LOGO基因分析的基本技术基因分析的基本技术2LOGOwww.themegallery.com四四. DNA序列测定序列测定五五. 酵母双杂交酵母双杂交Outline LOGOwww.themegallery.com 四、四、DNA序列测定序列测定DNA SequencingLOGOwww.themegallery.com -DNA链中，核苷酸链中，核苷酸 A, C, G, T的排列顺序的排列顺序-DNA序列的书写方向序列的书写方向: 5-35-TGATCGAGCGTA-3DNA 序列序列?LOGOwww.themegallery.com 1、DNA序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法（1）Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法利用利用2，3 -双脱氧核苷酸掺入终双脱氧核苷酸掺入终止聚合反应止聚合反应（2）Maxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基利用化学试剂裂解修饰碱基( dideoxy chain-termination method )变性聚丙烯凝胶电泳高分辨率，可分辨变性聚丙烯凝胶电泳高分辨率，可分辨相差一个核苷酸的相差一个核苷酸的DNADNA片段。片段。LOGOwww.themegallery.com Answer: Only 1 chain is amplified ： ss DNA; The chain contains the primer. 这也叫这也叫不对称不对称PCR。背景知识背景知识 1：What will happen if we add only 1 primer in PCR reaction?Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法LOGOwww.themegallery.com 背景知识背景知识 2：PCR反应的底物：反应的底物：dNTP, ddNTP双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸(ddNTP)(ddNTP)单脱氧核苷酸单脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)3 3-5-5磷磷酸二酯键酸二酯键 不不 能能 延延 伸伸! !MLOGOwww.themegallery.com 1). In 1 primer PCR, a sequencing primer is annealed to a DNA template and a DNA polymerase extends the primer using dNTPs.2）If a ddNTP is incorporated into extending chain, the reaction will be terminated because ddNTP has no 3 -OH on the deoxyribose.dATP和和ddATP按一定比例加入，保证链能够延伸，按一定比例加入，保证链能够延伸，并以一定比例终止延伸。并以一定比例终止延伸。LOGOwww.themegallery.com从而获得从而获得一系列一系列长度不同的长度不同的DNADNA片段。片段。 LOGOwww.themegallery.com OHHdNTPddNTPDNA聚合酶聚合酶Template Primer New strand* 以以不对称不对称PCRPCR技术为中心，技术为中心，* 利用利用双脱氧核苷酸终止新双脱氧核苷酸终止新链的延伸链的延伸，* 从而获得从而获得在任何一个核苷在任何一个核苷酸上随机终止的一系列酸上随机终止的一系列长度长度不同的不同的DNADNA片段。片段。* *变性聚丙烯凝胶电泳变性聚丙烯凝胶电泳分辨仅分辨仅差一个核苷酸长度差一个核苷酸长度的的DNADNA片段。片段。LOGOwww.themegallery.com GGATCCGTATATGCATAGCAGAT35单链模板ddGTP加入引物， 32P-dATP,dGTP,dCTP,dTTP DNA 聚合酶ddATPddTTPddCTPGGATCCGTATATGCATAGCAGAT3553引物CCTAGGCCTAGCCTACCTAGGCACCTCCTAGGCATCCTAGGCATATCCCCCTAGGCATACCTAGGCCCTAGGCATATA53阅读四管反应，分别标记为G、A、T、CGATCGATC聚丙烯酰胺凝胶电泳*变性聚丙烯凝胶变性聚丙烯凝胶电泳电泳分辨仅差一分辨仅差一个核苷酸长度个核苷酸长度的的DNA片段片段LOGOwww.themegallery.comPolyacrylamide Gel Electrophoresis ( PAGE) for DNA sequencing聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳胶电泳LOGOwww.themegallery.com 动画动画LOGOwww.themegallery.com手工测序手工测序: :读序长度读序长度: : 约约 300bp300bp结果通过人工肉眼分析结果通过人工肉眼分析 MLOGOwww.themegallery.comDNA序列自动分析序列自动分析 LOGOwww.themegallery.com 自动化的毛细管电泳自动化的毛细管电泳Side ViewDNADNA测序仪：其实它就是将测序测序仪：其实它就是将测序PCRPCR产物进行产物进行PAGEPAGE，电泳时激发，电泳时激发出四色荧光，并进行软件分析。出四色荧光，并进行软件分析。LOGOwww.themegallery.com DNA 测序仪自动测序测序仪自动测序:读序长度读序长度: 500-700bp4色荧光标记：色荧光标记：Fam, Hex, Rox, Tamra软件自动读序：软件自动读序：数据分析的自动化数据分析的自动化自动测序自动测序LOGOwww.themegallery.comLOGOwww.themegallery.com 2、DNA序列分析可以揭示基因和基因组一级结构序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化变化（1）通过）通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异序列分析可以鉴定基因和基因组的变异（2）通过）通过DNA序列测定分析人工重组的基因序列测定分析人工重组的基因（3）通过）通过DNA序列测定对定点突变进行确认序列测定对定点突变进行确认LOGOwww.themegallery.com 四、四、DNA序列测定序列测定DNA Sequencing二、二、DNA序列测定的应用序列测定的应用一、双脱氧链终止法进行一、双脱氧链终止法进行DNA测序的基本原理测序的基本原理*Short Summary of this part：LOGOwww.themegallery.com 五、五、酵母双杂交酵母双杂交Yeast-Two-HybridLOGOwww.themegallery.com 酵母双杂交：酵母双杂交：探测蛋白探测蛋白-蛋白的相互作用蛋白的相互作用在酵母中研究活细胞内蛋白质相互作用的技术平台；在酵母中研究活细胞内蛋白质相互作用的技术平台；体内体内检测特异性检测特异性蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质- -蛋白质相互作用蛋白质相互作用蛋白质相互作用蛋白质相互作用的敏感方法。的敏感方法。是很多生命现象是很多生命现象的基础的基础LOGOwww.themegallery.com 转录因子的结构特征转录因子的结构特征 有两个独立的功能结构域：有两个独立的功能结构域： DNA结合域（结合域（DNA binding domain，BD） 转录活化结构域转录活化结构域(Activation domain, AD）DNA binding domainActivation domainReporter geneBinding siteProtein 1Protein 2基本原理基本原理二者单独分别作用并不能激活转录反应，当二者在空间上充分接近时，二者单独分别作用并不能激活转录反应，当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的则呈现完整的GAL4转录因子活性，使启动子下游基因得到转录。转录因子活性，使启动子下游基因得到转录。LOGOwww.themegallery.com两个结构域分别与两个蛋白融合：两个结构域分别与两个蛋白融合：基本原理基本原理当分别含当分别含BD、AD的融合蛋白单独存在时，的融合蛋白单独存在时，无转录因子的活性；无转录因子的活性；LOGOwww.themegallery.com 当两个分开的结构域相互靠近时，当两个分开的结构域相互靠近时，恢复转录因子的活性恢复转录因子的活性DNA binding domainActivation domainReporter geneProtein 1Protein 2Binding site基本原理基本原理LOGOwww.themegallery.com 利用利用蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质相互作用来来激活报告基因的转录激活报告基因的转录激活因子激活因子，并以报告基因表达产物作为检测信号来判断蛋白质间并以报告基因表达产物作为检测信号来判断蛋白质间的相互作用。的相互作用。报告基因报告基因转录转录酵母双杂交的原理酵母双杂交的原理LOGOwww.themegallery.com酵母双杂交系统的酵母双杂交系统的报告基因报告基因GAL4GAL4转录激活因子转录激活因子转录激活因子转录激活因子调控下报告基因转录、表达，调控下报告基因转录、表达，可在体外通过一定的方法检测其表达产物的存在。可在体外通过一定的方法检测其表达产物的存在。 l -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZ）l营养代谢有关基因（如营养代谢有关基因（如His基因）基因）l使底物使底物X-GAL显色显色l可使酵母细胞在相应营养物质缺乏的平板上生长可使酵母细胞在相应营养物质缺乏的平板上生长LOGOwww.themegallery.com酵母双杂交的酵母双杂交的宿主细胞宿主细胞对宿主酵母细胞要进行相应的改造对宿主酵母细胞要进行相应的改造如：如： 在酵母染色体基因组，构建上游调控元件为在酵母染色体基因组，构建上游调控元件为GAL4调控区的报告基因；调控区的报告基因；突变宿主细胞内源突变宿主细胞内源GAL4转录激活因子的基因，转录激活因子的基因，使其不表达，因此报告基因的转录完全依赖外源表达使其不表达，因此报告基因的转录完全依赖外源表达并具有活性的并具有活性的GAL4。 LacZ gene LOGOwww.themegallery.com酵母双杂交的酵母双杂交的基本程序基本程序1、构建表达载体构建表达载体: 2 个个 （1）Gal4-BD融合蛋白表达载体融合蛋白表达载体 （2）Gal4-AD融合蛋白表达载体融合蛋白表达载体2、转化转化酵母菌株酵母菌株3、筛选筛选发生蛋白质发生蛋白质-蛋白质相互作用的酵母株蛋白质相互作用的酵母株4、分析分析相互作用蛋白质相互作用蛋白质 LOGOwww.themegallery.com MLOGOwww.themegallery.com应用：应用：1 1、分析已知蛋白质间的相互作用、分析已知蛋白质间的相互作用2 2、筛选与已知蛋白质相互作用的未知蛋白、筛选与已知蛋白质相互作用的未知蛋白3 3、确定相互作用蛋白质的结构域与氨基酸序列、确定相互作用蛋白质的结构域与氨基酸序列 对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸。是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸。 LOGOwww.themegallery.comsummary 一一. 核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交二二. DNA芯片技术芯片技术三三. 几种特殊的几种特殊的PCR技术技术四四. DNA序列测定序列测定五五. 酵母双杂交酵母双杂交LOGOwww.themegallery.comDNA水平水平RNA 水平水平蛋白质水平蛋白质水平定性分析定性分析定量分析定量分析 DNA 序序 列列 分分 析析核核 酸酸 分子分子 杂杂 交交 内掺内掺RT-PCR 实实 时时 荧光定量荧光定量 PCR Chips 基因分析基因分析 LOGO