实验九碱变性法小量制备质粒DNA Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life, there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一实验目的及背景一实验目的及背景w质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。w大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。w其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。质粒特点w质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。w质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子.w年由Lederburg正式命名为质粒。质粒类型w质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒w1.松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。2.严紧型质粒w严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。质粒的应用w大多数基因工程使用松弛型质粒。w严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。w质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。本实验目的实验目的w本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。分离质粒DNA方法w从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的w碱变性法；w煮沸法；wSDS法；w 羟基磷灰石层析法等w各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。碱变性法基本原理w在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。w将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。实验试剂实验试剂w培养基：胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5g 定容 1000ml pH 7.5NaCl 10gw： 0.1M NaCl10mM Tris HCl(pH8.0)1mM EDTAw 50mg/mlw溶菌酶 10mg/ml (用10mM TrisHCl pH8.0新鲜配制）试剂w溶液： 50mM 葡萄糖25mM TrisHCl（pH8.0）10mM EDTAw溶液：（新鲜配制）0.2N NaOH1% SDSw溶液： 5M KAC 10ml冰醋酸 11.5ml水 28.5mlw酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖w： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTApUC18链长链长2,686 bp pUC18是适合于双脱氧法DNA测序的载体，在lacZ领域中含有多克隆位点，因此在含有IPTG， X-Gal的平板培养基上，很容易判断有无外源基因的插入。此外，也可以利用lac promoter表达外源基因。进行DNA测序时，可以很方便地使用M13系列Primers。w多克隆位点：EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I 和Hind III 只有一个酶切位点。 w用途用途w克隆外源基因。 w利用lac promoter进行基因表达。 w使用M13 primers进行DNA测序。 wpUC18/pUC19 cloning site图图 w 三实验方法三实验方法w挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50g/ml）， 强烈摇荡过度。w取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。w将细菌沉淀悬浮于100l预冷溶液中，振荡混匀，冰上放置5分钟。w加入200l溶液，盖严管盖轻柔颠倒次以混匀内容物，冰上放置5分钟。w加入150l溶液，温和振荡数次，冰上放置分钟。w12000g 4 离心分钟，取上清移到个新的Eppendorf管中。 w(加入等体积酚/氯仿（：），振荡混匀，12000g 4 离心分钟。取上清移至另个Eppendorf管中。)w加入倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。w g ,4 离心分钟。w弃上清，加入ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，000g 于4 离心分钟。w弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。w加入50l TE（含20g/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。 13取10l DNA溶解液用稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD2 80之比；14. 同时以以下公式计算得率。质粒DNA得率：稀释倍数OD2600.0550/1.5ml15取10l DNA溶解液加2l Loading buffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。16电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。四结果分析四结果分析w质粒DNA OD260,OD280的值，由此计算质粒DNA得率和纯度。w记录电泳结果并说明结果内容。问题与讨论：w简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。w简要叙述酚氯仿抽提体系后出现的现象及其成因。w3. 沉淀时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？