实验专题模块二实验专题模块二基质金属明胶酶与肿瘤的关系基质金属明胶酶与肿瘤的关系肿瘤转移肿瘤转移（Tumor Metastasis）是指肿瘤细胞脱离原发生长部位，通过各种途径的转运，在机体内远离原发部位的器官/组织继续增殖生长，形成转移瘤的过程。大体包括以下步骤：1）原发灶肿瘤细胞大量增殖，新生血管生长；2）肿瘤细胞从原发灶脱落，侵袭细胞外基质与基底膜，进而侵入血管、淋巴管或体腔。在这过程中，肿瘤细胞会分泌包括基质金属蛋白酶在内的多种酶类；3）极少数肿瘤细胞在循环系统中存活，形成癌栓，随血流、淋巴流迁移到另一远隔部位或器官；4）肿瘤细胞与靶器官的毛细血管壁发生黏附，穿出血管形成微小转移灶，细胞增殖并产生新的血管，形成与原发肿瘤性质一致的继发瘤，肿瘤细胞可以发生二次侵袭和转移。肿瘤细胞的侵袭移动肿瘤细胞的侵袭移动CBAD肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞粘附并穿越细胞外基质，包括三个重要的步骤：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，细胞经缺口移动。肿瘤细胞对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞转移的关键步骤。转移的肿瘤细胞在原灶外存活和增殖，这是癌症对人类生命的最大威胁。p基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMPs）是一类依赖金属离子锌（Zn2)，并以细胞外基质组分作为底物的蛋白酶。pMMPs家族已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP126。根据作用底物以及片断同源性，将MMPs分为6类，为胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、Furin活化的MMPs和其他分泌型MMPs。pMMPs蛋白由多个结构域组成：1）N端有一段1729个残基，富含疏水氨基酸的信号肽，所以这类蛋白均为分泌蛋白；2）后面是大约80个氨基酸组成的前肽，保守序列PRCGVPNPD中的半胱氨酸对酶原形式的维持至关重要；3）催化结构域由160170个残基组成，含有高度保守序列HEXGHXXGXXH（X表示任意的氨基残基），其中的3个组胺酸与活性中心的锌离子结合；4）除了MMP-7、MMP-23和MMP-26外，其他MMPs的C末端都有一个类血红素结构域，参与大分子底物的识别以及与组织金属蛋白酶抑制剂（Tissue Inhibitors of Metalloproteinases，TIMPs）的结合。 pMMPs蛋白以酶原形式分泌，当机体需要时被其它蛋白酶水解分裂而激活。p在生理pH值环境中，能够降解细胞外基质成分，参与细胞外基质重建，调节细胞黏着，直接或间接参与胚胎发育、组织再塑及创伤修复等正常生理功能。并在多种疾病病理过程中发挥作用，如炎症反应、恶性肿瘤浸润、动脉粥样硬化、脑血管病和多发性硬化等。 p在肿瘤的侵袭转移中，较重要的有MMP-2与MMP-9等pMMP-2又称为明胶酶A，其基因位于人类染色体16q21，主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生。以相对分子质量为72kDa的酶原形式分泌后，N端裂解掉80个氨基酸成为相对分子质量为66Da或62Da而被激活为活化型MMP-2；pMMP-9又称为明胶酶B，其基因位于染色体20q12-q13，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产生。以前酶原（相对分子质量为7882Da）的形式合成，后经裂解掉19个氨基酸的信号肽，再糖基化而转变成相对分子质量为95Da的酶原形式，酶原降解掉N端73个氨基酸产生此酶的活化形式（相对分子质量为84kDa）。p本专题实验中，我们将用明胶酶谱法检测一系列肿瘤患者以及对照正常人血清中MMP-2与MMP-9的活性，以探讨其在肿瘤患者血清中的表达水平，从而加深同学们对肿瘤侵袭转移过程的认识。一、实验目的u掌握酶谱法测定MMP-2与MMP-9活性的原理u熟悉酶谱法操作技术u了解测定MMP-2与MMP-9活性的意义实验 酶谱法分析食管癌中法分析食管癌中MMP-2与与MMP-9活性活性酶谱法是酶活性的测定方法之一。酶活性的大小通常由酶降解底物的速度与程度决定。酶谱法将酶的底物均匀地铺在聚丙烯酰胺凝胶内，先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后创造酶作用的适宜环境，使酶恢复活性，在凝胶上降解底物。该凝胶通过染色，可呈现酶作用的痕迹。比较不同样品该痕迹的大小，可知酶活性的差异。二、背景与原理（一）（一） SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳 电电泳泳 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。质点移动速度，q质点所带净电荷量，E为电场强度，r为质点半径，为介质粘度。 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。过硫酸铵的催化作用需要TEMED的帮助。+催化剂丙烯酰胺甲叉双丙甲叉双丙烯酰胺胺聚丙聚丙烯酰胺胺聚丙聚丙烯酰氨凝胶氨凝胶电泳泳u在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；u化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶u对pH和温度变化较稳定u几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好u样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6gu凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径u分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率聚丙聚丙烯酰胺凝胶特性胺凝胶特性 聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分子筛效应。蛋白质在该电泳中保持完整的状态，依三种因素分开：蛋白大小、形状和电荷。SDS，即十二烷基磺酸钠SDS具有亲脂的长尾和亲水性头（带负电）SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构给蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，因而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的相对分子质量大小SDS及其作用及其作用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳可用于测定相对分子质量大小相相对分子分子质量范量范围适宜的凝胶适宜的凝胶浓度度(%)蛋蛋 白白 质10420-301-410415-201-5104-110510-1511055-1051052-5核核 酸酸(DNA/RNA)10415-201041055-10105-21062-2.6电泳时，需要注意凝胶网孔大小对分析的影响。凝胶浓度越大，网孔越小，影响大分子的移动；凝胶浓度越小网孔越大，对小分子的分子筛效应越小。按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类： 1.连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应分离。 2.不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度以及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素不不连续系系统的特点的特点：“快慢离子”理论：p 电泳开始时，样品在浓缩胶pH=6.8，甘氨酸电离较小，甘氨酸根离子带电最少，移动最慢，是“慢离子”。而HCl完全解离成氯离子，氯离子移动最快，是“快离子”。蛋白速度居中。p 电泳开始后，氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。p 进入分离胶后，pH=8.8，甘氨酸电离完全，快慢离子层消失。浓缩胶的作用是把加入的样品浓缩至一个狭窄的区带MMP-2（明胶酶A）和MMP-9（明胶酶B）的底物是明胶。1.将明胶加到配制聚丙烯酰氨凝胶的溶液中，随着凝胶的形成底物明胶被均匀地铺在了凝胶内2.含MMP-2与MMP-9的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，MMP-2与MMP-9得已分开。但此时由于SDS的干扰，MMP-2与MMP-9不能发挥其酶活性，不能降解底物。3.用洗涤液去除SDS后，在含二价金属离子的缓冲溶液中孵育，MMP-2与MMP-9降解凝胶内底物明胶。4.用考马斯亮蓝染色后，就能看到酶作用的痕迹蓝色背景下的“白点”。5.通过比较该白点的大小，可知不同样品中明胶酶活性大小差异。（二）明胶酶谱法（二）明胶酶谱法1.样品制备: 适量血清、条件培养基浓缩液样品，肝组织总蛋白提取液样品直接与5SDS 样品缓冲液混匀进行下一步实验，如酶活性太高造成显带不理想，可适当进行稀释;2.凝胶的制备: 玻璃板对齐后放入夹中垂直卡紧。按下表配10分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，然后胶上加一层异丙醇，以隔离空气中的氧，促进凝胶聚合。胶凝后（异丙醇和胶之间有一条折射线），再等5min使胶充分凝固，倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按下表配4的浓缩胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。三、操作步骤分离胶分离胶(10%)浓缩胶浓缩胶(4%)超纯水4.5 ml3 ml30% Acr/Bis2 ml0.66mlBuffer1.5mol/L pH=8.8Tris-HCl 2.5ml0.5mol/L pH=6.8Tris-HCl 1.25ml10% SDS100 l50 l1%明胶0.5010% Ap100 l25 lTEMED8 l5 l3.在每个加样孔中加入20 l样品;4.电泳： 在4 100V下，约3h;5.凝胶的处理：3.电泳结束后，取下凝胶，放入平皿中，用洗涤缓冲液在室温摇动下洗涤1h，其间换液一次；4.弃去洗涤缓冲液，然后加入孵育缓冲液没过胶面，至37恒温箱中，24h后取出；5.弃去孵育缓冲液，加入0.1%考马斯亮蓝染液染色约30min，回收染液，加入脱色液脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用5乙酸中止脱色；6.待凝胶在5乙酸中恢复到适当大小后，用凝胶图象处理系统分析结果，以白色条带的净光密度值相对定量样品中酶活性。预期实验结果预期实验结果N N P P 135kD92kD72kDNGAL/MMP-9Pro-MMP-2MMP-91.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡 。2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液 配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。3.制胶时，用厚度大的梳子做上样孔4.孵育的37 不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的pH值，在普通孵箱即可。5.明胶要4保存，配好后1周内使用。6.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴手套。注意事项注意事项p我们知道，核酸中的密码指导蛋白质的合成，而核酸的合成又需要多种酶来完成。两者互为生成的基础，但重要性各不相同。试推测：先有蛋白质还是先有核酸？说明理由。p蛋白质含量的测定方法有哪些？分析其优缺点。p可自选讨论题目，你感兴趣的题目是：课堂分堂分组讨论