第六节第六节 药物的抗病毒实验药物的抗病毒实验一、目的和要求一、目的和要求1.掌握药物体外抗病毒的实验方法和操作步骤。2.熟悉病毒感染性动物模型的建立和评价。二、内容二、内容（一）原理（一）原理病毒是一类结构简单、非细胞形态的专性细胞内寄生的微生物，必须在易感的活的动物、鸡胚或细胞内才能进行复制增殖。因此可用动物、鸡胚或细胞来进行病毒培养和药物的抗病毒试验。可通过观察细胞培养液酸碱度的变化、病毒致细胞病变效应（CPE）、病毒滴度（PFU）改变、病毒基因组mRNA水平变化、鸡胚尿囊液或动物血清等相应指标的改变，来判断药物的抗病毒试验效果。（二）材料（二）材料1.910d日龄鸡胚，壳白净且厚薄均匀的鸡卵（莱亨鸡的受精卵由于卵壳薄，在孵育过程中便于检查，为首选）2.Hep-2细胞或MDCK细胞3.病毒：如IFV（FM1株）、RSV（Long株）4.药物：试验药物，阳性对照药5.动物：小鼠等（三）操作方法（三）操作方法鸡胚培养为常用的病毒培养法之一，目前主要用于痘类病毒、粘病毒、疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原和疫苗的生产等。1.接种方法接种方法病毒的鸡胚培养法主要有四种接种途径，即尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊，不同的病毒应选择各自适宜的接种途径，并根据接种途径确定鸡胚的孵育日龄（见表）。下面将以流感病毒为例进行说明。一）鸡胚法一）鸡胚法表6-1鸡胚孵育日龄及接种途径选择接种病毒名称接种病毒名称接种部位接种部位鸡胚日龄鸡胚日龄收获材料收获材料痘类病毒、单纯疱疹病毒绒毛尿囊膜9-10绒毛尿囊膜流感病毒、腮腺炎病毒尿囊腔9-11尿囊液流感病毒初次分离羊膜腔12-14羊水某些嗜神经性病毒卵黄囊5-6卵黄液2. IFV-FM1的的50%鸡胚感染量（鸡胚感染量（EID50）测定）测定用生理盐水将病毒作10倍系列稀释，分别接种鸡胚，0.1ml/胚，同时设正常对照，共6组，每组5胚。35孵育72h，置4冰箱过夜，收集尿囊液做血凝试验，按Reed-Muench法计算FM1的EID50。3. 药物对鸡胚的毒性作用药物对鸡胚的毒性作用选用健康的911日龄鸡胚，消毒备用。将受试药和对照药作10倍系列稀释56个浓度，如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100g/ml、10g/ml，每个浓度接种5胚，0.25ml/胚。35培养5d后观察结果（死亡/存活）。确定两种药物对鸡胚的最大无毒剂量（TC0），用于正式实验。4. 药物对药物对FM1的抑制作用的抑制作用鸡胚随机分为14组，每组5胚，即试验药的六个剂量组（从TC0开始作10倍系列稀释）、阳性对照药六个剂量组（同前）、生理盐水和病毒对照组。将不同浓度的药液注入鸡胚中，0.25ml/胚，30min后经相同途径注入100EID50病毒0.1ml，对照组以生理盐水代替。35温箱孵育5d。收获尿囊液，测其血凝效价，以能抑制32倍以上所注射的最小药物量，即为其最小抑制剂量（MIC）。4.1鸡胚接种鸡胚接种（1）孵育910d左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔标出气室和胎位。（2）鸡胚直立于固定架上，气室端向上，按常规以碘酒，酒精消毒。（3）用磨蛋器在气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。（4）用lml注射器吸取病毒悬液，针头从气室小孔刺入，沿胚胎的长轴刺入0.51.0cm深度；此时针头已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒悬液。（5）拔出针头，用镊子将胶布沾酒精烧灼后将小孔封闭，置于3536温箱内培养二天，每天翻动两次，用照蛋灯检视一次。培养二天后。置-20冰箱2h后，无菌操作收获尿囊液。4.2尿囊液的收获尿囊液的收获（1）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒，酒精消毒气室部位。（2）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵壳。（3）用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸取尿囊液（避免血管破裂），置于无菌试管中。（4）获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制试验（定性），判断病毒的增殖情况并对病毒进行鉴定；同时做无菌实验。4.3血凝和血凝抑制实验血凝和血凝抑制实验（1）血凝实验血凝实验的具体操作方法，参照本教材的第四章第四节内容：病毒的分离培养鉴定和血清学检测。结果判断以“+”号多少表示血凝程度：+100的RBC发生血凝，形成花边拉网状，红细胞呈薄层均匀铺于板孔底，呈细沙状或薄膜状；+75的RBC发生血凝，红细胞虽铺于孔底，呈细沙状，但边缘不整有下沉趋势；+50的RBC发生血凝，红细胞在孔底呈一环状，四周有小凝集块；+25的RBC发生血凝，红细胞在孔底沉聚呈小圆点，边缘不光滑，周围有小凝集块；-100的RBC沉积，红细胞于孔底呈一小圆点，边缘光滑整齐，无凝集现象。以使50的RBC发生凝集的最高稀释倍数，为病毒的血凝效价。计算药物的MIC。（2）病毒血凝抑制实验根据血凝试验滴定的病毒血凝效价，以“2”的凝集者含有1个病毒血凝单位。如流感病毒的血凝效价为1:160，即病毒液稀释至1:160时，每0.25ml中含1个血凝单位，若要将0.25ml病毒液配制成含4个血凝单位时，应稀释成1:（1604），即1:40稀释。在做血凝抑制试验时用4个血凝单位。将病毒液配成4个血凝单位。血凝抑制实验的方法，参照本教材的第四章第四节内容：病毒的分离培养鉴定和血清学检测。主要根据细胞对病毒的敏感性选择适宜细胞株。人类病毒用人或猴的组织较敏感，因此，研究人的病毒性疾病常用人胚肾、人胚肺或人羊膜细胞。组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。本实验仅介绍对传代细胞的操作方法。二）细胞培养法二）细胞培养法1.病毒病毒TCID50滴定滴定（1）原理多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（cytopathiceffect，CPE），可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色得以识别和判断。CPE的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力。即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞发生病变所需的病毒量，定义为病毒的50组织细胞感染指数（50tissuecultureinfectiousdose，TCID50）。在从事药物的抗病毒试验中，常用100TCID50的病毒感染量进行。测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。将待测病毒用维持液做连续10倍系列稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的CPE不再进展为止。具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般48h即可；RSV、VSV增殖也较快，因此4872h也可以观察、染色、计算。（2）实验材料细胞：MDCK细胞或Hep-2细胞，或其它敏感细胞。病毒：流感病毒（IFV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。试剂：DMEM细胞培养基，新生小牛血清，胰蛋白酶或VTP消化液，PBS，青霉素100U/ml、链霉素100U/ml，MTT(4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑溴化物)，结晶紫染液等。材料：细胞培养板（1块/组），tip头（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/组），青霉素瓶带塞（10个/组），酒精缸，镊子（2个/组），1ml注射器，毛细吸管等。（3）操作步骤1）制备细胞将细胞生长面朝上，轻轻倒掉瓶中培养液，用PBS小心洗涤2次，注意吸管尖头不要伸到细胞瓶中。用上述吸管吸取1mlVTP加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；室温或手握住消化，约35min。当细胞胞质回缩、细胞间隙增大呈拉网状后，即可停止消化，尽可能弃尽消化液，继续利用残余的消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞瓶表面脱落下来为止。加入适量营养液到细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞充分使细胞均匀，吹打时动作要轻柔不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫。吸一滴细胞悬液于Ep管中。计数：用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与等量0.04台盼兰混匀，在计数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。当细胞密度为106/ml时即可。一瓶细胞消化后加入适量营养液制成所需细胞悬液，浓度约为1106/ml。用微量移液器将细胞悬液加入40孔板微孔中，每孔100l，37、5%CO2孵育箱培养24h，形成单层后，做病毒滴定用。2）50%组织细胞感染量（TCID50）测定稀释病毒液：取无菌青霉素瓶9支，各管分别加3%小牛血清的维持液2.7ml，然后向第一管加IFV病毒液0.3ml，反复吹吸混合三次，从第一管内吸液0.3ml加入第二管内，反复混合三次，从第二管内吸液0.3ml加入第三管内，反复混合三次，依此类推将待测的病毒液做连续10倍稀释，使病毒稀释为10-1，10-2，10-310-9。病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度的IFV病毒从低浓度开始依次加入各微孔中，每稀释度平行加2孔，每孔100l。细胞对照孔不加病毒液，只加维持液。置37、5%CO2孵育箱中孵育。结果观察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置显微镜下观察CPE，病毒可引起细胞圆缩、堆聚及脱落等现象。“-”表示细胞正常；“+”表示有25%细胞产生病变、圆缩、破碎脱落；“2+”有50%细胞产生病变；“3+”有75%细胞产生病变；“4+”有75%以上细胞产生病变（实验时，有的观察24h48h即可染色计算；或逐日观察CPE，直至病毒产生的CPE不再进展为止）。3）按Reed-Muench法计算TCID50，参见下表：10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/380累积数（孔）累积数（孔）病变细胞孔病变细胞孔病毒稀释度病毒稀释度 病变孔病变孔数数/接种孔数接种孔数有病变有病变无病变无病变比例比例百分比百分比%按表中可见，10-3稀释的病变高于50%；10-4稀释的病变低于50%；50%病变分布于10-3与10-4之间，计算公式如下：高于50%病变率-（50%）距离比例=-高于50%的病变率-低于50%的病变率lg稀释倍数100-50=-100-25lg10=-0.67lgTCID50=高于50%病变的低稀释度对数+距离比=-3+(-0.67)=-3.67即1个TCID50=10-3.67，查0.67的反对数为4.68，即病毒做4.68103倍稀释时取0.1ml接种细胞，可使50%细胞产生病变。附录：如何计算200个TCID50？4.68103200=23.4，将病毒作23.4倍稀释时即得200个TCID50。按计算结果，用100个TCID50病毒进行药物的体外抗病毒试验。2.病毒增殖及病毒感染单位量测定病毒增殖及病毒感染单位量测定2.1病毒增殖病毒增殖 将冻存的病毒株复苏后接种于敏感细胞进行增殖，23d后出现典型细胞病变，待病变达8090时收获病毒。反复冻融3次并低速离心取上清，分装后用空斑形成单位实验（plaqueformingunit,PFU）测定病毒的感染量，保存于-80备用。在进行药物的抗病毒试验中，亦可用该实验测定药物对病毒增殖的影响，而且结果可能更准确、可靠。2.2病毒感染单位量测定病毒感染单位量测定用PFU表示。以5.0105/ml的密度接种敏感细胞于6孔细胞板中。置37、5CO2细胞培养箱中培养，使其24h内长成单层；在冰盘上操作，用维持液将病毒作10倍连续系列稀释（10-110-8）（操作如下图所示）；注：即在一系列注：即在一系列2ml2ml的的EpEp管中先加入管中先加入1.8ml1.8ml维持液，取维持液，取0.2ml0.2ml病毒加入第一只病毒加入第一只EpEp管中，充分混匀后病毒稀管中，充分混匀后病毒稀释度为释度为1010-1，取混合后的，取混合后的0.2ml0.2ml病毒悬液加入第二只病毒悬液加入第二只EpEp管中作为稀释度管中作为稀释度10-2，依此类推作系列稀释，则得到连，依此类推作系列稀释，则得到连续续1010倍稀释的病毒悬液。倍稀释的病毒悬液。弃去细胞培养板中各孔中的营养液，每孔接种相应稀释度的病毒悬液0.5ml，每个稀释度重复3孔。37吸附2h，每15min摇动数下以保证病毒吸附分布均匀；弃去各孔中的病毒液，PBS轻轻洗涤一次。每孔加入2ml覆盖层（含6新生牛血清的DMEM与1.5琼脂糖等体积混匀，配好后立即使用，以免凝固），水平放置15min使其凝固；33，5CO2细胞培养箱中培养3d。剔除覆盖层，每孔加入1ml0.5结晶紫染色10min，自来水冲洗后选择空斑数清晰且易于分辨的稀释度计数空斑，根据空斑数计算病毒的PFU。下图显示的是RSV的空斑形成实验结果。PFU的计算方法：abPFUv（PFU：空斑形成形成单位/ml；a：空斑均数；b：病毒稀释度的倒数；v：病毒量/ml）1：正常对照；：正常对照；2 26 6：病毒：病毒稀释度分别为稀释度分别为104，10105，10106，10107，10108病毒的空斑形成实验结果示意图病毒的空斑形成实验结果示意图3216542.药物对细胞的毒性测定药物对细胞的毒性测定已长成单层的细胞（96孔板），倾去培养液，用PBS洗涤2次，加入用无血清1640作连续10倍系列稀释的受试药物，100l/孔，每个浓度重复4孔，并设正常细胞对照。整个实验重复3次。37、5%CO2孵箱中培养3d，观察细胞病变效应（CPE），按Reed-Muench法计算药物的半数中毒浓度（TD50）和最大无毒浓度（TD0）。阳性对照药的毒性测定，与受试药物同法同步在同一板中进行。4.药物的抗病毒实验药物的抗病毒实验4.1微量细胞病变抑制法微量细胞病变抑制法已长成单层的细胞（96孔板），倾去培养液，用PBS洗2次，加入100TCID50病毒，100l/孔，375%CO2下吸附2h，使病毒进入细胞内。弃病毒液，用DMEM液洗2次，洗去游离病毒。加入受试药的TD0浓度作连续2倍系列稀释的6个浓度，每个浓度均重复3孔，并分别设立细胞对照、病毒对照和空白对照孔，阳性对照药同上。37、5%CO2下培养3d，记录CPE，按Reed-Muench法计算能抑制50%CPE产生的药物有效浓度（EC50）。整个实验重复3次。4.2中性红染色法中性红染色法基本步骤同上，加入药物培养3d后待CPE不再进展时，弃维持液，用PBS洗2次，每孔加入0.2ml中性红染液（0.04%），避光，37、5%CO2孵育1.5h。弃染色液，用PBS洗2次，控干，每孔加入0.2ml的90%乙醇（无水乙醇：0.2M，pH4.2枸橼酸缓冲液=9：1），室温放置23h，摇匀，以空白对照孔调零，在酶标仪546nm处比色，测定其吸光度A值。根据各组的平均A值，计算药物的抑制百分率，再按Reed-Muench法计算50%抑制浓度（IC50）等各项结果。整个实验重复3次。 实验组平均实验组平均A值值-病毒对照组平均病毒对照组平均A值值抑制百分率抑制百分率 =细胞对照组平均细胞对照组平均A值值-病毒对照组平均病毒对照组平均A值值 100%4.3 MTT法法基本步骤同上，当病毒对照组细胞CPE在(+)(+)时弃培养液上清，每孔加入含5gLMTT的培养液50l，继续培养23h后弃去MTT上清，每孔加DMSO100l，混匀5min后，用酶标仪测570nm波长处的吸光度A值。按下述公式计算药物对病毒的抑制率：病毒抑制率(%)=(药物处理组A均值-病毒对照组A均值)/(细胞对照组A均值-病毒对照组A均值)100%，结合细胞毒性实验的结果，用统计软件SPSS13.0的Probit回归法，或按Reed-Muench法，计算受试药的半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50，并计算药物的治疗指数（TI）。4.4空斑抑制法空斑抑制法参照上述方法进行（略），与病毒对照组比较，计算药物的50%抑制浓度IC50。4.4药物对RSV侵入细胞的阻断作用根据药物毒性实验的结果，从药物的最大无毒浓度开始，将不同浓度受试药100l预先处理细胞2h,以PBS洗涤2次后用100TCID50的病毒每孔100l攻击,吸附2h，每隔15min摇晃1次，使病毒均匀吸附。弃病毒液,加100l细胞维持液，置37、5%CO2培养，每日观察并记录CPE。实验设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和药物组。当病毒对照组CPE在75%100%时弃培养液上清，每孔加入含5gLMTT的培养液50l，继续培养23h后弃去MTT上清，每孔加100lDMSO，混匀5min后，用酶标仪测490nm波长处的A值。按Reed-Muench法计算药物的半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50。4.5药物对药物对RSV的直接杀伤作用的直接杀伤作用根据药物毒性实验的结果，从药物的最大无毒浓度开始，将不同浓度的含药维持液与100l的100TCID50病毒等体积混合，37、5%CO2条件下作用2h后，再将其感染Hep-2细胞，100l/孔，吸附2h后用PBS洗涤2次，每日观察并记录细胞病变效应（CPE）。实验设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和药物组。当病毒对照组细胞CPE在75%100%时弃培养液上清，每孔加入含5gLMTT的培养液50l，继续培养23h后弃去MTT上清，每孔加DMSO100l，混匀5min后，用酶标仪测490nm波长处的A值。按Reed-Muench法计算药物的半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50。5.治疗指数（治疗指数（TI）按TI=TD50/EC50或TD50/IC50进行计算。药理学实验规定，TI4表示药物有效。三）体内抗病毒试验三）体内抗病毒试验1.实验动物的选择实验动物的选择 试验动物在病毒学研究中的用途主要有：分离与鉴定病毒、制备疫苗及诊断抗原、制备免疫血清、研究病毒的致病性、免疫性、发病机理及有效药物疗法等。病毒接种于何种动物以及选择何种接种途径，主要取决于病毒的种类和实验研究的目的。应根据实验需要选择最敏感动物作为实验对象，常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、乳鼠和猴子等，接种时要根据病毒对动物及组织细胞的亲嗜性而选择特定的部位，常用接种途径有鼻腔、腹腔、脑内、皮下、肌肉、静脉及小鼠经口接种、家兔角膜注射等。给药方式亦可有腹腔、灌胃、静脉注射、肌肉注射、吸入等。采集全血、血浆、血清、组织脏器或细胞等标本，进行相应指标的检测。为减少个体差异，一般试验选择成年动物，动物体重尽可能一致；如无特殊要求，实验动物的性别应先选雄性动物或雌雄各半，且动物要健康，雌性动物怀孕及授哺期不宜采用。此外，根据实验研究不同的精确程度要求，选择标准化试验动物。标准化试验动物是指按遗传控制方法和微生物控制标准培育而成的动物。按遗传学控制原理可分为近交系、远交系、突变系、杂交一代等，按微生物学控制原理可分为无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物、清洁动物等。病毒接种完成后，按一定级别的动物饲养标准饲养，对照组与实验组分笼饲养。2.病毒接种方法病毒接种方法2.1鼻腔接种法鼻腔接种法实验组小鼠先用乙醚浅麻后，将小鼠头部仰起，向鼻腔内缓慢滴入一定感染量的病毒悬液100l左右，正常对照组鼻腔滴入等量不含病毒的PBS或生理盐水，要掌握麻醉的深浅度。麻醉太深，小鼠能将病毒悬液直接吸入肺中，引起肺水肿，往往于接种后1d内死亡；麻醉太浅，小鼠又试图将接种物咳出。2.2小白鼠腹腔接种小白鼠腹腔接种（1）用无菌注射器以无菌操作法吸取病毒悬液，排除气泡（将注射器针头朝上，使气泡上升，在针头上裹以消毒棉球，然后轻轻将气泡推出）。（2）右手轻拖小白鼠尾，使其爬行于粗糙面上，迅速以左手拇指和食指抓紧小白鼠耳颈部皮肤，以无名指及小指将尾巴按在手掌上，使其腹部向上，用碘酒消毒腹部皮肤。（3）使小白鼠头部略向下垂，右手持已吸好病毒液的注射器，由腹股沟皮下刺穿皮肤，再沿腹壁下部刺入，抽吸注射器，如无回血或尿液，即可进行注射。注入病毒液0.5ml后将针头退出，用酒精棉球消毒针刺部位。（4）将小白鼠标记后放回鼠笼，观察结果。2.3皮内接种法皮内接种法 应选择白色动物或动物的白毛处（以背部皮肤为宜）。去毛消毒后，将皮肤绷紧，用1ml的注射器附以最小号的针头，平刺入皮肤，针尖向上，缓缓注入接种物，此时皮肤应出现小圆丘形隆起，否则表示不在皮内。2.4皮下接种法皮下接种法多选择腹股沟、腹壁中线或背部注射。局部去毛消毒后，用手拇指和食指将局部皮肤提起，右手将注射针头刺入提起的皮肤下，将接种物缓缓注入，些时可见注射处皮肤有轻度隆起，迅速拔出针头，并以酒精棉球按压片刻，防止注射物外溢。2.5肌肉接种法肌肉接种法多选择腿部肌肉注射。一人抓住实验动物，局部去毛消毒后，另一人将针头刺入肌肉层内，缓缓将接种物注入。2.6静脉接种法静脉接种法不同动物选择不同部位静脉注射。一般家兔选择耳静脉，大白鼠、小白鼠选择尾静脉。注射时先将动物固定，然后用手指轻弹或以酒精反复涂擦静脉所在部位，使静脉隆起，以小号针头刺入血管，缓缓推入注射物。在注入时，可见血管颜色变白，如果局部发现有隆起或注射物不易注入时，则表示针头未进入血管，应重新注射。2.7小白鼠脑内接种法小白鼠脑内接种法本法适用于一切脑炎病毒的分离培养之用。用1ml注射器抽取病毒悬液0.1ml，去除注射器内的气泡。取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指握住小白鼠的头部，左手掌轻轻按住小白鼠的体部。右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右颞部皮毛（不碰到眼）。右手拿注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向进入颅腔，进针23mm，不要插得太深，注射量为0.020.03ml。注射完毕，碘酒消毒注射局部，将小鼠放回笼中，室温隔离饲养。逐日观察动物发病情况，动物一般在34d开始发病，食欲减退，活动迟纯、耸毛、振颤、痉挛，慢慢发展为麻痹瘫痪而死亡。