第二章第二章 发酵工业菌种发酵工业菌种与种子的扩大培养与种子的扩大培养 第一节第一节 发酵工业菌种概述发酵工业菌种概述 菌种在发酵工业中起着重要作用，它是决定发酵产品是否具有产产业化价值和商业化价值业化价值和商业化价值的关键因素、是发酵工业的灵魂。l 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物l 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强l 遗传性能要相对稳定l 不易感染它种微生物或噬菌体l 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）l 生产特性要符合工艺要求一、发酵工业用菌种的特点及要求放线菌（链霉素四环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌一些产芽孢的细菌植物或动物来源植物或动物来源1. 抗生素生产有关的微生物抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：二、已工业化产品生产菌的介绍2. 氨基酸生产有关的微生物氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：二、已工业化产品生产菌的介绍HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制氨酸和异亮氨酸的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶二、已工业化产品生产菌的介绍2. 氨基酸生产有关的微生物氨基酸生产有关的微生物氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌二、已工业化产品生产菌的介绍2. 氨基酸生产有关的微生物氨基酸生产有关的微生物3. 食品酶制剂生产有关的微生物食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌菌和地衣牙孢杆菌二、已工业化产品生产菌的介绍4. 4. 常用的基因表达系统常用的基因表达系统（1）原核生物 大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌q 生长迅速、蛋白产量高;q 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；q 外源基因的导入相对容易；q 已建立了整套表达理论及技术.二、已工业化产品生产菌的介绍（2）真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)l 生长迅速，营养要求不高，易培养；l 安全性好；l 比哺乳动物细胞操作简单；l 具有一定的修饰蛋白的能力。二、已工业化产品生产菌的介绍4. 4. 常用的基因表达系统常用的基因表达系统 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统q 具有准确的转录后修饰功能；q 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；q 具有重组基因的高效扩增和表达能力；q 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；qCHO很少分泌自身的内源蛋白。二、已工业化产品生产菌的介绍4. 4. 常用的基因表达系统常用的基因表达系统（2）真核细胞表达系统微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。物才具有大量表达的潜力。问题：问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：二、已工业化产品生产菌的介绍工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。工业菌种的分离：菌株分离是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选。进而得到所需微生物的过程。第二节第二节 发酵工业菌种的选育发酵工业菌种的选育一、菌种的来源一、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 定定方方案案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：采样：有针对性地采集样品。增增殖殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：分离：利用分离技术得到纯种。发发酵酵性性能能测测定定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。二、新种分离与筛选的步骤二、新种分离与筛选的步骤1. 采样采样（1）采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。二、新种分离与筛选的步骤二、新种分离与筛选的步骤1. 采样采样（2）采样季节 以温度适中，雨量不多的秋初为好。（3）采土方式 在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。1.采样采样二、新种分离与筛选的步骤二、新种分离与筛选的步骤2. 增殖培养增殖培养为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。二、新种分离与筛选的步骤二、新种分离与筛选的步骤3. 培养分离培养分离尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。二、新种分离与筛选的步骤二、新种分离与筛选的步骤4. 4. 筛选筛选这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。二、新种分离与筛选的步骤二、新种分离与筛选的步骤5. 毒性试验毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。二、新种分离与筛选的步骤二、新种分离与筛选的步骤6.培养分离中要解决的问题（1）“分离什么和从哪里分离出分离什么和从哪里分离出?” （2）必必须须充充分分考考虑虑所所分分离离微微生生物物的的生生产产能能力力、生生长长速速度度、生生物物群群体体培培养养和和产产品品生生产产工工艺艺及及其其提提纯纯的的难难易易和和费费用用，工工业业生生产产发发酵酵罐罐中中稳稳定定性性及遗传操作的难易程度等。及遗传操作的难易程度等。（3）选择适宜的培养分离方法和检测方法。）选择适宜的培养分离方法和检测方法。二、新种分离与筛选的步骤二、新种分离与筛选的步骤三、诱变育种三、诱变育种以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。1.诱变剂和诱变处理物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。三、诱变育种三、诱变育种化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：（A）大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。 三、诱变育种三、诱变育种1.诱变剂和诱变处理（B）化学诱变剂很经济，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射行工作时，设备费用大，并要注意安全性。（C）大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。三、诱变育种三、诱变育种1.诱变剂和诱变处理使用化学诱变剂的优缺点：（2）诱变剂的选择（A）碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，因为回复突变率高，效果不大。（B）亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。（C）吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。（D）紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。三、诱变育种三、诱变育种1.诱变剂和诱变处理2.诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选三、诱变育种三、诱变育种3. 3. 紫外线的诱变育种紫外线的诱变育种 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。三、诱变育种三、诱变育种被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。三、诱变育种三、诱变育种3. 3. 紫外线的诱变育种紫外线的诱变育种4. 4. 亚硝基胍诱变曲霉菌亚硝基胍诱变曲霉菌N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。三、诱变育种三、诱变育种四、基因工程育种四、基因工程育种基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。1.一个完整的基因克隆过程步骤获得待克隆的DNA片段（基因）；目的基因与载体在体外连接；重组DNA分子导入宿主细胞；筛选、鉴定阳性重组子；重组子的扩增与或表达。四、基因工程育种四、基因工程育种2.基因重组四、基因工程育种四、基因工程育种1. 细菌杂交细菌杂交在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-，F因子插入胞核质的一定位置上称Hfr细胞。F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。五、杂交育种五、杂交育种2. 酵母杂交育种技术酵母杂交育种技术（1）酵母繁殖方式 酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。单倍体细胞具及两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。五、杂交育种五、杂交育种（2）酵母杂交 一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。五、杂交育种五、杂交育种2.酵母杂交育种技术酵母杂交育种技术六、原生质体融合育种六、原生质体融合育种原生质体融合育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。1. 原生质体融合育种的特点原生质体融合育种的特点（1）杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。（2）受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。（3）遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程六、原生质体融合育种六、原生质体融合育种（4）存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。（5）有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。（6）提高菌株产量的潜力较大。（7）有助于建立工业微生物转化体系。六、原生质体融合育种六、原生质体融合育种1.原生质体融合育种的特点原生质体融合育种的特点2. 2. 原生质体融合育种步骤原生质体融合育种步骤（1）标记菌株的筛选和稳定性验证。（2）原生质体制备。（3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。（4）涂布于再生培养基，再生出菌落。（5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。（6）生产性能筛选。六、原生质体融合育种六、原生质体融合育种3. 原生质体融合育种的要点原生质体融合育种的要点（1）标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。六、原生质体融合育种六、原生质体融合育种（2 2）原生质体的制备）原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。六、原生质体融合育种六、原生质体融合育种3. 原生质体融合育种的要点原生质体融合育种的要点4. 影响原生质体制备的因素影响原生质体制备的因素（1）菌体的前处理：为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。（2）菌体的培养时间：为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。（3）酶浓度：对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。六、原生质体融合育种六、原生质体融合育种（4）酶处理温度 （5）破壁时的pH值（6）渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。六、原生质体融合育种六、原生质体融合育种4.影响原生质体制备的因素影响原生质体制备的因素1. 1. 开发新的代谢产物的途径开发新的代谢产物的途径 从自然界分离新的微生物菌株，或采用新的检阅方法筛选新的代谢产物。 对已知微生物的代谢产物进行化学修饰。 利用微生物转化改造代谢产物的结构。 通过原生质体融合获得新的代谢产物。 DNA重组技术。 七、筛选新的代谢产物七、筛选新的代谢产物 2. 筛选微生物新的代谢产物程序筛选微生物新的代谢产物程序3. 3. 筛选微生物代谢产物的方法筛选微生物代谢产物的方法 (1)直接方法为了尽快确定微生物代谢产物的利用前途，在体外试验测得活性后，可以将培养液的有效成分直接作用于机体，观察被测样品的疗效。这种直接确定代谢产物用途的方法亦称动物体内治疗试验。 七、筛选新的代谢产物七、筛选新的代谢产物 （2）间接方法 筛选医用抗生素，可用细茵、真菌、病毒或肿瘤模型，寻找抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤抗生素、酶抑制剂、免疫制剂等有效物质。在预筛选时，多用琼脂平扳扩散抑菌法。通过预筛选，直接测定最初分离物的生物活性，能加速筛选过程。 七、筛选新的代谢产物七、筛选新的代谢产物 3. 筛选微生物代谢产物的方法筛选微生物代谢产物的方法 许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。 具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法。 七、筛选新的代谢产物七、筛选新的代谢产物 4. 组成酶变异株的筛选（1）恒化器法：常被用于微生物的“驯化”。在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，菌生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快。为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例，可以应用恒化器培养技术。随着恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一步的纯化分离。 七、筛选新的代谢产物七、筛选新的代谢产物 4. 组成酶变异株的筛选（2）循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成。七、筛选新的代谢产物七、筛选新的代谢产物 4. 组成酶变异株的筛选（3）诱导抑制剂法：有些化合物能阻止某些诱导酶的合成，当在诱导物和诱导抑制剂同时存在的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型变异株能够利用底物进行生长繁殖。 七、筛选新的代谢产物七、筛选新的代谢产物 4. 组成酶变异株的筛选（3）诱导抑制剂法：七、筛选新的代谢产物七、筛选新的代谢产物 4. 组成酶变异株的筛选 将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步，组成酶变异株所占的比例将逐渐增大。第三节第三节 工业微生物菌种保藏与复壮工业微生物菌种保藏与复壮 在生产发酵中，具有高产有重要经济价值代谢产物的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。一、理想的菌种保藏方法应具备的条件一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3) 菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。二、工业微生物菌种保藏技术二、工业微生物菌种保藏技术(1) 冷冻干燥或真空干燥保藏；(2) 超低温或在液氮中冷冻保藏； (3)转接培养或斜面传代保藏；(4) 土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。三、冷冻保藏三、冷冻保藏 冷冻保藏为保藏微生物菌种最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。. .普通冷冻保藏技术普通冷冻保藏技术(-20)(-20)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管，然后贮藏于冰箱的冷藏室中，或于-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力12年。三、冷冻保藏三、冷冻保藏 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。三、冷冻保藏三、冷冻保藏 .普通冷冻保藏技术普通冷冻保藏技术(-20). .超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术(-60 (-60 -80)-80)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜；4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。 三、冷冻保藏三、冷冻保藏 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。三、冷冻保藏三、冷冻保藏 . 超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术(-60 -80)3. 3. 液氮冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术 (1)冷冻保护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所使用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。三、冷冻保藏三、冷冻保藏 (2)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 A待冷冻保藏菌种悬液的制备 B控速冷冻 三、冷冻保藏三、冷冻保藏 3. 液氮冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术(3)复苏 A从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；B迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇动以加速解；C用巴氏吸管将安瓿中培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约48滴)转接入琼脂斜面上。三、冷冻保藏三、冷冻保藏 四、冻干保藏四、冻干保藏 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。1.1.培养物的冻干过程培养物的冻干过程四、冻干保藏四、冻干保藏 2. 2. 冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生（1）保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5下保藏。较低的保藏温度(-20-70)对于培养物的长期稳定更好。（2）复苏：A.在超净工作台中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿四、冻干保藏四、冻干保藏 C.在安瓿中加入0.51ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。D.在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。四、冻干保藏四、冻干保藏 2. 冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生（2）复苏：1. 1. 传代保藏传代保藏将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。可用于实验室中若干菌种的保藏。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。五、其他保藏方法五、其他保藏方法要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。五、其他保藏方法五、其他保藏方法1. 传代保藏传代保藏2. 2. 矿物油中浸没保藏矿物油中浸没保藏将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。五、其他保藏方法五、其他保藏方法浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株23年也应做一次存活试验。五、其他保藏方法五、其他保藏方法2. 矿物油中浸没保藏矿物油中浸没保藏六、基因工程菌的保藏六、基因工程菌的保藏由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。七、七、菌种的复壮菌种的复壮1.通过寄主体进行复壮 对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒等，由于长期使用，其毒力会下降，导致杀虫效率降低、衰退现象。这时可以用菌种去感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复和提高毒力。2.淘汰已衰退的个体 通过物理、化学的方法处理菌体(或孢子)，使大部分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，可从中选出优良菌种来。八、国内外常见菌种保藏机构（1）中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）（2）中国科学院典型培养物保藏委员会（CTCCCAS）（3）中国典型培养物保藏中心（CCTCC）（4）中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）（5）美国典型培养物保藏中心（ATCC）（6）英国国家典型培养物保藏中心（UKNCC）（7）法国巴斯德研究所菌种保藏中心（CIP）（8）德国科赫研究所菌种保藏中心（RKI）第四节第四节 种子的扩大培养种子的扩大培养种子扩大培养的概念: 种种子子扩扩大大培培养养是是指指将将保保存存在在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接接入入试试管管斜斜面面活活化化后后，再再经经过过扁扁瓶瓶或或摇摇瓶瓶及及种种子子罐罐逐逐级级扩扩大大培培养养，最最终终获获得得一一定定数数量量和和质质量量的的纯纯种种过过程程。这这些些纯纯种种培养物称为种子。培养物称为种子。一、种子扩培的目的q 接种量的需要q 菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平二、种子的要求q 总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长q 无杂菌污染一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备三、种子制备过程三、种子制备过程斜面菌种 一级种子培养 二级种子培养发酵1、斜面 (AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5%， 琼脂2%，pH7.0-7.2培养条件：32，生长18-24小时培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续 传代不超过3次2.一级种子（摇瓶）培养条件：于1000 ml三角瓶中，装液200-250 ml，32 培养12小时。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，K2HPO4 0.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基三、种子制备过程三、种子制备过程3. 二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养，32 培养7-10个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基三、种子制备过程三、种子制备过程4. 种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列pH 7.0-7.2时结束，6.887.0-7.2活力旺盛三、种子制备过程三、种子制备过程四、种子制备的技术概要（一）种子制备的过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。四、种子制备的技术概要（一）种子制备的过程生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。（二）实验室阶段1、培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：q 对于不产孢子和芽孢的微生物，对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。氨酸的种子培养。四、种子制备的技术概要 获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。q 对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。四、种子制备的技术概要2、培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。（二）实验室阶段四、种子制备的技术概要3、起始接种物的传代问题q 细菌细菌保藏斜面 活化斜面q 产孢子保藏 母斜面 子斜面目的：使菌种的传代次数尽可能的少。四、种子制备的技术概要（二）实验室阶段（三）生产车间阶段（三）生产车间阶段1 1、培养物的选择原则、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。q 缩短发酵时间缩短发酵时间q 有利于获得好的发酵结果有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：四、种子制备的技术概要2、培养基选择的原则、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因：一是成本，二是驯化。四、种子制备的技术概要（三）生产车间阶段（三）生产车间阶段3、发酵级数的确定谷氨酸：三级发酵谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）二级种子二级种子 （小罐）（小罐）发酵发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子 （小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数四、种子制备的技术概要（三）生产车间阶段（三）生产车间阶段发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据q 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一一 般般2-4级。级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面重要的一个方面四、种子制备的技术概要（三）生产车间阶段（三）生产车间阶段4、接种量的确定、接种量的确定 移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为生素为7-15%。但是一般认为大一点好。但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。分来源于发酵罐。 四、种子制备的技术概要（三）生产车间阶段（三）生产车间阶段5、种龄、种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。相对较大，但是最终由实验结果定。四、种子制备的技术概要（三）生产车间阶段（三）生产车间阶段6、种子的质量要求：、种子的质量要求：量：要求达到一定的浓度量：要求达到一定的浓度质质: 形态形态 （生长处于某个阶段、均匀等等）（生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：理化指标：C、N、P的含量，的含量，pH、酶活等、酶活等 无污染无污染四、种子制备的技术概要（三）生产车间阶段（三）生产车间阶段带图象分析系统的微生物菌种带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置显微观察装置