusion)又称细胞杂交（cell hybridization），是指用自然或人工的方法使两个或几个不同遗传背景的细胞融合为一个细胞的过程。细胞融合产生杂交瘤细胞系细胞融合产生多能干细胞将细胞及其组分进行分离和纯化，用于研究某一类细胞或细胞组分的特点和功能。（三）细胞及其组分的分离和纯化技术细胞的分离纯化 免疫磁珠技术 流式细胞分选技术 激光捕获显微切割技术 细胞组分和生物大分子的分离纯化 离心分离技术 核酸分离技术 蛋白质分离技术细胞的分离纯化- 免疫磁珠技术 免疫磁珠技术特异性高，并能保持分离细胞的活性 细胞的分离纯化- 流式细胞分选技术流式细胞技术（flow cytometry）用荧光抗体与相应抗原结合，标定欲分离的细胞或细胞器，再通过自动化的激光/光电检测系统高速检测移动中的细胞悬液荧光，从混合的细胞群体中分选出特定的目标细胞。 细胞的分离纯化- 激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术可从组织切片上获得目标细胞不同的细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数差速离心法等密度离心法 移动区带离心法：*介质密度颗粒密度*密度梯度仅有轻微差别*离心时间不可太长 蛋白质分离技术SDS-PAGE电泳分离技术层析技术：亲和层析，离子交换层析蛋白质分离技术SDS-PAGE电泳分离技术蛋白质分离技术亲和层析依赖于专一的识别和亲和力（抗原/抗体，酶/底物，受体/配体）层析技术（chromatography）是根据蛋白质的形态、大小和电荷的差异来进行分离的方法，能纯化并获得非变性的、天然状态的蛋白质。 蛋白质分离技术离子交换层析利用蛋白质所带的电荷差异进行分离纯化核酸分离技术- DNA分离纯化基因组DNA分离质粒DNA分离琼脂糖电泳分离特定DNA片段核酸分离技术- DNA分离纯化基因组DNA分离DNA产物100-150kb；适用于PCR, Southern blot，基因组文库构建等。核酸分离技术- DNA分离纯化质粒DNA分离DNA产物适用于PCR, 测序，克隆等。碱裂解法：碱裂解细菌培养物上清：质粒DNA沉淀：基因组DNA乙醇沉淀分离纯化核酸分离技术- DNA分离纯化琼脂糖电泳分离及回收DNA片段核酸分离技术- RNA分离纯化细胞中常见的RNA：mRNA, rRNA, tRNA, 小RNARNA的提取，应注意避免RNA酶污染- 对细胞及组织的生物大分子进行定性、定位和定量的研究（三）原位组分显示技术酶细胞化学技术免疫细胞化学技术原位杂交技术放射自显影技术荧光蛋白示踪技术酶细胞化学技术- 酶类显示原理：细胞内原位的酶类+底物 初级反应产物 捕获反应呈色优点：简单直接，不需要抗原-抗体反应缺点：特异性不够高，定位不够准确-半乳糖苷酶（ -galactosidase)染色显示发生衰老(senescent)的细胞免疫细胞化学技术- 生物大分子定性和定位原理：抗原+抗体免疫复合物直接或间接呈色优点：特异性强，灵敏度高，可作多重标记缺点：特异性抗体不易得到神经细胞的免疫荧光染色原位杂交- 显示特异的核酸分子原理：人工合成的核酸探针 分子杂交（碱基互补）原位显示细胞内的核酸分子优点：特异性高，定位准确缺点：对实验条件要求高，操作较复杂X染色体活性状态21号染色体三体原位杂交检测全胚胎及胚胎切片上特异基因的活性放射自显影技术- 动态追踪原理：放射性核素标记合成生物大分子的前体物质追踪/显影优点：活细胞状态下进行动态追踪缺点：特异性不高追踪：3H-亮氨酸，35S蛋氨酸蛋白质3H-甘露糖/岩藻糖糖类3H-TdR/3H-UR DNA/RNA显影胰岛B细胞电镜放射自显影结果 A. 10分钟 B. 45分钟PET-CT 显示肿瘤定位荧光蛋白示踪技术原理：荧光蛋白与目标蛋白融合荧光显微镜观察定位优点：活细胞状态下进行动态追踪，信号稳定缺点：融合蛋白非细胞内源物质（五）细胞功能基因组学技术基因表达的定量分析 PCR技术（扩增，定性） 荧光实时定量PCR(半定量） Southern blot技术（定性） Northern blot技术（定性） 基因芯片技术（定性，定量）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是利用DNA半保留复制的原理，通过控制实验温度，使DNA处于变性、复性和合成的反复循环中，从而达到在体外快速扩增特异性DNA片段的目的。应用：DNA的扩增，DNA/RNA的定性，定量主要用于分析基因组DNA：基因结构，突变，同源性，基因型鉴定，多态性等。主要用于分析RNA：基因鉴定，基因表达水平检测。操作过程与Southern blot类似。RNA变性高通量、快速检测基因表达： 基因表达谱，突变，多态性，发现新基因，基因型鉴定（五）细胞功能基因组学技术基因表达的上调和下调技术 1. 外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要方式 2. RNA干扰技术是 下调基因表达的常用方法 3. CRISPR基因编辑技术可上调或完全敲除特定基因RNAi技术可以简便而迅速地制备特定基因缺失表型的个体，进而研究该基因的功能。 RNAi技术建立的显性阴性突变 A. 双链RNA可以被导入到C.elegans （1）用表达双链RNA的大肠埃希菌喂食蠕虫。（2）直接把双链RNA注入到蠕虫肠道内。B. 野生型蠕虫胚。C. 一个蠕虫胚内与细胞分裂相关基因被双链RNA干扰失活。图中胚显示两个未融合的精子和卵子的细胞核异常位移。 CRISPR技术（五）细胞功能基因组学技术蛋白质相互作用的研究技术 1. 免疫沉淀 2. 酵母双杂交 3. 噬菌体展示（五）细胞功能基因组学技术蛋白质与核酸相互作用的研究技术 1. 染色质免疫沉淀技术研究DNA与蛋白质相互作用 2. 紫外交联免疫沉淀研究RNA与RNA结合蛋白相互作用染色质免疫沉淀技术研究DNA与蛋白质相互作用IP3 adapter ligationSDS-PAGE andmembrane transferRNA extractionRTUrea PAGEDNA circularizationBamH1 digestion, PCRKonig et al. (2011) J. Vis. Exp 5 radiolabeling紫外交联免疫沉淀研究RNA与RNA结合蛋白相互作用（五）细胞功能基因组学技术生物芯片技术蛋白质组学技术高通量测序技术生物芯片技术蛋白质组学技术 蛋白质双向电泳 蛋白质谱法高通量测序技术常用的模式生物多能干细胞的体外分化和应用目标体细胞核移植组织工程皮肤的制备多学科结合的技术三要素：细胞，支架，生长信号显微镜技术细胞的分离和培养细胞组分的分离和纯化技术 细胞化学和细胞内分子示踪技术 细胞功能基因组学技术（Functional genomics） 其他技术（Other techniques） 1.翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学.第三版.北京:高等教育出版社，20072.胡以平.医学细胞生物学.北京:高等教育出版社，20093.王金发.细胞生物学.北京:科学出版社，20034.Alberts B, et al. Molecular Biology of the Cell M.5th ed. NEW YORK&LONDON:Garland Publishing,Inc,2008.CellNatureScienceEMBOAnnual Review of Cell BiologyTrends in Cell BiologyCell Research科学通报中国科学 1.何为细胞培养与细胞融合？.列举三种常见的显微镜技术，说明相关的原理与应用特点。.请说明原位杂交与免疫细胞化学技术的原理，并比较两者的联系与区别。.请阐述流式细胞技术的原理并说明其应用特点。