医药卫生医药卫生 抗菌药物抗菌药物主要内容抗菌药物的敏感性试验（定义、目的、方法）如何报告药敏试验结果什么是抗菌药物的敏感性试验？测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长的效力，称抗菌药物对细菌的抑菌试验，或称细菌对药物的敏感性试验。为什么要做药物敏感性试验？ 供临床医师选用抗菌药物时的参考 细菌耐药性监测和耐药性变迁 评价新抗菌药物的药效学特征 对细菌耐药谱分析和分型有助于某些菌种的鉴定 作为医院内感染流行病学调查的手段之一如何进行药物敏感性试验？(一)方法学 稀释法 试管稀释法（肉汤稀释法） 平板稀释法（琼脂稀释法） 扩散法（纸片法） Kirby-baure(K-B)法 Stockes法 E-Test 自动化仪器稀释法原理：以一定浓度的抗菌药物与含有被测 菌株的培养基进行一系列的对倍稀释经培 养后，观察最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration MIC）。实验室中常用的几种MIC测定方法2g/ml1g/ml0.5g/ml肉汤(试管)稀释法肉汤微量稀释法琼脂(平板)稀释法几个重要的指标MIC(最低抑菌浓度minimal inhibitory concentration) 在体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度 MBC(最低杀菌浓度minimal bactericidal concentration) 在体外能够使细菌总数减少(杀灭)99.9%以上的最低药物浓度。 MIC50、MIC90 在一批实验中能抑制50%或90%受试菌所需的MIC。 MBC50 MBC90 在一批实验中能使50%或90%受试菌的活菌数减少99.9%所需的MBC。 临界浓度（breakpoint） 根据抗菌药物抑制细菌生长所需要的MIC，结合常用剂量时该药所血药浓度，划定细菌对各种抗菌药物敏感或耐药的界限。扩散法(纸片法)原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，因此敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，根据抑菌圈的大小即可推知该药物的最低抑菌浓度（MIC）。扩散法：K-B操作： 制备0.5MacFarland Standard（1.5108CFU/ml）菌液 无菌棉签蘸取菌液，在管壁内将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。 室温干燥或35干燥5-15分钟 用纸片分配器或无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面纸片间距20mm 纸片离平板内缘15mm。如何制备菌悬液？菌落？ 至少3个菌落，为什么？可能丢失耐药细菌(携带有耐药质粒的耐药菌株) .如何阅读结果（纸片法） 工具：游标卡尺，尺子 光源：反射光、透射光 阅读： 药敏平皿背衬不 反光的黑色背景，用 肉眼观察。纸片法结果的正确阅读 正确的光源：反射光 不反光的黑色背景 完全抑制的抑菌圈直径，包括纸片的直径 抑菌圈的界限应该是以肉眼观察没有明显的可见细菌生长区域 在抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下才能观察到的细小菌落应忽略。应注意葡萄球菌、肠球菌的药敏结果阅读 苯唑西林、利奈唑胺和万古霉素对葡萄球菌的抑菌圈 万古霉素对肠球菌的抑菌圈 任何有可见的菌落生长均应视作对上述抗菌药物耐药 需在透射光（Transmitted light）下阅读，遇不敏感的结果需用稀释法测定MIC确证 要使用透射光不要用反射光应注意磺胺类药物的结果阅读培养基内可能有磺胺类药物的拮抗物，如 胸腺嘧啶、核苷类物质。允许有轻微生长的薄菌苔忽略20%或更低生长的薄菌苔，测量抑菌圈直径较为明显的细菌生长界限应注意变形杆菌属细菌的药敏结果阅读 变形杆菌属细菌的生长呈迁移性 在某些抗菌药物抑菌环内可见霾样（淡淡生长的云雾状）迁徙生长的变形杆菌属细菌的菌苔 抑菌环内由于变形杆菌属细菌迁徙生长出现的霾样生长可忽略不计 忽略迁移性应注意溶血性细菌的结果阅读 链球菌 B-溶血性链球菌 草绿色链球菌 肺炎链球菌等 应忽略溶血圈，读取生长完全被抑制处应注意产色素细菌的结果阅读 有些细菌会在生长过程中产生色素 铜绿假单胞菌 黄杆菌 沙雷菌 应忽略色素分泌圈，读取生长完全被抑制处抑菌圈内有菌落，怎么办？大肠埃希菌污染有肠球菌菌落再次纯分铜绿假单胞菌有耐药菌落E-试验(E-Test) 原理：基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料纸条中向药敏琼脂中扩散，在试条周围浓度范围内检测菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。 E-test综合了稀释法和扩散法的原理和特点，直接定量测出药物对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）。 药敏平板 同K-B法 E-Test条 宽5mm， 长60mm 抑菌圈 -椭圆形 结果 -MICEtest 试条模板的应用 放试条时，操作要稳妥，试条一旦接触琼脂则勿再移动。 作苛养菌或极敏感菌株药敏时，150mm 平皿上只能放置4到6 个试条，90mm平皿只放1个试条。 将试条放置平板上的方法有用手指，镊子，Etest 加样器或真空笔。 如果试条放到非正常位置，勿移动试条，维持原状判读结果。E-test试验结果阅读忽略溶血，读取生长完全被抑制处：MIC 0.032ug/ml杀菌型药物如氨基糖苷类产生“干脆利落”椭圆球MIC 0.064ug/ml试条两边产生不同的交界点，读取较高数值侧的MIC。如果两侧差1个稀释度，则须重复试验。MIC 0.5ug/ml忽略变形杆菌的迁延现象，MIC 0.064ug/ml什么时候可以使用E-试验? 临床治疗要求了解某种抗菌药物确切的MIC值以及MIC的范围 当某种抗菌药物对某种细菌的纸片法药敏结果不可靠时 要核实常规方法获得的药敏结果正确性 苛养菌 肺炎链球菌 -溶血性链球菌 流感嗜血杆菌 厌氧菌举 例： 肺炎链球菌苯唑西林纸片法直径19mm, 需要明确受试菌对青霉素的敏感性，必须做青霉素的E-试验革兰阳性球菌万古霉素对葡萄球菌药敏必须做万古霉素的E-试验确认对万古霉素的敏感性草绿色链球菌对青霉素、氨苄 西林纸片法药敏结果不可靠， 必须做上述两药的E-试验举例: 囊性纤维化患者中分离的假单胞菌对托布霉素需要雾化处理时： 囊性纤维化患者有时需要雾化托布霉素治疗 托布霉素的浓度: 肺雾化吸入32-64 g/mg 血清静脉给药410 g/ml 自动化仪器常规托布霉素MIC 通常16 g/ml E-试验和稀释法: E-试验可以达到256 g/ml(此外粘液状生长的菌株肉汤培养液内生长较慢)自动化仪器的优点 具有多种用途：菌种鉴定、药敏 快速，灵敏 计算机记录，减少人工记录的错误 结果客观，不带有人为的偏见 软件可以更新 专家系统Commercial AST Systems自动化仪器的缺点 药物是组合的板，药敏试验的药物不能根据需要进行选择， 缺乏灵活性和机动性 快速的结果对某些细菌不能检出耐药性菌株，造成假敏感，不能及时监测和发现耐药菌株的产生 仪器要求占有一定的空间 药敏试验的药物浓度是以“Breakpoint”设置的，不是浓度系列，不能反映抗菌药物对受试菌株真正的MIC值如何报告药敏试验结果采用三级划分制CLSI的三级划分制及临床意义 高度敏感（S）：当一种细菌引起的感染，用该种药物常用剂量治疗有效，这种细菌即对该药物高度敏感，即常规用药时达到的平均血浓度超过对细菌MIC的5倍以上 中介（I）：当细菌引起的感染，仅在应用高剂量抗菌药物时才有效，或者细菌处于体内抗菌药物的浓缩部位，如尿液、胆汁等才被抑制，这种细菌对该药物中度敏感。常规用药时达到的平均血浓度一般相当于或略高于对细菌的MIC。 耐药（R）：药物对某一细菌的MIC高于药物在血或体液中可能达到的浓度，有时细菌能生长灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，均应判定该菌为耐药。注意：有些抗菌药物在体外对细菌有效，但在体内无效 沙门菌属、志贺菌属，第一、第二代头孢菌素、头霉素、氨基糖苷类 李斯特菌头，孢菌素 ESBLs 产生菌，氨曲南、头孢菌素、青霉素 MRSA, MRCNS 所有B-内酰胺类 肠球菌头孢菌素、克林霉素、SMZco、氨基糖苷类(除高浓度)谢谢！结束结束