2.2 动物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养技术、动物细胞培养技术、 动物细胞核移植技术、动物细胞核移植技术、动物细胞融合技术、动物细胞融合技术、 生产单克隆抗体技术生产单克隆抗体技术提问：提问：v植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养技术、植物组织培养技术、 植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术动物细胞培养技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。是其他动物细胞工程技术的基础。2.2.1 动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养和核移植技术一、动物细胞培养一、动物细胞培养v概念概念:就是从动物机体中取出相关的就是从动物机体中取出相关的组织组织,将它分散成将它分散成单个细胞单个细胞，然后，然后,放在适宜的放在适宜的培养基培养基中中,让这些细胞让这些细胞生长和增殖生长和增殖。植物组织培养植物组织培养 在在无菌无菌和和人工控制人工控制的条件下的条件下, ,将将离体的植离体的植物器官、组织、细胞物器官、组织、细胞，培养在人工控制的培，培养在人工控制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽愈伤组织、丛芽，最终形成，最终形成完整的植株完整的植株。一、动物细胞培养一、动物细胞培养选材：选材： 动物胚胎或幼龄动物的组织、动物胚胎或幼龄动物的组织、器官器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。分化程度低，容易培养。v在进行动物细胞培养时，用在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶或胶原蛋白酶分散细胞，说明细胞间的分散细胞，说明细胞间的物质主要是物质主要是蛋白质蛋白质。动物细胞培养适宜。动物细胞培养适宜的的pH为为7.27.4，此环境下胃蛋白酶，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。的活性较高。分散成单个细胞分散成单个细胞v细胞贴壁：细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。称为细胞贴壁。 要求：要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。易于贴附。 细胞的接触抑制：细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。的接触抑制。 动物细胞生长特性：动物细胞生长特性：一、动物细胞培养一、动物细胞培养3 3、有关概念、有关概念: :v原代培养原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。原代细胞。培养的第培养的第1 1代细胞与繁殖代细胞与繁殖1010代以代以内的细胞内的细胞称为原代细胞培养。称为原代细胞培养。v传代培养传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养培养瓶中继续培养，称为传代培养。，称为传代培养。动物机体组织动物机体组织单个细胞单个细胞原代培养原代培养胰胰蛋蛋白白酶酶胶胶原原蛋蛋白白酶酶稀稀释释分分装装传代培养传代培养培养过程：培养过程：原代培养原代培养传代培养传代培养培养过程：培养过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加培养液加培养液遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质已改变已改变动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）动物细胞培养不能动物细胞培养不能最终培养成生物体最终培养成生物体传代培养一般传至传代培养一般传至10代直至代直至50代就不能再分裂了，这时细代就不能再分裂了，这时细胞核内遗传物质未发生变化，胞核内遗传物质未发生变化，形成的细胞群形成的细胞群传代培养过程中有个别细胞传代培养过程中有个别细胞传至传至50代以后，由于代以后，由于遗传物遗传物质质改变，失去改变，失去控制控制，成为，成为无无限限增殖增殖的不死的的不死的癌症癌症细胞，细胞，形成的细胞群形成的细胞群1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？的吗？、动物细胞培养过程将组织分散成单个细、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？胞的吗？、为何动物细胞培养过程将组织分散成单、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？个细胞的呢？、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？没有没有是是 成块的组织细胞靠在一起成块的组织细胞靠在一起,彼此彼此限制了细胞的生长和增殖限制了细胞的生长和增殖先用剪刀剪碎先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理。后用蛋白酶处理。思考题思考题、细胞膜的主要成份是什么？、细胞膜的主要成份是什么？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？蛋白质和磷脂蛋白质和磷脂能能注意时间的控制注意时间的控制思考题思考题、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？细胞间的物质是什么成份？胰蛋白酶水解蛋白质胰蛋白酶水解蛋白质细胞间的成份是蛋白质细胞间的成份是蛋白质、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？为什么？、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？不能，因为两者的最适不能，因为两者的最适pH不同，而正常不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适pH较接近较接近胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛增殖旺盛思考题思考题11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？无毒？12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？再分裂、增殖？13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？应该怎样办？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。叫接触抑制。将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。后继续增殖。这样的过程叫做传代培养这样的过程叫做传代培养思考题思考题14、如何理解原代培养和传代培养？、如何理解原代培养和传代培养？15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？、传代培养的细胞能一直传代下去吗？16、有些为何能一直传下去？、有些为何能一直传下去？17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养养就是传代培养不都能不都能发生突变，朝着癌细胞方向发展发生突变，朝着癌细胞方向发展不全是不全是思考题思考题18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？保存保存10代以内的细胞，因为代以内的细胞，因为1050部分细胞部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展。变向癌细胞方向发展。细胞培养耗费大量物力、细胞培养耗费大量物力、人力、财力，因此及时冻存细胞很有必要，通人力、财力，因此及时冻存细胞很有必要，通常情况下，常情况下，10代以内的细胞可以冷冻保存，代以内的细胞可以冷冻保存，-70可以保存一年，或者保存于可以保存一年，或者保存于液氮液氮中。复苏中。复苏细胞应采用细胞应采用37度水浴快速复苏度水浴快速复苏的方法。的方法。思考题思考题19、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体不能发育成新的动物个体 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考并讨论中，根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下问题：以下问题：讨论讨论1.体外培养细胞时需要提供哪些物质体外培养细胞时需要提供哪些物质2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？充足的营养供给、适宜的温度、适宜的充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境和气体环境 无菌、无毒的环境。无菌、无毒的环境。 1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养（、营养（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、血清、血浆等。量元素、维生素、血清、血浆等。合成培养基合成培养基）保证细胞顺利的保证细胞顺利的生长增殖生长增殖培养条件：培养条件：DMEMDMEM培养基和培养基和RPMI 1640RPMI 1640培养基培养基 常用的动物血清主要有胎牛血清和新生牛血清，血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有12种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)、类胰岛素生长因子(IGFl、IGF2)等。为什么加血清？为什么加血清？动物细胞培养液的主要成分：动物细胞培养液的主要成分：葡萄糖葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、微量元素、维生素、血清、血浆血清、血浆等。等。与植物培养基相比与植物培养基相比其特点是：其特点是：（1 1）液体培养基）液体培养基（2 2）含有血清、血浆）含有血清、血浆动物体细胞大都生动物体细胞大都生活在活在液体液体的环境的环境培养条件：培养条件：3、温度和、温度和pH 36.5+（-）0.5度度, 7.2-7.44、气体环境：、气体环境： O2和和CO2（95%空气和空气和5% CO2 ）培养条件：培养条件：1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养（、营养（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、血清、血浆等。量元素、维生素、血清、血浆等。合成培养基合成培养基）细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果获得细胞获得细胞或或细胞产物细胞产物快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、血清、葡萄糖、血清、血浆血浆蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较植物细胞和动物细胞培养的比较v大规模培养生产大规模培养生产生物制品生物制品（病毒疫苗、（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）干扰素、单克隆抗体）v作为基因工程中的作为基因工程中的受体细胞受体细胞v培养的动物细胞可以用于培养的动物细胞可以用于检测有毒物检测有毒物质质，判断某种物质的毒性，判断某种物质的毒性v为为治疗和预防癌症治疗和预防癌症及其他疾病提供理及其他疾病提供理论依据论依据应用：应用： 概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。发育成动物个体。 用核移植的方法得到的动物用核移植的方法得到的动物称为克隆动物称为克隆动物核移植核移植（难度高）（难度高）受体细胞：受体细胞：M期的期的卵母细胞卵母细胞二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植：体细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，细胞分化程度低，恢复全能性容易恢复全能性容易卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程融合后的卵细胞融合后的卵细胞克克隆隆羊羊培培育育过过程程黑面绵羊去黑面绵羊去核卵细胞核卵细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期胚胎早期胚胎胚胎移植胚胎移植另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利、动物的克隆与植物克隆一样吗？、动物的克隆与植物克隆一样吗？、用动物体细胞进行克隆的过程、用动物体细胞进行克隆的过程,其实其实际操作过程是什么？际操作过程是什么？动物克隆过程的实际是动物克隆过程的实际是细胞核移植细胞核移植不不思考题思考题卵母卵母细胞细胞去核去核体细体细胞取胞取核核电电刺刺激激使使两两细细胞胞融融合合重组细胞重组细胞重组胚胎重组胚胎新个体新个体、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。价值的动物提供的细胞。、用于核移植的供体细胞一般都选用传代、用于核移植的供体细胞一般都选用传代1010代以内的细胞，为什么？代以内的细胞，为什么？1010代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变未发生突变思考题思考题3 3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分不是，克隆动物绝大部分DNADNA来自供体细胞核，来自供体细胞核，但核外还有少部分但核外还有少部分DNADNA（如线粒体（如线粒体DNADNA）来自）来自受体卵母细胞受体卵母细胞思考题思考题4.4.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？在在19971997年年2 2月英国罗斯林研究所维尔穆特博月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊士科研组公布体细胞克隆羊“多莉多莉”培育成功培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，展。实际上，“多莉多莉”的克隆在核移植技术上的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低能减低“多莉多莉”的重大意义，因为它是世界上的重大意义，因为它是世界上第一例第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物动物细胞核细胞核也具有全能性也具有全能性 思考题思考题5、对比对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？出操作过程的不同点？多莉克隆过程的受体细胞是多莉克隆过程的受体细胞是去核去核卵卵细胞细胞，而高产，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是奶牛的克隆过程的受体细胞是去核去核卵母卵母细胞细胞；多；多莉克隆过程是将供体莉克隆过程是将供体细胞核细胞核注入受体细胞，而高注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体产奶牛的克隆过程是将供体细胞细胞注入受体细胞。注入受体细胞。6 6、讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明、讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？理由？ 卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便供体动物，操作也方便思考题思考题体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景 1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育2、保护濒危物种，增加存活数量、保护濒危物种，增加存活数量3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植器官的移植体细胞核移植技术存在的问题：体细胞核移植技术存在的问题：许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。器缺陷，免疫失调等。v1细胞的衰老与动物机体的衰老有着密细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。所以更容易培养。2脱分化又称去分化，是指分化细胞失去脱分化又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。植物的任何一部分，甚至特性的过程。植物的任何一部分，甚至单个细胞都具有长成完整植株的能力。单个细胞都具有长成完整植株的能力。但要发育成完整植株，必须先脱分化，但要发育成完整植株，必须先脱分化，脱分化的细胞具有发育成任何组织的能脱分化的细胞具有发育成任何组织的能力，然后进行再分化，形成完整植株。力，然后进行再分化，形成完整植株。植物细胞培养主要用于农林生产中的作植物细胞培养主要用于农林生产中的作物、苗木育种，快速繁育种苗、培育无物、苗木育种，快速繁育种苗、培育无病毒植株等，这就要求植物的组织或细病毒植株等，这就要求植物的组织或细胞先进行脱分化。胞先进行脱分化。动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。器官。v3（1）可以用体细胞核移植技术克隆）可以用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达。卢辛达的产奶量很高，高产奶牛卢辛达。卢辛达的产奶量很高，说明它有高产奶的遗传基础，利用卢辛说明它有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。后代，从而加快奶牛改良进程。v但同时需注意，该克隆牛不能无限制但同时需注意，该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。出现近亲繁殖而引起种质衰退。v3（2）首先从卢辛达耳朵（也可用别的组）首先从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。v4在研究方面，克隆动物基因组重新编在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。早衰等问题。这些问题尚在研究中。v在应用上，生产克隆动物费用昂贵，在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。距大规模应用还有一定距离。