朊病毒及其检测朊病毒及其检测小组成员：石勇军 费 鹏 闫 凯 王培培 严 姗 辛儒岱关亚飞 崔金红 CONTENTS一、前言一、前言二、二、PrPPrPC C与与PrPPrPSCSC三、三、PrPPrPC C的功能的功能四、朊病毒的致病机理四、朊病毒的致病机理五、五、朊病毒的检测朊病毒的检测六、六、问题与展望问题与展望一、前言一、前言1 1引言引言 传染性海绵状脑病传染性海绵状脑病(transmissible (transmissible spongispongi-form encephalopathy, TSE)-form encephalopathy, TSE)是一类致死性的是一类致死性的神经系统退行性疾病。在哺乳动物中常见疯牛神经系统退行性疾病。在哺乳动物中常见疯牛病、羊瘙痒症、猫海绵状脑病以及传染性水貂病、羊瘙痒症、猫海绵状脑病以及传染性水貂脑软化病等；在人身上那么发现了库鲁病、致脑软化病等；在人身上那么发现了库鲁病、致死性家族失眠症、克死性家族失眠症、克- -雅氏病以及格斯特曼综合雅氏病以及格斯特曼综合症等。患病的人和动物，大脑皮层的神经元细症等。患病的人和动物，大脑皮层的神经元细胞会发生进行性空泡化胞会发生进行性空泡化, , 星形胶质细胞不断增星形胶质细胞不断增生生, , 造成灰质变薄而白质相对明显造成灰质变薄而白质相对明显, ,最后变成海最后变成海绵状态。绵状态。左病羊神经组织的海绵状损伤。左病羊神经组织的海绵状损伤。右病人大脑组织切片，海绵状病变及右病人大脑组织切片，海绵状病变及周围的沉淀斑周围的沉淀斑2 2朊病毒的发现朊病毒的发现200200200200多年前多年前多年前多年前英国的牧人就注意到羊的一种致死性疾病。英国的牧人就注意到羊的一种致死性疾病。 20202020世纪初世纪初世纪初世纪初M. fadyian 提出该病是由寄生虫引起的。提出该病是由寄生虫引起的。1919191936363636年年年年Cuille 等发现瘙痒因子有传染性，用滤膜过等发现瘙痒因子有传染性，用滤膜过滤后仍具有传染性，而提出该因子是一种病滤后仍具有传染性，而提出该因子是一种病毒。毒。1919191966666666年年年年Gajdusek 证实了证实了CJD 的传染性，并根的传染性，并根Scrapie 、Kuru、CJD3种疾病的共同特征种疾病的共同特征提出了传染性海绵状脑病提出了传染性海绵状脑病(TSE) 这一概念。这一概念。1882188218821882美国生物化学家美国生物化学家Prusiner证明并提出羊瘙痒证明并提出羊瘙痒病的病原体是一种不含核酸和脂类的疏水性糖病的病原体是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白蛋白，称为蛋白质侵染因子，称为蛋白质侵染因子(proteinaceous infectious particle，简称简称prion)。3 3朊病毒引起的人类疾病朊病毒引起的人类疾病4 4朊病毒引起的人类疾病朊病毒引起的人类疾病 疾病疾病症状症状脑组织变化脑组织变化羊瘙痒症患病羊倾向蹭掉他们的毛，其他症状诸如：行走困难、行动丧失协调性。牛海绵状脑病(BSE)多数病牛行为反常、烦躁不安、对声音和触摸过敏，两耳对称活动困难，心搏缓慢，呼吸缓慢，体重下降，极度消瘦。病牛脑灰质部分形成海绵状空泡，脑干灰质两侧呈对称病变，神经纤维网有卵形和球形空洞，神经细胞肿胀层气球状。可传染性貂脑病(TME)初期一般表现为食欲不振、日渐消瘦和衰弱，皮毛变粗，且随着疾病的发展，动物将静进性变得兴奋；严重时快速转圈，禁不住咬尾和紧闭下巴；临死前变得嗜睡。尸检可见脱水和消瘦，脑皮质和皮质下广泛的海绵状变性并伴有神经胶质星状细胞增生。慢性消瘦病(CWD)慢性消瘦，体重减轻；大多数表现为逐渐减少与其他动物的接触，倦怠，面无表情且反复以一定的模式行走；饮水和尿量增多。5 5疾病来源疾病来源人类prionprion病约有15%15%的患者具有遗传性，即为家族性疾病，为常染色体显性遗传，因编码PrPPrP的基因突变所致。遗传性遗传性由食用疯牛病病牛及其他染病动物所致。食源性传食源性传播播目前已报道全世界因医源性传染而引起的prionprion病已达160160多例，而且，输血及血制品是否也能传播此病，已引起人们的关注。医源性感医源性感染染6 6致病特点致病特点2 2一旦发病，呈一旦发病，呈慢性、进行性慢性、进行性发展，以死亡发展，以死亡告终；告终；5 5患者以痴呆、患者以痴呆、共济失调、震共济失调、震颤等为主要临颤等为主要临床表现。床表现。4 4无抗原性，无抗原性，不能诱导产不能诱导产生特异性免生特异性免疫应答；疫应答；1 1潜伏期长，潜伏期长，可达数月至可达数月至数年甚至数数年甚至数十年；十年；3 3病理学特征是大脑皮质神经元空泡变病理学特征是大脑皮质神经元空泡变性、死亡、缺失，而星形胶质细胞高性、死亡、缺失，而星形胶质细胞高度增生，故大脑皮质疏松呈海绵状：度增生，故大脑皮质疏松呈海绵状：有淀粉样斑块形成，有淀粉样斑块形成，HEHE染色淡红脑组染色淡红脑组织中无炎症反应：无淋巴细胞和炎症织中无炎症反应：无淋巴细胞和炎症细胞浸润；细胞浸润；二、二、PrPC与与PrPSC结构结构结构结构 转化转化转化转化理化性质理化性质理化性质理化性质PrPPrPPrPPrPC C C C与与与与PrPPrPPrPPrPSCSCSCSC朊病毒蛋白朊病毒蛋白(Prion Protein)(Prion Protein)，简称为，简称为PrPPrP。PrPPrPC C是指一般情况下，正常宿主细胞基因是指一般情况下，正常宿主细胞基因编码产生的朊蛋白，无致病性，是一种糖基编码产生的朊蛋白，无致病性，是一种糖基磷脂酞肌醇磷脂酞肌醇(CPI)(CPI)修饰膜在糖蛋自。广泛表修饰膜在糖蛋自。广泛表达于脊椎动物，它与神经系统功能的维持、达于脊椎动物，它与神经系统功能的维持、淋巴细胞信号转导、核酸代谢等有关。淋巴细胞信号转导、核酸代谢等有关。PrPPrPC C当其发生构象改变后可变成致病性朊病毒当其发生构象改变后可变成致病性朊病毒(PrP(PrPscsc) )，PrPPrPscsc可引起包括疯牛病在内的一系可引起包括疯牛病在内的一系列致死性神经性疾病。相对分子质量为列致死性神经性疾病。相对分子质量为272730KD30KD，故又称作，故又称作PrP27PrP273030。PrPPrPSCSC1 1PrPPrPC C与与PrPPrPSCSCPrPc PrPScPrPc PrPSc螺旋螺旋折叠折叠 二者是异构体二者是异构体, ,由同一染色体基因由同一染色体基因PRNPPRNP编码，编码，其氨基酸序列完全一致其氨基酸序列完全一致, ,根本差异在于它们构象上的差根本差异在于它们构象上的差异，异，PrPCPrPC分子中含分子中含42%42%的的螺旋，螺旋，折叠仅为折叠仅为3 %3 %，而，而PrPSCPrPSC的的折叠高达折叠高达43 %43 %，螺旋为螺旋为30 %30 %。故一般认为，。故一般认为，PrPSCPrPSC是由于是由于PrPCPrPC发生蛋白质错误折叠，一些发生蛋白质错误折叠，一些螺旋变螺旋变构为构为折叠，三维构象发生变化而产生的，同时带来折叠，三维构象发生变化而产生的，同时带来一系列理化性质的变化。一系列理化性质的变化。2 2PrPPrPC C与与PrPPrPSCSC的结构的结构3 3PrPPrPC C与与PrPPrPSCSC的理化性质的理化性质4 4PrPCPrPC向向PrPSCPrPSC的转化的转化PrPScPrPSc的累积的累积PrPPrP转化为转化为PrPSc)PrPSc)(PrP(PrP与与PrPScPrPSc之间反响之间反响) )PrPcPrPc内生内生模型一模型一 ：该模型是假定一个单一的：该模型是假定一个单一的PrPPrPSCSC分子分子与一个单一的与一个单一的PrPPrPC C分子结合并催化其转化成分子结合并催化其转化成PrPPrPSCSC。这两个。这两个PrPPrPSCSC分子分子, ,可以继续转换成可以继续转换成PrPPrPC C。( (伸长伸长) )构象变构象变化化) )( (破碎成多个局部破碎成多个局部) )感染感染模型二：假设模型二：假设PrPPrPSCSC只是纤维，捆绑只是纤维，捆绑PrPPrPC C fibrilfibril，然后将其转化成，然后将其转化成PrPPrPSCSC，形成更长，形成更长的纤维，这一现象可在染病毒致病中观察的纤维，这一现象可在染病毒致病中观察到。到。三、三、PrPC的功能的功能核酸代核酸代谢谢抗氧化抗氧化参与神参与神经系统经系统CuCu2+2+代代谢谢维持神维持神经系统经系统功能功能信号转信号转导导细胞调细胞调亡亡PrPC的功能1 1维持神经系统功能维持神经系统功能 在所有细胞类型中在所有细胞类型中, ,以神经元表达以神经元表达PrPCPrPC水平最高，且水平最高，且PrPCPrPC高度富集于突触处高度富集于突触处( (终终板处也有富集板处也有富集) )，这提示，这提示PrPCPrPC对神经系统有特对神经系统有特殊的重要性。殊的重要性。PrPCPrPC除实验说明，除实验说明，PrPCPrPC缺失虽缺失虽不引起肉眼可见的行为和发育障碍，但在整不引起肉眼可见的行为和发育障碍，但在整体动物水平来看可导致与昼夜节律有关的行体动物水平来看可导致与昼夜节律有关的行为异常。在神经系统水平，为异常。在神经系统水平，PrPCPrPC缺失可导致缺失可导致电生理参数方面的改变。电生理参数方面的改变。有证据说明，在出现进行性运动失调病症PrPC缺失小鼠中，发现脑部严重萎缩，蒲肯野细胞异常，因PrPC缺失可能引起蒲肯野细胞过度兴奋而导致小鼠死亡。PrPC缺陷鼠还表现出对外源性铜和过氧化氢等应激诱导剂应答方面的改变。在细胞水平，PrPC缺陷鼠的神经元在培养时存活能力下降，且对铜和阿拉伯糖胞苷(AraC)等所导致的氧化损伤和毒性的敏感性增加；星形胶质细胞在摄取谷氨酸方面有异常；小胶质细胞对兴奋物质的反响性下降；在突触形成中有结构改变。由此可见，PrPC可能在一定程度上参与神经系统功能的维持。2 2参与神经组织的参与神经组织的CuCu2+2+代谢代谢 PrP PrPC C作为脑组织中膜在铜结合蛋自参与神作为脑组织中膜在铜结合蛋自参与神经组织中经组织中CuCu2+2+的稳态平衡调节，当转变为的稳态平衡调节，当转变为PrPPrPSCSC就就失去结合失去结合CuCu2+2+的能力，造成神经组织中的能力，造成神经组织中CuCu2+2+含量异含量异常，导致神经细胞损伤。常，导致神经细胞损伤。 Cu Cu2+2+对不同神经细胞对不同神经细胞PrPCPrPC的影响也不相同。的影响也不相同。3 3抗氧化抗氧化 PrP PrPC C通过与铜原子形成复合物而发挥通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性。抗氧化活性。PrPPrPC C借其八肽重复区最多可结借其八肽重复区最多可结合合4 4个铜原子。结合后形成的复合物具有抗氧个铜原子。结合后形成的复合物具有抗氧化活性，从而保护细胞免受氧化损伤。化活性，从而保护细胞免受氧化损伤。4 4参与淋巴细胞信号转导参与淋巴细胞信号转导 PrP PrPC C可高水平地在人可高水平地在人T T、B B淋巴细胞、单淋巴细胞、单核细胞及树突状细胞中表达，不同细胞中表达核细胞及树突状细胞中表达，不同细胞中表达PrPPrPC C的糖基组成、糖链形状及蛋自酶解的敏感的糖基组成、糖链形状及蛋自酶解的敏感性都有差异。性都有差异。 T T细胞的活化伴随着其表而细胞的活化伴随着其表而PrPPrPC C的表达的表达上调，且上调，且PrPPrPC C在记忆在记忆T T细胞比初始细胞比初始T T细胞的表达细胞的表达水平高。水平高。5 5细胞凋亡细胞凋亡 在在PrPPrP敲除小鼠神经元中，多种凋亡相敲除小鼠神经元中，多种凋亡相关蛋自显著增加，线粒体关蛋自显著增加，线粒体Ca2+Ca2+含量改变、细胞含量改变、细胞色素色素c c释放，都说明释放，都说明PrPPrP参与细胞凋亡调控过程。参与细胞凋亡调控过程。 体外试验也显示体外试验也显示PrPCPrPC能够保护人的神经能够保护人的神经元免受元免受BaxBax诱导的细胞凋亡，而缺失八肽序列或诱导的细胞凋亡，而缺失八肽序列或C C端带有突变的端带有突变的PrPPrP均不具有该活性。均不具有该活性。6 6核酸代谢核酸代谢 Gabus Gabus等根据小鼠中瘟痒病的感染过程等根据小鼠中瘟痒病的感染过程会因鼠自血病病毒会因鼠自血病病毒MuLVMuLV的复制而加速，以的复制而加速，以及人类及人类PrPPrP功能上类似于功能上类似于NCp7NCp7，可辅助反转录酶，可辅助反转录酶合成前病毒合成前病毒DNADNA等现象，提出等现象，提出PrPPrP可能参与了体可能参与了体内核酸代谢过程。内核酸代谢过程。四、朊病毒的致四、朊病毒的致病机理病机理致病机理致病机理电泳电泳活性活性染色染色法法阮病毒阮病毒学说学说 “yea“yeast st prionprions”s”学学说说 1 1阮病毒学说阮病毒学说 PrPC PrPC是一种膜蛋白，其是一种膜蛋白，其C C端含有端含有2323个氨基个氨基酸组糖基磷酸肌醇酸组糖基磷酸肌醇(GPI)(GPI)锚受体结合位点，因此锚受体结合位点，因此可通过糖基肌醇磷酸脂可通过糖基肌醇磷酸脂(glycoirmitol (glycoirmitol phosphohptds)phosphohptds)联在膜上，定位于细胞膜的穴样联在膜上，定位于细胞膜的穴样内陷类结构域内陷类结构域CLDsCLDs，在神经元，当膜浆膜上，在神经元，当膜浆膜上的的PrPCPrPC变成为变成为PrPSCPrPSC后，后，PrPSCPrPSC脱落并聚集在神经脱落并聚集在神经元的溶酶体。当到达数量，就可使神经元细胞破元的溶酶体。当到达数量，就可使神经元细胞破裂，形成神经组织的空泡化，并使星型胶质细胞裂，形成神经组织的空泡化，并使星型胶质细胞增生，增生，2 2“yeast prions“yeast prions学说学说 3 3蛋白的氧化反响学说蛋白的氧化反响学说 杨池明提出了疯牛病蛋白长寿命自由基杨池明提出了疯牛病蛋白长寿命自由基即为疯牛病中的亚病毒的理论设想，他认为真即为疯牛病中的亚病毒的理论设想，他认为真正的疯牛病蛋白亚病毒可能是由蛋白的氧化反正的疯牛病蛋白亚病毒可能是由蛋白的氧化反响所形成的疯牛病蛋白自由基。响所形成的疯牛病蛋白自由基。 应用此理论能够解释疯牛病的一些病理应用此理论能够解释疯牛病的一些病理现象。现象。五、朊病毒的检五、朊病毒的检测测接种接种传递传递组织组织印记法印记法酶联酶联免疫免疫吸附法吸附法毛细毛细管凝管凝胶电泳胶电泳朊病毒的检测朊病毒的检测朊病毒的检测朊病毒的检测取组织标本取组织标本 1010倍连续稀倍连续稀释释研研 磨磨1010个稀释浓度个稀释浓度分别接种小分别接种小鼠鼠直到死亡直到死亡或盲传几代或盲传几代 出现症状出现症状杀死，杀死，取脑组织检查取脑组织检查 死亡死亡不出现症不出现症状状 观观察察饲养饲养24h24h未死未死亡亡正常饲养正常饲养 补接补接1 1动物的接种传递实验动物的接种传递实验取标本取标本甲酚脱毒甲酚脱毒甲醛固定甲醛固定石蜡包埋石蜡包埋 5555干燥干燥二甲苯脱蜡二甲苯脱蜡 异丙醇水化异丙醇水化 空气干燥空气干燥蛋白酶蛋白酶K K消化消化 盐酸胍处理盐酸胍处理 1. 1. 前处理前处理2. 2. 检测检测NCNC：硝酸纤：硝酸纤维素膜维素膜 前处理品前处理品免疫学检测免疫学检测取出取出NCNC膜膜5-7m5-7m薄片薄片收集在收集在NCNC上上2mm2mm厚切片厚切片切片切片5555水浴水浴2 2组织印记法组织印记法匀浆匀浆离心离心处理处理显色显色最后酶标仪读板最后酶标仪读板最后酶标仪读板最后酶标仪读板将脑组织置于将脑组织置于将脑组织置于将脑组织置于8%8%8%8%的的的的Zwittergent 3-12Zwittergent 3-12Zwittergent 3-12Zwittergent 3-12和和和和0.5%0.5%0.5%0.5%十二烷基肌十二烷基肌十二烷基肌十二烷基肌氨酸钠中氨酸钠中氨酸钠中氨酸钠中 参加特异性一抗参加特异性一抗参加特异性一抗参加特异性一抗参加酶标二抗参加酶标二抗参加酶标二抗参加酶标二抗最后参加底物最后参加底物最后参加底物最后参加底物用胶原酶、用胶原酶、用胶原酶、用胶原酶、DNase IDNase IDNase IDNase I脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶I I I I，蛋白酶，蛋白酶，蛋白酶，蛋白酶K K K K处理处理处理处理 收集富含收集富含收集富含收集富含PrPscPrPscPrPscPrPsc沉淀，沉淀，沉淀，沉淀，将所得沉淀溶于将所得沉淀溶于将所得沉淀溶于将所得沉淀溶于3-3-3-3-4mol/L4mol/L4mol/L4mol/L硫氰酸胍，硫氰酸胍，硫氰酸胍，硫氰酸胍，包被酶标版包被酶标版包被酶标版包被酶标版 3 3酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法人工合成的人工合成的人工合成的人工合成的PrPscPrPscPrPscPrPsc特异性肽链标记荧特异性肽链标记荧特异性肽链标记荧特异性肽链标记荧光光光光 一定量的特异性抗一定量的特异性抗一定量的特异性抗一定量的特异性抗体、羊脑提取物体、羊脑提取物体、羊脑提取物体、羊脑提取物 标记的肽链与抗体标记的肽链与抗体标记的肽链与抗体标记的肽链与抗体结合后，迁移率发结合后，迁移率发结合后，迁移率发结合后，迁移率发生改变生改变生改变生改变 未与抗体结合的肽未与抗体结合的肽未与抗体结合的肽未与抗体结合的肽链，迁移率不变链，迁移率不变链，迁移率不变链，迁移率不变当脑提取物中存在当脑提取物中存在当脑提取物中存在当脑提取物中存在微量的微量的微量的微量的PrPscPrPscPrPscPrPsc时时时时 当脑提取物中不存当脑提取物中不存当脑提取物中不存当脑提取物中不存在微量的在微量的在微量的在微量的PrPscPrPscPrPscPrPsc时时时时 电泳电泳PrPscPrPscPrPscPrPsc与标记肽链与标记肽链与标记肽链与标记肽链竞争结合抗体竞争结合抗体竞争结合抗体竞争结合抗体 无竞争存在无竞争存在无竞争存在无竞争存在 结合型肽链与游结合型肽链与游结合型肽链与游结合型肽链与游离型肽链的比例离型肽链的比例离型肽链的比例离型肽链的比例发生变化发生变化发生变化发生变化 比例固定不变比例固定不变比例固定不变比例固定不变游离的与游离的与游离的与游离的与结合的肽结合的肽结合的肽结合的肽链分离链分离链分离链分离（比例固（比例固（比例固（比例固定）定）定）定）4 4毛细管凝胶电泳免疫测定法毛细管凝胶电泳免疫测定法六、展望六、展望高级结高级结构构致病致病原因原因感染感染性性 如何对非结晶型的朊病如何对非结晶型的朊病毒蛋白进行分子结构的毒蛋白进行分子结构的准确分析，能否寻找一准确分析，能否寻找一种方法，可以获得朊病种方法，可以获得朊病毒蛋白的准确的高级结毒蛋白的准确的高级结构。构。 朊病毒的致病原因是朊病毒的致病原因是PrPscPrPsc的过度增殖还的过度增殖还是由于是由于PrPcPrPc正常功能正常功能的缺失。的缺失。体外试验产生体外试验产生PrPSCPrPSC到底有无感染性，到底有无感染性，PrPSCPrPSC的增殖是否需的增殖是否需要其他辅助因子如要其他辅助因子如RNARNA的参与。的参与。 科学家已经做了大量的关于朊病毒的研究工作，科学家已经做了大量的关于朊病毒的研究工作，在许多方面取得了重要的进展，诸如在许多方面取得了重要的进展，诸如PrPPrPC C与与PrPPrPSCSC的结的结构、构、PrPPrPC C到到PrPPrPSCSC的转化、的转化、PrPPrPSCSC的增殖过程。但尚有许的增殖过程。但尚有许多难题有待我们去解决：多难题有待我们去解决：1 1