生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验带教带教: 张学礼、戴薇薇张学礼、戴薇薇 龚张斌、黎志萍龚张斌、黎志萍1实验课要求实验课要求 试剂用后及时归位试剂用后及时归位 及时记录实验结果及时记录实验结果 按时完成实验报告按时完成实验报告 离开时做好清洁工作离开时做好清洁工作2实验报告的书写实验报告的书写标题日期标题日期一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理三、操作步骤三、操作步骤四、实验结果四、实验结果五、分析讨论五、分析讨论3实验基本操作实验基本操作一、玻璃仪器的洗涤一、玻璃仪器的洗涤二、吸量管及微量取样器的使用二、吸量管及微量取样器的使用三、溶液的混匀三、溶液的混匀四、离心机的使用四、离心机的使用4实验一实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白质凝胶过滤层析法分离蛋白质1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理；掌握凝胶过滤层析法的基本原理；2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。一、一、 实验目的实验目的5二、二、 实验原理实验原理1. 常用生化实验技术常用生化实验技术 分光光度技术分光光度技术电泳技术电泳技术离心技术离心技术层析技术层析技术62. 层析技术（色谱技术）层析技术（色谱技术） 是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等）建立起来的技术。和力等）建立起来的技术。7（1）层析系统的基本组成）层析系统的基本组成 固定相固定相 + 流动相流动相固体物质固体物质 / 固定于固体物质的成分固定于固体物质的成分可以流动的物质：如水和各种溶媒可以流动的物质：如水和各种溶媒8待分离混合物（待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相）随流动相通过固定相 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同量对比）不同与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快受到的阻滞作用小，移动速度快分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分组分，从而达到将各组分分离分离的目的的目的9（2 2）层析法的分类）层析法的分类 按两相所处状态分类按两相所处状态分类 流动相流动相液体液体气体气体固定相固定相液体液体液液液层析法液层析法气气液层析法液层析法固体固体液液 固层析法固层析法气气 固层析法固层析法10 按层析原理分类按层析原理分类 名称名称原理原理吸附层析法吸附层析法固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力不同而分离固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力不同而分离分配层析法分配层析法各组分在流动相和固相中的分配系数不同各组分在流动相和固相中的分配系数不同离子交换层析法离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组分与离子交换剂亲和力不同而分离固定相是离子交换剂，各组分与离子交换剂亲和力不同而分离亲和层析法亲和层析法固定相只能与一种待分离组分专一结合，以此和无亲和力的其它组分分离固定相只能与一种待分离组分专一结合，以此和无亲和力的其它组分分离凝胶层析法凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同不同11 按操作形式不同分类按操作形式不同分类 名称名称操作形式操作形式柱层析法柱层析法固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离的层析法，包括一固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离的层析法，包括一般柱层析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法般柱层析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法平面层析法平面层析法层析过程在固定相构成的平面层内进行的层析法，包括纸层析法、薄层层析层析过程在固定相构成的平面层内进行的层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄膜层析法法和薄膜层析法12（3 3）层析技术的优点）层析技术的优点 分离效率高分离效率高 分析速度快分析速度快 具有极高的灵敏度具有极高的灵敏度 应用范围广应用范围广适用：适用： 杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析物样品的分离分析133. 凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography）（1 1）原理：）原理： 根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部，粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部，大分子物质被排阻在外。大分子物质被排阻在外。 又名分子筛过滤，排阻层析又名分子筛过滤，排阻层析1415（2 2）凝胶的特点）凝胶的特点 属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶16（3 3）凝胶的选择）凝胶的选择A.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 (商品名商品名: Sephadex，Dextran) 型号型号: G-10 G-200多孔网孔结构多孔网孔结构数字愈小数字愈小,交联度越大交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小被筛分物质的分子量也愈小吸水能力，每吸水能力，每g干胶吸水量的干胶吸水量的10倍倍17Sephadex G-50： 对多肽及蛋白质的筛分范围对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量分子量)为为: 1500 30000Sephadex G-200： 对多肽及蛋白质的筛分范围对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量分子量)为为: 5000 80000例：例：18B. 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 ( 商品名商品名: Sepharose , Bio- gel A ) 对实验条件要求高对实验条件要求高 ( 温度温度, pH ) 40 4.5- 9.0 工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限, 用于大分子物质的分离用于大分子物质的分离19C. 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 商品名商品名: Bio gel P（生物胶（生物胶P）20三、实验操作三、实验操作1. 柱的选择柱的选择 直径：直径： 15 cm 一般长度：直径一般长度：直径 = 10：1 20：1 本实验玻柱：本实验玻柱： 直径直径0.8 1.5cm 长度长度 17 20cm212. 凝胶选择、制备凝胶选择、制备 血红蛋白血红蛋白 溶菌酶溶菌酶 分离分离 （64500） （11400） 选择选择 Sephadex G-50Sephadex G-50： 对多肽及蛋白质的筛分范围对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量分子量)为为: 1500 3000022制备：制备： 将干胶颗粒悬浮于将干胶颗粒悬浮于5 10倍的蒸馏水或洗脱液中倍的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去233. 凝胶装柱凝胶装柱柱固定于架子上，垂直放置，关住出口柱固定于架子上，垂直放置，关住出口自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉，开始下沉， 至至1 2cm时，打开出口时，打开出口凝胶逐层上升，至顶部凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口时，关闭出口24注意点：注意点： 垂直放置垂直放置 防止气泡产生防止气泡产生 防止柱的分层防止柱的分层254. 平衡平衡放置一段时间，约放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）分钟（使凝胶更好的压实）注意：注意：防止床面干涸，可适当补充蒸馏水防止床面干涸，可适当补充蒸馏水265. 加样加样 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出床面时，立即关闭出口（将干未干）出床面时，立即关闭出口（将干未干） 用滴管将混合样品用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶，即血红蛋白和溶菌酶 各各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面缓缓沿柱内壁小心加于床表面 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, 立即加入立即加入12倍于样品体积的蒸馏水倍于样品体积的蒸馏水276. 洗脱洗脱当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸 馏水，进行洗脱，直到两带分开馏水，进行洗脱，直到两带分开检查检查Hb在层析床中色带位置，待在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后，洗脱完后， 用试管分步收集洗脱液用试管分步收集洗脱液 10d/管，每管加管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）28缩二脲反应缩二脲反应 （双缩脲反应）（双缩脲反应）肽键肽键29四、实验结果四、实验结果绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果下次实验：下次实验： 碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定 时间：时间：4月月18日上午日上午9：00开始开始五、讨论五、讨论30