微生物生长繁殖微生物生长繁殖本章内容本章内容一、一、生物生长的测定生物生长的测定1. 1. 以数量变化对微生物生长情况进行测定以数量变化对微生物生长情况进行测定2. 2. 以生物量为指标测定微生物的生长以生物量为指标测定微生物的生长二、二、 细菌的群体生长繁殖细菌的群体生长繁殖1. 1. 生长曲线生长曲线2. 2. 同步培养同步培养3. 3. 连续培养连续培养三、三、 微生物生长繁殖的控制微生物生长繁殖的控制1. 1. 控制微生物生长的化学物质控制微生物生长的化学物质2. 2. 控制微生物生长的物理因素控制微生物生长的物理因素一、一、生物生长的测定生物生长的测定微生物生长的测定：微生物生长的测定：个体计数个体计数：生物量测定生物量测定：重量测定、生理指标测定：重量测定、生理指标测定（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）一、一、生物生长的测定生物生长的测定1、稀释平板计数法、稀释平板计数法对样品进行适当稀释对样品进行适当稀释 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖 肉眼可见的菌落肉眼可见的菌落 对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定一、一、生物生长的测定生物生长的测定2、涂布平板法、涂布平板法使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！（一般使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！（一般0.2ml）（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定同一稀释度三个以上重复同一稀释度三个以上重复,取平均值；取平均值；每支移液管及涂布棒只能接触一个每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；稀释度的菌液；样品充分混匀；样品充分混匀；每个平板上的菌落数目合适，便于每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；准确计数；要求：要求：每每ml活菌数同一稀释度平均数活菌数同一稀释度平均数稀释倍数稀释倍数5注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌一、一、生物生长的测定生物生长的测定3.显微镜直接计数法显微镜直接计数法采用采用细菌计数板细菌计数板或或血球计数板血球计数板，显微镜下直接计数，显微镜下直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。（计算一定容积里样品中微生物的数量）。（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定每每ml原液含菌数每小格平均菌数原液含菌数每小格平均菌数400 1000 稀释倍数稀释倍数一、一、生物生长的测定生物生长的测定显微镜直接计数法缺点：显微镜直接计数法缺点：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；一、一、生物生长的测定生物生长的测定（三）以生物量为指标测定微生物的生长（三）以生物量为指标测定微生物的生长1、比浊法、比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即即O.D.)表示菌量。表示菌量。注意：注意：测量应在菌浓度与测量应在菌浓度与O.D.成正比的线性范围内，否则不准成正比的线性范围内，否则不准一、一、生物生长的测定生物生长的测定2、重量法、重量法以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法（三）以生物量为指标测定微生物的生长（三）以生物量为指标测定微生物的生长一、一、生物生长的测定生物生长的测定3、 生理指标法生理指标法呼吸强度呼吸强度耗氧量耗氧量酶活性酶活性 与其群体的规模成正相关与其群体的规模成正相关生物热生物热样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪瓦勃氏呼吸仪、微量量热微量量热计计等设备来测定相应的指标。等设备来测定相应的指标。（三）以生物量为指标测定微生物的生长（三）以生物量为指标测定微生物的生长二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖生长曲线：生长曲线：细菌接种到细菌接种到定量的定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。在整个培养期间菌数变化规律的曲线。包括：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期包括：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期1.迟缓期（迟缓期（lag phase）细胞分裂之前的准备，适应环境。细胞分裂之前的准备，适应环境。将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期延迟期、适应期适应期。（一）生长规律（一）生长规律一条典型的生长曲线至少可以分为一条典型的生长曲线至少可以分为 迟缓期迟缓期，对数期对数期，稳定期稳定期和和衰亡期衰亡期等四个生长时期等四个生长时期二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖延缓期特点：延缓期特点：t细胞形态变大或增长，细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。倍。一般来说处一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；于迟缓期的细菌细胞体积最大；t 细胞内细胞内RNA，尤其是，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。的合成加快，易产生诱导酶。t 对外界不良条件反应敏感。对外界不良条件反应敏感。（一）生长规律（一）生长规律二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖减少迟缓期时间措施：减少迟缓期时间措施：（1）遗传学方法改变种的遗传特性）遗传学方法改变种的遗传特性（2）用）用对数生长期对数生长期的做种子的做种子（3）接种前后）接种前后培养基成分培养基成分不要相差太大不要相差太大（4）适当扩大）适当扩大接种量接种量（一）生长规律（一）生长规律二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖2.对数生长期（对数生长期（log phase）这时的细菌代谢活性、酶活性稳定且高；大小这时的细菌代谢活性、酶活性稳定且高；大小一致；生活力强；用做种子和实验材料。一致；生活力强；用做种子和实验材料。3.稳定期（稳定期（stationary phase）生长率为生长率为0，菌数最多并维持稳定，积累代谢产，菌数最多并维持稳定，积累代谢产物的好时期。物的好时期。（一）生长规律（一）生长规律二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖对数期到稳定期对数期到稳定期的转变是的转变是细胞重要的分化调节阶段：细胞重要的分化调节阶段： 1 1）开始储存糖原等内含物；）开始储存糖原等内含物； 2 2）形成芽孢或建立自然感受态（）形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌）芽孢杆菌） 3 3）发酵过程积累代谢产物的重要阶段；发酵过程积累代谢产物的重要阶段； 某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期（一）生长规律（一）生长规律生产上延长稳定期的方法：生产上延长稳定期的方法： 补充营养物质（补料）或取走代谢产物；补充营养物质（补料）或取走代谢产物； 调节调节pH、调节温度；、调节温度； 对好氧菌增加通气、搅拌或振荡对好氧菌增加通气、搅拌或振荡二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖4.衰亡期（衰亡期（death phase）特点：特点：细菌代谢活性降低；细菌代谢活性降低；细菌衰老并出现细菌衰老并出现自溶自溶；产生或释放出一些产物；产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊； 有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应（一）生长规律（一）生长规律二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或例如葡萄糖或NH+4等等)；有的需要经过；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前等）。前者通常称为者通常称为速效碳源（或氮源）速效碳源（或氮源），后者称为后者称为迟效碳源（或迟效碳源（或氮源氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成生物在生长过程中会形成二次生长二次生长现象。现象。（一）生长规律（一）生长规律二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为间为代时代时(Generation time)。代时通常以代时通常以G表示。表示。在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增倍增时间时间（Doubling time)。（二）（二） 生长数学模型生长数学模型dNdtNN：每毫升培养液中细胞数：每毫升培养液中细胞数 ：比生长速率，每单位数量细菌：比生长速率，每单位数量细菌 在单位时间增加的量在单位时间增加的量t：培养时间：培养时间 t t1 1 t t0 0.6390 0.639G = = G = = n n m m二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖使群体中不同步的转变为同步生长或繁殖的方法。使群体中不同步的转变为同步生长或繁殖的方法。常用来常用来科学研究科学研究和做和做种子种子。通过同步培养方法获得的细胞被称为通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞同步细胞或或同步培养物。同步培养物。分为：分为：机械法机械法 环境条件控制法环境条件控制法 （三）同步培养（三）同步培养二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖1、机械法、机械法根据不同阶段细胞体积与质量或跟某种材料结根据不同阶段细胞体积与质量或跟某种材料结合程度不同。合程度不同。（1）离心法）离心法（2）过虑分离法）过虑分离法（3）硝酸纤维素膜法）硝酸纤维素膜法（三）同步培养（三）同步培养硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖2.环境条件控制法环境条件控制法（1）温度）温度（2）培养基成分控制）培养基成分控制（3）其他）其他，如：光，如：光（三）同步培养（三）同步培养由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，个世代，随后又逐渐转变为随机生长。随后又逐渐转变为随机生长。二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖采取一定措施使微生物以采取一定措施使微生物以恒定比生长速率恒定比生长速率生长生长并持续。并持续。培养过程中不断的培养过程中不断的补充营养物质补充营养物质和以同样的速率和以同样的速率移出培养移出培养物物是实现微生物连续培养的是实现微生物连续培养的基本原则基本原则。（四）连续培养（四）连续培养dNdt=N 菌数增加速率菌数增加速率dNdt=DN 菌数减少速率菌数减少速率二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖D：稀释率，：稀释率，即即培养基每小时流过培养容器的体积数培养基每小时流过培养容器的体积数D，细菌数会增加细菌数会增加，营养物消耗和代谢产物积累，营养物消耗和代谢产物积累导致细菌停止生长导致细菌停止生长。 D，维持平衡维持平衡D，菌被稀释菌被稀释（四）连续培养（四）连续培养二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖连续培养两种类型：连续培养两种类型：恒化器连续培养恒化器连续培养、恒浊器连续培养恒浊器连续培养恒化恒化：某种营养物质维持恒定某种营养物质维持恒定恒浊恒浊：菌恒定菌恒定（四）连续培养（四）连续培养二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖恒浊器连续培养恒浊器连续培养（四）连续培养（四）连续培养测定所培养微生物的光密度值测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖恒浊器连续培养恒浊器连续培养连续发酵优点：连续发酵优点： 缺点：缺点：（四）连续培养（四）连续培养一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业 缩短发酵周期，提高设备利用率；缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制；便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度；降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；产品质量较稳定；杂菌污染和菌种退化杂菌污染和菌种退化二、二、群体生长繁殖群体生长繁殖恒化器连续培养恒化器连续培养使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。高生长速率下进行生长繁殖。恒化连续培养恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，作为较低的浓度，作为限制性因子限制性因子，而其他营养物均过量，而其他营养物均过量。限制性因子限制性因子必须是必须是机体生长所必需的营养物质机体生长所必需的营养物质，如，如aaaa和氨等氮和氨等氮源，或源，或G G、麦芽糖等碳源或者是无机盐，、麦芽糖等碳源或者是无机盐，一定浓度范围内决定一定浓度范围内决定细菌生长速率细菌生长速率。（四）连续培养（四）连续培养三、环境对生长影响三、环境对生长影响环境对生长影响环境对生长影响1.营养物质营养物质2.水活性水活性3.温度温度影响：酶活性影响：酶活性、CM流动性、物质溶解度4.pH5.氧氧四、生长繁殖控制四、生长繁殖控制控制（有害）微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，控制（有害）微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。在实际应用中具有重要的意义。抑制：抑制：亚致死剂量因子作用使生长停止亚致死剂量因子作用使生长停止死亡死亡：生长能力不可逆丧失：生长能力不可逆丧失防腐防腐：理化因素防止或抑制微生物生长：理化因素防止或抑制微生物生长消毒消毒：杀死或灭活所有：杀死或灭活所有病原微生物病原微生物灭菌灭菌：杀死杀死包括芽孢在内的所有菌包括芽孢在内的所有菌化疗化疗：选择毒性化学物质对生物体内部感染组织：选择毒性化学物质对生物体内部感染组织 或细胞进行治疗，对机体本身无毒害作用。或细胞进行治疗，对机体本身无毒害作用。四、生长繁殖控制四、生长繁殖控制1.抗微生物剂（抗微生物剂（antimicrobial agent）杀死杀死或或抑制抑制微生物生长的化学物质。微生物生长的化学物质。分以下几种：分以下几种：抑菌剂抑菌剂（bacteriostatic agent）：抑制生长不能杀死）：抑制生长不能杀死杀菌剂杀菌剂（bactericide）：杀死不裂解细胞）：杀死不裂解细胞溶菌剂溶菌剂（bacteriolysis）：诱导细胞裂解）：诱导细胞裂解（一）控制微生物的化学物质（一）控制微生物的化学物质四、生长繁殖控制四、生长繁殖控制消毒剂：消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。防腐剂：防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组 织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。抗微生物剂又叫杀菌剂，分消毒剂和防腐剂。抗微生物剂又叫杀菌剂，分消毒剂和防腐剂。四、生长繁殖控制四、生长繁殖控制2.抗代谢物抗代谢物生长因子的结构类似物干扰达到抑制微生物生长目的。生长因子的结构类似物干扰达到抑制微生物生长目的。如：如：叶酸对抗物（叶酸对抗物（磺胺磺胺）、 嘌呤对抗物（嘌呤对抗物（6-巯基嘌呤巯基嘌呤）、）、 苯丙氨酸对抗物（苯丙氨酸对抗物（对氟苯丙氨酸对氟苯丙氨酸）、）、 尿嘧啶对抗物（尿嘧啶对抗物（5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶） 胸腺嘧啶对抗物（胸腺嘧啶对抗物（5-溴胸腺嘧啶溴胸腺嘧啶） 等等等等四、生长繁殖控制四、生长繁殖控制3.抗生素（抗生素（antibiotic）某些生物合成或半合成的次级代谢产物或衍生物，抑某些生物合成或半合成的次级代谢产物或衍生物，抑制或杀死其他微生物。制或杀死其他微生物。主要通过：主要通过：抑制抑制CW合成、破坏合成、破坏CM、作用呼吸链、抑制、作用呼吸链、抑制Pr核酸合成。核酸合成。四、生长繁殖控制四、生长繁殖控制导致抗药性菌株：导致抗药性菌株：细胞质膜透性改变：细胞质膜透性改变：使抗生素不进入细胞或进入细胞使抗生素不进入细胞或进入细胞 后被细胞主动排出；后被细胞主动排出；药物作用靶改变：药物作用靶改变：合成了修饰抗生素的酶：合成了修饰抗生素的酶：抗性菌株发生遗传变异抗性菌株发生遗传变异：导致合成新的多聚体，以取：导致合成新的多聚体，以取 代或部分取代原来的多聚体代或部分取代原来的多聚体四、生长繁殖控制四、生长繁殖控制所以，抗生素使用要：所以，抗生素使用要：第一次剂量充足；第一次剂量充足；避免长时间重复使用一种抗生素；避免长时间重复使用一种抗生素；不同抗生素混合使用；不同抗生素混合使用；对现有抗生素改造；对现有抗生素改造；筛选更新抗生素；等筛选更新抗生素；等四、生长繁殖控制四、生长繁殖控制1.高温高温高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌煮沸消毒煮沸消毒间歇灭菌间歇灭菌干热灭菌干热灭菌热敏感物质采用超高温热敏感物质采用超高温135150，26s，如：牛奶、如：牛奶、液体食品等。液体食品等。巴斯德消毒法巴斯德消毒法：60-85处理处理15秒至秒至30分钟分钟（一）控制微生物的物理因素（一）控制微生物的物理因素四、生长繁殖控制四、生长繁殖控制十倍致死时间（十倍致死时间（decimal reduction,D）：）：一定温度一定温度条件微生物数量十倍减少所需要的时间条件微生物数量十倍减少所需要的时间。D值大小还随值大小还随微生物的种类微生物的种类、生长时期生长时期、检测培养基检测培养基的性质等因素有关。的性质等因素有关。多数细菌和真菌的营养细胞：在多数细菌和真菌的营养细胞：在60左右处理左右处理5-10分钟分钟；酵母菌和真菌的孢子：用酵母菌和真菌的孢子：用80以上温度处理；以上温度处理；细菌的芽孢：细菌的芽孢：121处理处理15分钟分钟以上；以上；四、生长繁殖控制四、生长繁殖控制2.辐射作用辐射作用电磁辐射产生的电磁波，如：微波、电磁辐射产生的电磁波，如：微波、UVUV、X X射线等射线等3.过滤作用：过滤作用：不耐热培养基不耐热培养基4.高渗作用高渗作用高渗产生质壁分离，不利于生长5.干燥干燥6.超声波超声波练习题1、细菌的生长繁殖与高等动植物的有哪些异同？、细菌的生长繁殖与高等动植物的有哪些异同？2、其典型生长曲线可分几期，其划分依据是什么？、其典型生长曲线可分几期，其划分依据是什么？3、结合本章的知识，总结在日常生活中有哪些措施、结合本章的知识，总结在日常生活中有哪些措施 是被用来抑制或杀灭微生物的。是被用来抑制或杀灭微生物的。