微生物基本操作技术微生物基本操作技术中国工业微生物菌种保藏管理中心中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC姚姚 粟粟1高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 内内 容容n微生物分类微生物分类n微生物接种和培养微生物接种和培养n微生物的分离微生物的分离n微生物的鉴定微生物的鉴定n微生物保藏微生物保藏n质控微生物质控微生物2高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 一、微生物分类一、微生物分类3高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 一、微生物分类一、微生物分类-微生物的进化和多样性微生物的进化和多样性普遍性系统发育树普遍性系统发育树,亲缘关系根据亲缘关系根据rRNA序列比较来决定。序列比较来决定。G. J. Olsen and C. R. Woese, Ribosomal RNA: A key to Phylogeny in the FASEB Journal, 7:113-123,19934高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 一、微生物分类一、微生物分类n原核生物原核生物大小:0.5-3mm形状:n-球型(Sthaphylococcus)n-棒状(Escherichia coli)n-螺旋(Rhodospirillum)生长迅速，20min至几小时可繁殖一代可利用多种碳源n真核生物真核生物细胞器：n线粒体n内质网n高尔基体n液泡5高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 一、微生物分类一、微生物分类http:/micro.magnet.fsu.edu/cells/animals/images/animalcell.jpghttp:/www.microscopy.fsu.edu/cells/procaryotes/images/procaryote.jpg6高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n原核生物原核生物一、微生物分类一、微生物分类7高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n真核生物真核生物一、微生物分类一、微生物分类8高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 一、微生物分类一、微生物分类-多相分类多相分类n表征（表型）特征表征（表型）特征形态特征生理和代谢特征生态特征n遗传（基因型）特征遗传（基因型）特征蛋白质比较核酸碱基组成核酸序列多相分类多相分类Polyphasic Texonomy Technology9高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 一、微生物分类一、微生物分类-微生物的分类等级微生物的分类等级n“种种”是微生物分类中最基本的分是微生物分类中最基本的分类单元。类单元。n“种种” 的定义：一个种（基因型种）的定义：一个种（基因型种）是有相似是有相似G+C组成并通过组成并通过DNA杂杂交试验判断由交试验判断由70%或更大相似性或更大相似性的菌株的集合。的菌株的集合。n分类等级界（Domain）门（Phylum）纲（Class）目（Order）科（Family）属（Genus）种（Species）10高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养11高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养q微生物接种定义微生物接种定义 将微生物的纯种或含菌材料（如水、食品、空气、土壤、排泄物等）转将微生物的纯种或含菌材料（如水、食品、空气、土壤、排泄物等）转移到培养基上，这个操作过程叫微生物的接种。移到培养基上，这个操作过程叫微生物的接种。q接种工具接种工具 q微生物接种技术分类微生物接种技术分类斜面接种斜面接种液体接种液体接种穿刺接种穿刺接种平板接种平板接种12高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养n斜面接种斜面接种左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平；左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平；右手先将棉塞（硅胶塞）拧转松动，再拿接种环；右手先将棉塞（硅胶塞）拧转松动，再拿接种环；用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上灼烧；焰上灼烧；接种环灼烧灭菌后插入试管内，冷却、挑菌，转入另一斜面底部，接种环灼烧灭菌后插入试管内，冷却、挑菌，转入另一斜面底部，沿斜面划曲线或直线。沿斜面划曲线或直线。13高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养14高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养n液体接种液体接种操作方法与斜面接种基本一致，只是将接种环送入液体培养基中操作方法与斜面接种基本一致，只是将接种环送入液体培养基中时使接种环与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散；时使接种环与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散；塞上棉塞，轻轻摇动均匀；塞上棉塞，轻轻摇动均匀；如果菌种培养在液体培养基中，使用移液管或滴管接种。如果菌种培养在液体培养基中，使用移液管或滴管接种。15高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养16高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 三、微生物接种和培养三、微生物接种和培养n穿刺接种穿刺接种用接种针调取菌种后，插入深层固体培养基内（不要刺到底部），用接种针调取菌种后，插入深层固体培养基内（不要刺到底部），再沿原路拔出；再沿原路拔出；此法用于厌气性细菌接种，检查细菌的运动能力。此法用于厌气性细菌接种，检查细菌的运动能力。17高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养18高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养n平板接种平板接种平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，以及活菌计数平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，以及活菌计数等；等；n平板接斜面：平板分散的单菌落接于斜面；平板接斜面：平板分散的单菌落接于斜面；n斜面接平板：点种法、划线法。斜面接平板：点种法、划线法。19高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养20高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 三、微生物分离三、微生物分离21高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物纯培养分离技术微生物纯培养分离技术n纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。n获得纯培养物对微生物学研究至关重要。22高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物纯培养分离技术微生物纯培养分离技术涂布平板法平板划线法平板倾注法稀释摇管法液体培养基分离法单细胞（孢子）分离法选择培养基分离法23高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 涂布平板法涂布平板法1、少量样品加到平板中央（0.1mL）；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却；4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养。24高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 涂布平板法涂布平板法样品需适当稀释样品需适当稀释30-300CFU/mL25高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 平板划线法平板划线法斜线法曲线法方格法放射法四格法26高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 平板划线法平板划线法斜线法：斜线法：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿70角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。曲线法曲线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。27高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 平板划线法平板划线法血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）28高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 平板倾注法平板倾注法对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获得单菌落。培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。29高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 稀释摇管法稀释摇管法n适合厌氧菌的纯培养分离无菌琼脂培养基试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50左右梯度稀释后的待分离菌株加入试管中摇匀、冷凝在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物培养后，菌落形成在琼脂柱的中间30高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 液体培养基分离液体培养基分离不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。31高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 单细胞（孢子）分离单细胞（孢子）分离单细胞（或单孢子）分离法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。32高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 选择培养基分离选择培养基分离n选择培养基特性促生长能力抑制能力指示（鉴别）能力33高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 选择培养基分离选择培养基分离传统传统选择性培养基选择性培养基n血平板：血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。n营养肉汤：营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌n巧克力血平板：巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。n中国蓝平板或伊红美蓝平板：中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制G+细菌，有选择地促进G-菌生长，是较好的弱选择性培养基。n麦康凯平板：麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。nSS琼脂：琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。n碱性琼脂：碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。34高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 选择培养基分离选择培养基分离n新型显色培养基显色培养基利用微生物自身代谢产生的利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色酶与相应显色底物反应显色的原的原理来检测微生物的培养基。理来检测微生物的培养基。OrganismEnzyme Substrate Color Coliforms-galactosidaseX-GALBlueEscherichia coli-galactosidase-Glucuronidase MUGfluorescenceEscherichia coli O157-galactosidaseX-GALBlue35高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 选择培养基分离选择培养基分离36高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 基于酶与底物反应的显色培养基技术基于酶与底物反应的显色培养基技术nCHROMagar37高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 nPetrifilm3MAerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate 基于酶与底物反应的显色培养基技术基于酶与底物反应的显色培养基技术38高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定39高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定n多相鉴定（分类多相鉴定（分类)（polyphasic taxonomy）是利用微生物从）是利用微生物从分子特性分子特性到到生态特征生态特征的多种不同信息，综合的多种不同信息，综合表型表型和和基因型基因型特征进行微生物分类鉴定的方法。特征进行微生物分类鉴定的方法。形态学观察细胞特征培养特征生理生化试验生长温度耐盐性碳源利用发酵产酸其他化学成分分析呼吸醌极性脂脂肪酸分枝菌酸氨基酸和糖其他基因型分析核酸序列分析功能基因分析DNA杂交指纹图谱、菌株分型其他系统发育分析16SrDNA5.8SITS区26SD1/D2区其他40高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定-形态学观察形态学观察细菌细菌酵母酵母丝状真菌丝状真菌宏观形态（培养特征）将培养物划线或稀释涂布，30培养1624小时，选取划线或稀释涂布分离得到单菌落，观察和记录菌落的形状、大小、质地、边缘、颜色、光泽、透明度、隆起等。将培养物划线接种于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固体培养基上，25培养23d后，进行菌落形态观察，菌落质地、菌落颜色、菌落表面是否为反光或暗淡、菌落是平伏还是隆起、菌落边缘等。标准培养基（CA、CYA、WA）平板倒转，向上接种三点，每个菌株接种两个平板，倒置于25温箱中进行培养7天。观察菌落直径、颜色、质地、渗出液、菌落反面颜色等特征。微观形态（细胞特征）将培养物在30条件下培养1624小时，挑取对数期的单菌落，涂布于事先滴加少量无菌水的载玻片上，自然干燥，加热固定，进行革兰氏染色，将制好的染色涂片在100X40倍的显微镜下观察革兰氏染色情况、菌体形状、排列行状、菌体大小等细胞特征。培养物划线接种于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固体培养基上，25培养23d后，取酵母菌制作成水浸片，在显微镜下观察细胞形态和无性繁殖方式等。用无菌接种针挑取少量培养物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上，用接种针将菌丝团分散开，盖上盖玻片（勿使产生气泡），制成水浸片，显微镜下观察菌体形态特征，包括分生孢子梗、分生孢梗茎、顶囊、梗基、瓶梗、产孢结构、分生孢子头、分生孢子等。41高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定-形态学观察形态学观察42高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定-生理生化生理生化碳源和氮源运动性细胞壁组成渗透耐性能源氧关系发酵产物最适pH和生长范围一般营养类型光合作用色素最适生长温度和范围盐需求及耐性发光次级代谢产物形成能量转换机制对代谢抑制剂和抗生素的敏感性贮藏内含物43高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定-生理生化生理生化Division based on membrane composition:a) gram-negativehaveouterandinnermembranesandathincellwall(Escherichia coli)b) gram-positivehavenooutermembrane,buthaveathickercellwall(Bacillus subtilis)c) neither gram- nor gram+-nocellwalls(mycoplasm)http:/www.med.sc.edu:85/fox/gram-st.jpghttp:/www.med.sc.edu:85/fox/bact-mem.jpg44高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定-生理生化生理生化nAPI(bioMerieux)(biochemical)45高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定-生理生化生理生化nBBLCrystal(BectonDickinson)n将传统的生化反应、酶底物呈色反应与荧光增强显色技术结合，设计鉴定反应最佳组合。n六类鉴定试验板，可鉴定500种细菌46高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定-化学成分分析化学成分分析细胞质膜：呼吸醌（甲基萘醌和泛醌）细胞质膜：极性脂细胞质膜：脂肪酸除放线菌外的细菌除放线菌外的细菌外膜：分枝菌酸细胞壁：肽聚糖（氨基酸和糖）全细胞：糖和蛋白质放线菌放线菌47高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定-基因型分析基因型分析nG+Cmol% n16S rDNA, 26S rDNA D1/D2, 5.8S rDNA ITS region, n-tubulin gene, calmodulin gene, gyrA gene, pheS gene, recN gene, rpoB gene and other housekeeping genes.nDNA Barcoding gene sequence analysis, MultiLocus Sequence Analysis (MLSA) nDNA-DNA hybridizationnRAPD, RFLP, AFLP, SSCP, Eric-PCR, BOX-PCR, Rep-PCR , LAMP.48高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定-基因型分析基因型分析DNA 指纹图谱分析指纹图谱分析1234Eric-PCRBOX-PCRRep-PCRSSCP ERICPCR 以细菌以细菌DNA中串联重复序列为引物，中串联重复序列为引物， 通过扩增细菌通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，在不同种属个体间表现为在染色体上基因组中广泛分布的短重复序列，在不同种属个体间表现为在染色体上存在的位置和拷贝数不同，以电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异，存在的位置和拷贝数不同，以电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异，应用于菌株分型。应用于菌株分型。 BOX-PCR根根 据据 BOX插插入入因因子子(大大小小为为 154 bp, 由由保保守守性性不不同同的的 box A(57 bp)、 box B(43 bp)和和 boxC(50 bp)等等亚亚单单位位组组成成)设设计计引引物物, 扩扩增增微微生生物物基基因因组组DNA 的的重重复复性性片片段段, 最最后后经经琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳检检测测其多态性。其多态性。 REP -PCR 扩增细菌基因的重复扩增细菌基因的重复DNA 片段来获得菌株特异性遗片段来获得菌株特异性遗传图谱传图谱, 其中重复其中重复 DN A 片段包含了一个高度保守的回文序列片段包含了一个高度保守的回文序列(REP)为为 38 bp 的片段的片段, 由由1个保守回文段以及两端分别有个保守回文段以及两端分别有6 个降解位点和个降解位点和1 个个5 bp 的可变框构成。的可变框构成。 PCR-SSCP是是聚聚合合酶酶链链式式反反应应与与单单链链 DNA 非非变变性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳技技术术结结合合，利利用用不不同同构构象象单单链链 DNA 在在非非变变性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳中中泳泳动动速速率率的的差差异异, 检检测测出出DNA短短片片段段中中存存在在的的单单核核苷苷酸酸突突变变,现现已已广广泛泛应应用用于于各各种种基基因多态性的研究。因多态性的研究。假丝酵母假丝酵母PCR-SSCP 副溶血弧菌副溶血弧菌ERICPCR 沙门氏菌沙门氏菌REP -PCR 49高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例116SrDNA序列系统发育树infB基因序列系统发育树50高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 2007年年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表新种发表2008年年 ATCC 16404 鉴定为鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2010年年 USP将将ATCC 16404 更名更名 2010年年 WDCM 将将ATCC 16404 更名更名 图：ATCC 16888和ATCC 16404的培养特征和显微形态anos Varga, Sandor Kocsube , Bea ta To th, et al. Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932图图: Rep-PCR条码系统发育树条码系统发育树(DiversiLab平台平台)Figure 2: Dendrogram of Rep-PCR Barcoding (DiversiLab Platform) . .注：图片来源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, Vol. 14 (10): 2-14表 ITSITS序列特殊位点碱基差异Table Difference of base position in ITS sequenceTable Difference of base position in ITS sequence四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例251高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 2007年年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表新种发表2008年年 ATCC 16404 鉴定为鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2010年年 USP将将ATCC 16404 更名更名 2010年年 WDCM 将将ATCC 16404 更名更名 图图: : 基于曲霉黑色组基于曲霉黑色组-微管蛋白基因序列的微管蛋白基因序列的N-JN-J树树Figure : Neighbour joining tree based on -tubulin Figure : Neighbour joining tree based on -tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri.sequence data of Aspergillus section Nigri.注：图片来源于Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution International. Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932图图1: 1: 基于基于ITS DNAITS DNA序列的黑色曲霉序列的黑色曲霉N-JN-J树树Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS DNA Sequences.DNA Sequences.注：图片来源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, Vol. 14 (10): 2-14四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例252高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n各种标准中仍将继续采用ATCC 16404作为质控菌株。n各类标准中，其它被指定为参考菌株的黑曲霉菌株(CMCC(F) 98003) ,需要重新复核鉴定。巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis）黑曲霉(Aspergillus niger)黑曲霉四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例253高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n形态学鉴定CYA培养基,25C培养7dnBiologBiolog鉴定生长浊度试验nITS rDNAITS rDNA区序列分析ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5:5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3n-微管蛋白基因序列分析Bt2a:5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3Bt2b:5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3反反应体系：体系：100 L, 10 扩增缓冲液10 L; DNA模板1 L ; dNTP (每种2.5 mmol/L) 8 L; 引物(10 L/L)各2.5 L; Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1.3 L; 无菌超纯水补足总体积100 L。反反应程序：程序：94C 5 min; 94C 1 min, 55C 1 min, 72C 1 min, 30个循环; 72C 10 min, 4C保存。四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例254高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n形态学鉴定图 2525C C培养7 d7 d菌种的宏观形态和显微形态Fig Macromorphology and micromorphology on 25Fig Macromorphology and micromorphology on 25C, 7 dC, 7 d注: A菌落形态; B: 分生孢子梗形态( 100); C: 分生孢子形态( 400).Note: A: Colony morphology, B: Conidiophore morphology ( 100); C: Conidial morphology ( 400).该菌株的形态学特征符合黑曲霉A. niger的形态特征四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例255高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 nBiolog鉴定注:没有生长;+:生长旺盛;w:微弱(边界)生长;v:可变.Note:Nogrowth;+:Stronggrowth;w:Weakgrowth;v:Variedgrowth.表表 碳源利用情况碳源利用情况Table Carbon Source Utilization碳源Carbon sourceATCC16888Aspergillus nigerATCC16404Aspergillus brasiliensis CMCC(F)98003麦芽糖Maltose+-甲基-D-葡萄糖苷-Methyl-D-Glucoside+D-海藻糖D-Trehalose+L-苹果酸L-Malic Acidv+-酮戊二酸-Ketoglutaric acidw苦杏仁苷Amygdalin+D-果糖D-Fructose+v+四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例256高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 nITS rDNA区序列分析图 CMCC(F)98003CMCC(F)98003的ITS rDNAITS rDNA区序列和-微管蛋白基因序列PCRPCR扩增结果Fig ITS rDNA and -tubulin gene PCR Fig ITS rDNA and -tubulin gene PCR amplification results of CMCC(F)98003amplification results of CMCC(F)98003注: M: DL2000 marker; 1: ITS rDNA区PCR扩增结果; 2:-微管蛋白基因PCR扩增结果.Note: M: DL2000 marker;1: ITS rDNA PCR amplification result ; 2:-tubulin gene PCR amplification result.表表 ITS序列特殊位点碱基差异序列特殊位点碱基差异Table Difference of base position in ITS sequence碱基位点Base position140166172173Aspergillus brasiliensis IMI 381727CCTCAspergillus niger ATCC 16888ATAACMCC(F)98003ATAA注:以18S和ITS1区之间的TTACCG序列中的第一个“C”为1位点.Note:ThefirstCinthebordersequence(TTACCG)of18SandITS1isheredefinedasposition1.四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例257高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 nITS rDNA区序列分析以18S和ITS1区之间的TTACCG序列中的第一个“C”为1位点。140140166166172172、173173四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例258高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 nITS rDNA区序列分析图基于ITS区rDNA序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri. based on Their ITS DNA Sequences注:图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值,图例为遗传距离.Note:Numbersabovebranchesarebootstrapvalues.Onlyvaluesabove50%areindicated.Bar,geneticdistance.CMCC(F)98003与与A. niger ATCC16888聚类在分类距离最近的一个分支上,序列相似性达100%。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性也具有很高的相似性,序列同源性均在98.6%100%之间。四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例259高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n-微管蛋白基因序列分析图基于-微管蛋白基因序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树Fig Neighbour-joining tree based on -tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri注:图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值,图例为遗传距离.Note:Numbersabovebranchesarebootstrapvalues.Onlyvaluesabove50%areindicated.Bar,geneticdistance.CMCC(F)98003与黑曲霉A. niger CBS554.65T序列同源性为100%。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性均在94.7%以下。n结合形态学、碳源利用情况和ITS rDNA序列系统发育分析等多相鉴定的结果, 将CMCC(F)98003鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger ）。四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例260高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 五、微生物保藏五、微生物保藏61高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。n菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。中国微生物菌种保藏管理条例五、微生物保藏五、微生物保藏62高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n制订专门菌种保藏管理制度；制订专门菌种保藏管理制度；n同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；n对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中；藏设备中； n对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理；对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理； n设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。 五、微生物保藏五、微生物保藏63高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n微生物菌种保藏方法基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。五、微生物保藏五、微生物保藏64高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 常用菌种保藏方法常用菌种保藏方法n定期移植法定期移植法n液体石蜡法液体石蜡法n真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法n-80低温冻结法低温冻结法n液氮超低温冻结法液氮超低温冻结法65高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 定期移植法定期移植法n亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于面培养基上，最适条件下培养，完成培养于46进行保存并间隔一定时间（进行保存并间隔一定时间（3-63-6个月）进行移个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。植培养的一种短期菌种保藏方法。n操作步骤：操作步骤： 斜面制备斜面制备 接种接种 培养培养 保藏保藏66高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 v 斜面制备斜面制备培养基配制培养基配制分分 装装灭灭 菌菌摆放斜面摆放斜面67高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 v 接接 种种68高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n培养培养细菌细菌37 ，1-2d酵母酵母 2830，23d丝状真菌丝状真菌26 ，57dn保藏保藏46保藏保藏36个月个月v 培养和保藏培养和保藏69高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 定期移植法定期移植法v操作简单，使用方便；操作简单，使用方便；v对设备和人员要求不高；对设备和人员要求不高；v可随时使用，便于观察菌种；可随时使用，便于观察菌种；v工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；v菌种传代频繁，易退化、污染。菌种传代频繁，易退化、污染。70高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 液体石蜡法液体石蜡法n指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（斜面，再直立放置于低温（46）干燥处进行）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。保存的一种菌种保藏方法。71高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 v 操作步骤：操作步骤：液体石蜡预处理液体石蜡预处理斜面培养物制备斜面培养物制备灌灌 注注 石石 蜡蜡保保 藏藏优质化学纯液体石蜡优质化学纯液体石蜡灭菌：灭菌： 121湿热灭菌湿热灭菌30min，蒸发水分；，蒸发水分； 160 干热灭菌干热灭菌2h；冷却至室温。冷却至室温。液面高出斜面顶部液面高出斜面顶部1cm46 ，干燥处；，干燥处；直立放置；直立放置；保藏时间保藏时间1 2年。年。72高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 液体石蜡法液体石蜡法v操作简单，使用比较方便；操作简单，使用比较方便；v对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；v菌种易退化、污染。菌种易退化、污染。73高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法n指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。后保存的一种长期菌种保存方法。74高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 安瓿管的准备安瓿管的准备l清洗清洗l选用中性玻璃材质的安瓿管；选用中性玻璃材质的安瓿管；l2%盐酸浸泡盐酸浸泡810h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗23次；次；l置于烘箱中烘干置于烘箱中烘干。l棉塞棉塞l打棉塞，打棉塞，160定型定型2h；l标签标签l激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约1020mm。l喷码于安瓿管外，喷码于安瓿管外，160固定固定20min。l灭菌灭菌l121 ，30min.75高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 保护剂的准备保护剂的准备l保护剂：保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，脱脂牛奶蒸馏水溶液，25ml/管；管；l灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113灭菌灭菌20min；l打开放气阀缓慢排出蒸汽，打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；速放入凉水中冷却；l30培养培养2天，无菌检查合格后备用。天，无菌检查合格后备用。 76高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n冻干样品制备冻干样品制备l制备斜面培养物；制备斜面培养物；l将将保保护护剂剂用用无无菌菌吸吸管管注注入入到到斜斜面面培培养养物物上上，用用吸吸管管刮刮取取斜斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。l用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.10.2ml/管，管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。部，勿使菌液沾在管壁上。77高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 真空干燥真空干燥 l在在开开动动真真空空泵泵后后应应使使真真空空度度在在15min内内达达到到66.5Pa，随随后后逐逐渐渐达达到到26.613.3Pa，在在此此条条件件下下，样样品品将将保保持持冻冻结结状状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。l终止干燥时间应根据下列情况判断终止干燥时间应根据下列情况判断：l安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状l真空度接近空载时的最高值真空度接近空载时的最高值l样品温度与管外温度接近样品温度与管外温度接近l选选用用12支支对对照照管管，其其水水份份与与菌菌悬悬液液同同量量，当当其其水水分分完完全全蒸蒸发发时时视视为为干干燥完结燥完结78高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 预冻预冻l制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；l分装完成后将安瓿管立刻放入分装完成后将安瓿管立刻放入3540冰箱预冻冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；，使菌液完全冻结；l可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置20冻冻30分钟，再放入分钟，再放入80冰箱冻冰箱冻30min；l采用离心式冻干装置时勿需预冻。采用离心式冻干装置时勿需预冻。79高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 熔封熔封 将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；l将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；l拉管时注意火焰不要离菌体太近。拉管时注意火焰不要离菌体太近。80高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 真空度检测真空度检测 用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝光，说明真空度符合要求。光，说明真空度符合要求。81高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 保藏保藏 46下避光保藏，下避光保藏，一般可保藏一般可保藏810年。年。82高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法v保藏、运输方便；保藏、运输方便；v保藏时间长保藏时间长(5 10年年)；v对设备要求高对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操，对人员操作水平要求高；作水平要求高；v冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。83高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 -80冰箱冻结法冰箱冻结法n将菌种悬浮于保护剂中，在将菌种悬浮于保护剂中，在8080冰箱中冻结保存的一种冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。长期菌种保藏方法。准备冷冻管准备冷冻管准备保护剂准备保护剂 （ 10%-15%甘油）甘油）准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）保藏（保藏（ -80，25年）年）84高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 Microbank85高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 -80冰箱冻结法冰箱冻结法v使用方便；使用方便；v保藏时间较长；保藏时间较长；v对设备要求高对设备要求高(-80-80冰箱冰箱)；v运输不方便。运输不方便。86高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 液氮超低温冻结法液氮超低温冻结法n指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于196196的液氮或的液氮或150150左右的液氮气相中保存的一种长期菌种左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。保藏方法。87高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 操作步骤操作步骤l冷冻管准备冷冻管准备l保护剂制备保护剂制备l保藏培养物准备保藏培养物准备l预冻预冻 将程序降温系统预冷到将程序降温系统预冷到4，将制备好的冷冻管放入其中，以，将制备好的冷冻管放入其中，以1/min降温降温速率降至速率降至-35； 使用程序降温盒。使用程序降温盒。l保藏保藏 将预冻后的冷冻管转移至液氮气相将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150)或液相或液相(-196)。同同“80冰箱冻结法冰箱冻结法” 88高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 液氮超低温冻结法液氮超低温冻结法v保藏时间长；保藏时间长；v保藏效果好，菌种不易退化；保藏效果好，菌种不易退化；v对设备要求高对设备要求高(程控降温仪、液氮罐程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平，对人员操作水平要求高；要求高；v保藏成本高。保藏成本高。89高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 不同保藏方法的比较不同保藏方法的比较90高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 六、质控微生物六、质控微生物91高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 保藏菌株要求保藏菌株要求药品微生物检验用的试验菌应来自认可的药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内国内或国外菌种收藏机构或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株商业派生菌株。922010版中国药典药品微生物实验室规范指导原则92高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 国内认可的菌种收藏机构国内认可的菌种收藏机构n1979年年7月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种保藏管理委员会（保藏管理委员会（CCCCM），委员会下设），委员会下设7个全国性菌种保藏个全国性菌种保藏管理中心及机构所在地：管理中心及机构所在地：普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）,中国科学院微生物研究所农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工业研究院医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院93高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 国认外可的菌种收藏机构国认外可的菌种收藏机构n世界菌种保藏联合会世界菌种保藏联合会WFCC (World Federation Of Culture Collection)全球注册的菌种保藏机构全球注册的菌种保藏机构583家家ATCCNRRLDSMZNCTCCMICBSNBRC(IFO)JCM94高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 菌株代数 美国药典（美国药典（USPUSP）中规定：）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上将微生物接种至一新鲜培养基上/ /内，每萌发一次内，每萌发一次即称为一代，即称为一代，”并规定并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5 5代代”。 United States Pharmacopoeia (USP) provides that: to microbial inoculation to a fresh medium on / in each germination time is referred to as a generation, and provides that strains of the passages (from the original strain from freeze-dried powder) must not exceed 5 generation. “ 我国的我国的GMPGMP认证中也如此要求，并且中国药典认证中也如此要求，并且中国药典20052005年版药典也已做出年版药典也已做出“菌种的菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5 5代代”这个明确的规定。这个明确的规定。 Chinas GMP certification is asking, and the Chinese Pharmacopoeia 2005 edition of Pharmacopoeia also had a strain of the passages (from the original strain from freeze-dried powder) should not exceed 5 on behalf of The clearly defined.Enrichment(G1)Separation of single-olony(G2)Workingstrain(W3)Workingstrain(W4)Working strain (W5)95高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 标准菌株提供形式标准菌株提供形式AccuracyAccuracyEasy of UseEasy of Use(preparation)(preparation)HighHighLowLowComplicatedComplicatedEasyEasyQuanti Cult Quanti Cult (REMEL)(REMEL)Standard Strains Standard Strains (ATCC/NBRC etc.)(ATCC/NBRC etc.)EZ-CFU one step EZ-CFU one step (MicroBioLogics)(MicroBioLogics)KWIK-STIK KWIK-STIK (MicroBioLogics)(MicroBioLogics)Culti Loops Culti Loops (REMEL)(REMEL)BioBall BioBall (BTF/bioMerieux)(BTF/bioMerieux)96高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n质控菌株质控菌株Primary strainQualitative strainQuantitative strain97高等课堂医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n视频材料视频材料质控菌株的使用质控菌株的使用质控菌株质控菌株98高等课堂