RT-PCR及其产物电泳分析及其产物电泳分析 中南大学中南大学1实验目的实验目的实验目的实验目的q熟悉熟悉RT反应的原理；掌握反应的原理；掌握RT反应的操作步骤反应的操作步骤q熟悉熟悉PCR反应的原理反应的原理q掌握掌握PCR反应的操作步骤以及反应的操作步骤以及PCR反应参数的选择与优化反应参数的选择与优化q掌握掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法2实验原理实验原理实验原理实验原理RT反反应应：在在逆逆转转录录酶酶作作用用下下，以以mRNA为为模模板板合合成成cDNA（complementaryDNA）分分子子的过程。的过程。PCR反反应应：PCR扩扩增增是是模模拟拟天天然然DNA复复制制过过程程，利利用用DNA聚聚合合酶酶在在体体外外扩扩增增一一对对引引物物之之间间特特异异性性DNA片片段段的的方方法法。其其主主要要热热循循环环过过程程可可分分为为三三个个步步骤骤：（1）变变性性；（2）退退火火；（3）延伸）延伸。RT-PCR:以以RT反反应应产产物物cDNA分分子子为为模模板板进进行行特特异异性性PCR扩扩增增的的过过程程，是是检检测测基基因因表表达达最常用的方法。最常用的方法。3RTRT反应试剂反应试剂反应试剂反应试剂（1）引物引物：Oligo(dT)16，寡聚胸甘酸，寡聚胸甘酸16个，要求个，要求mRNA有有poly(A)尾巴（尾巴（mRNA1-4%）（2）逆转录酶逆转录酶：鼠白血病病毒莫洛尼株鼠白血病病毒莫洛尼株（MMLV）、鸟类成髓细胞瘤病毒（）、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）（3）RT反应缓冲液反应缓冲液：常用：常用5浓度。浓度。（4）底物底物：即四种：即四种dNTP的混合物溶液，常用的混合物溶液，常用10浓度（浓度（2mmol/L或或2.5mmol/L）。）。（5 5）模板模板（6）RNasin4PCRPCR反应试剂反应试剂反应试剂反应试剂（1）引物引物：一对，单链的：一对，单链的10-30nt长的长的DNA片段。片段。（2）TaqDNA聚合酶聚合酶（3）PCR反应缓冲液反应缓冲液：常用：常用10浓度，一般组成为浓度，一般组成为15mmol/LMgCl2、250mmol/LKCl等。等。（4）底物底物：即四种：即四种dNTP的混合物溶液，常用的混合物溶液，常用10浓度（浓度（2mmol/L或或2.5mmol/L）。）。（5 5）模板模板56RT-PCR原理原理7微量移液器微量移液器台式微量离心机台式微量离心机 电泳槽电泳槽凝胶成像系统凝胶成像系统主要仪器主要仪器主要仪器主要仪器 电泳仪电泳仪 热循环仪热循环仪8实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤（1）标记一个洁净的）标记一个洁净的1.5mL反应管，向其中依次加入：反应管，向其中依次加入：RNA溶液溶液5LRTmix15L20L（2）盖紧管盖，轻轻混匀后，离心）盖紧管盖，轻轻混匀后，离心30s，使反应成份均匀富集于管底。，使反应成份均匀富集于管底。（3）42水浴水浴30min。RTmix的成分的成分：RNasin、5RT反应缓冲液、反应缓冲液、2.5mMdNTPs、Oligo(dT)16、逆转录、逆转录酶酶(MMLV)9实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤（4）标记一个洁净的）标记一个洁净的200L反应管，向其中依次加入：反应管，向其中依次加入：ddH2O6L2PCRmix10LPrimermix2LcDNA模板模板2L20L（5）混合均匀后，离心）混合均匀后，离心30S，使反应成份均匀富集于管底。，使反应成份均匀富集于管底。PCRmix的成分的成分：PCR反应缓冲液、反应缓冲液、2.5mMdNTPs、TaqDNA聚合酶聚合酶10实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤（6）在）在PCR仪上设置反应循环参数仪上设置反应循环参数:本次实验为：本次实验为：9420s，5620s，7220s，循环数为，循环数为26，最后于，最后于72充分延伸充分延伸5min后，终止反应。后，终止反应。（7）置反应管于）置反应管于PCR仪上进行热循环。仪上进行热循环。（8）反应完毕后，取）反应完毕后，取5LPCR产物，于产物，于1.5琼脂糖凝胶电泳检测结果。琼脂糖凝胶电泳检测结果。11注意事项注意事项注意事项注意事项1.戴手套操作，避免污染。戴手套操作，避免污染。2.尽量冰上操作。尽量冰上操作。3.取样准确，体系正确。取样准确，体系正确。4.一定要有内参。一定要有内参。 12PCRPCR平台期平台期平台期平台期PCR扩增有限性扩增有限性-平台期平台期经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA分子数不再呈指数积累，分子数不再呈指数积累，而是进入而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。13PCR的离子需要的离子需要Taq酶活性对酶活性对Mg2+浓度和单价离子（浓度和单价离子（K+或或NH4+）的性质和浓度较敏感。）的性质和浓度较敏感。一般一般PCR反应中反应中MgCl2浓度在浓度在2.0mmol/L时酶活性最高，时酶活性最高，Mg2+浓度偏高，酶活性反受抑浓度偏高，酶活性反受抑制。制。变性剂的加入有助于模板变性，消除复杂二级结构，但不同变性剂及浓度对酶活性损害变性剂的加入有助于模板变性，消除复杂二级结构，但不同变性剂及浓度对酶活性损害程度不同。程度不同。14PCR引物用量引物用量一般一般PCR反应引物的终浓度为反应引物的终浓度为0.21mol/L，在此范围内，在此范围内，PCR产物量基本相同。产物量基本相同。但引物低于但引物低于0.2mol/L时，则产量降低。时，则产量降低。引物浓度过高会促进引物错误引导非特异产物合成，还会增加引物浓度过高会促进引物错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体引物二聚体的形成。的形成。15结果分析结果分析结果分析结果分析M123 M：100bp梯级梯级DNA分子量标志物；分子量标志物；泳道泳道1：阳性对照；：阳性对照；泳道泳道2：靶：靶DNA扩增；扩增；泳道泳道3：阴性对照：阴性对照图图1PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳产物检测的琼脂糖凝胶电泳观察结果：观察结果： 是否有扩增产物。是否有扩增产物。如有拖尾或有几条区带如有拖尾或有几条区带, ,说明有非特异性扩增。说明有非特异性扩增。分子量标准电泳后区带是否分开。分子量标准电泳后区带是否分开。与分子量标准比较，与分子量标准比较，PCRPCR产物的长度是否正确。产物的长度是否正确。PCRPCR产物的产量。产物的产量。引物二聚体。引物二聚体。RT-PCR检测人检测人-actin基因表达（扩增产物长度基因表达（扩增产物长度260bp）16问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法 无无PCR产物产物1.确保确保mRNA无降解。无降解。2.确保酶未失活。确保酶未失活。3.确保引物无降解。确保引物无降解。4.重新设置退火温度。重新设置退火温度。5.重新设置变性温度。重新设置变性温度。17问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法 PCR产物呈拖尾现象产物呈拖尾现象1.提高退火温度。提高退火温度。2.减少减少TaqDNA聚合酶的用量。聚合酶的用量。3.试用二步法进行试用二步法进行PCR扩增。扩增。4.调节调节Mg2+浓度，使之最优化。浓度，使之最优化。TaqDNA聚合酶发挥活性需要聚合酶发挥活性需要Mg2+参与，通过参与，通过Mg2+介导与模板介导与模板DNA、引物及、引物及dNTP结合。通常结合。通常Mg2+浓度为浓度为0.52.5mM，Mg2+浓度过高，将引起非特异扩浓度过高，将引起非特异扩增产物增多；反之，增产物增多；反之，Mg2+浓度过低则导致产量降低。浓度过低则导致产量降低。5.减少延伸时间。减少延伸时间。6.减少循环次数。减少循环次数。7.设计新的引物。设计新的引物。8.采用热启动法进行采用热启动法进行PCR。18问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法 引物二聚体引物二聚体1.防止引物防止引物3端互补。端互补。2.设计较长的引物。设计较长的引物。3.增大模板的量。增大模板的量。PCR产量随模板产量随模板DNA浓度的增加而显著升高，模板浓度的增加而显著升高，模板DNA浓度过高会导致非浓度过高会导致非特异性产物增加。特异性产物增加。4.降低引物浓度。一般为降低引物浓度。一般为0.10.5M。引物浓度过高，将错误启动延伸（即错误引发），导。引物浓度过高，将错误启动延伸（即错误引发），导致非特异性产物堆积，还可形成引物二聚体；引物浓度过低则可导致扩增产量下降。致非特异性产物堆积，还可形成引物二聚体；引物浓度过低则可导致扩增产量下降。5.减少循环次数。减少循环次数。6.提高退火温度。提高退火温度。19PCRPCR体系的优化体系的优化体系的优化体系的优化PCR循环参数的优化循环参数的优化 变性变性 9595变性变性20203030秒即可使双链模板秒即可使双链模板DNADNA完全解链为单链，变性温度过高和过低均完全解链为单链，变性温度过高和过低均会导致会导致DNADNA聚合酶活性的丧失。聚合酶活性的丧失。 退火退火 引物与模板的退火温度有引物的长度及引物与模板的退火温度有引物的长度及GCGC含量决定。退火温度由含量决定。退火温度由TmTm值确定：值确定：TmTm4 4（G+CG+C）+2(A+T), +2(A+T), 退火温度比退火温度比TmTm低低3 31212。 延伸延伸 延伸温度取决于延伸温度取决于DNADNA聚合酶的最适温度（聚合酶的最适温度（70707575；延伸时间由扩增片段的长度；延伸时间由扩增片段的长度决定（决定（500bp 30s,500-1200bp 40s500bp 30s,500-1200bp 40s）。）。 循环次数循环次数 PCRPCR循环次数取决于模板循环次数取决于模板DNADNA的浓度，一般为的浓度，一般为25253535次，次，PCRPCR产物可达最大值。产物可达最大值。20PCRPCR体系的优化体系的优化体系的优化体系的优化PCR反应成分浓度的优化反应成分浓度的优化TaqDNA聚合酶：聚合酶：12.5U/100L反应液。反应液。dNTP浓度：浓度：20200mol/L，且四种底物浓度相等，以减少错误掺入的机会。，且四种底物浓度相等，以减少错误掺入的机会。Mg2+浓度浓度：0.52.5mmol/L引物浓度：引物浓度：0.10.5mol/L总之：浓度过低，总之：浓度过低，PCR扩增产量下降；浓度过高，扩增产量下降；浓度过高，PCR特异性下降，甚至降低扩增效率。特异性下降，甚至降低扩增效率。21PCRPCR体系的优化体系的优化体系的优化体系的优化其它措施其它措施采用具有高校正活性外切酶的耐热采用具有高校正活性外切酶的耐热DNA聚合酶。聚合酶。重新设计引物。重新设计引物。重新准备高质量的模板（如完整性和纯度）。重新准备高质量的模板（如完整性和纯度）。22谢 谢！23