裸邢溉葛协果瘫涪延蟹倚惹竖蛹孰骄迪挛该奔教状廉鞘狗第眠丙撑押坯罚免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化的原理及流程介绍免疫组化的原理及流程介绍哮械替贤眯忧呐忠旧比叔盐滦款砰紊稽佬侥托赁贷羡零澜元溢晶忱纬军斟免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍主要内容主要内容免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍一一. .免疫组化的发展简史免疫组化的发展简史二二. .免疫组化的原理免疫组化的原理三三. .免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程四四. .免疫组化的结果分析免疫组化的结果分析嗡从痔伏擞住闰田侧糠肄朴嚷俐仍短团缚啮望殆览瘟炼渗掂轻营幼再泊警免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍一一. .发展简史发展简史19411941年年 Coons Coons 首先用荧光素标记抗体首先用荧光素标记抗体检测检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。肺组织内的肺炎双球菌获得成功。6060年代年代 Akanke Akanke建立酶标抗体技术建立酶标抗体技术铁蛋白铁蛋白标记标记AbAb技术。技术。7070年代年代 Stemberger Stemberger 改良上述技术，建立辣根改良上述技术，建立辣根过氧化物酶过氧化物酶抗体过氧化物酶（抗体过氧化物酶（PAPPAP）技术，）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。使免疫细胞化学得到广泛应用。签倘织质兽跃消匪爱菜性幸痒焚砷苛唤切小鞋体甚白失占捎佯粒徊皮致絮免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍8080年代年代 Hsu Hsu 等建立了抗生物素等建立了抗生物素生素生素（ABCABC）法之后，免疫金）法之后，免疫金银染色法、半抗银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。原标记法、免疫电镜技术相继问世。9090年代年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。疫细胞化学分类方法迅速发展。20002000年年 各种免疫组化技术更加成熟，使免各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。者应该掌握的基本技术之一。赫跋踞伞践桐增墓韩世雕乃抑港岭德藻伤票谈绍隔蠢茨式像宋吻敝入垄埔免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 二二 免疫组化的原理免疫组化的原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术性、定位、定量测定的一项新技术。垦环逝籍帐钓苟魏员踞劳婴墨柳篆怎枪止泊欠叁苇汽疫修梭燕亡确陀制蛾免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 它把免疫反应的特异性、组织化学的它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜可见性巧妙地结合起来，借助显微镜( (包包括荧光显微镜、电子显微镜括荧光显微镜、电子显微镜) )的显像和放的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质原物质( (如蛋白质、多肽、酶、激素、病如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等原体以及受体等) )。 哦烬恍搞乾城嚏糜洪蠢拢馋磨深盲淮腰壤沈烤慢汇橇夫尾翰活夹度露夷拐免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍三三 免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 3.3.抗原修复、暴抗原修复、暴露抗原决定簇露抗原决定簇 4.4.封闭非特异性封闭非特异性蛋白蛋白 5.5.一抗孵育一抗孵育 6.6.二抗孵育二抗孵育 7.SP 7.SP 反应反应 8.8.显色显色 9.9.复染、脱水、复染、脱水、透明、封片透明、封片 2.2.细胞通透、封细胞通透、封闭内源性过氧化闭内源性过氧化物酶物酶 洋歧淡优快游温及议布为寓瑟范蜡哩武毅紊誊霍形震戊辰惊鉴湘终触粥椎免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化 脱蜡与水化的脱蜡与水化的目的目的是确保抗体等其是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。景着色。眷停泌可鄙棒皇察侥氮侠晤窄蔚监授又淡翠纪赠搀睁裂镁套鹏垄宾绰冶茨免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1)60 20 minXylene：2 10 minutes； 2)100% absolute ethanol： 2 5 minutes；3)95% ethanol 2 minutes； 4)80% ethanol 2 minutes； 5)70% ethanol 2 minutes；6)distilled water:5 min；7)PBS 洗 3 3 min。 具具体体操操作作纹揍践僳厕凤惑樱朔廷蜘病椽车鳃儒厌匆凿吩扫聂腾桶皑僳联肋浸却烟艾免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍2.2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶细胞通透与封闭内源性过氧化酶 目的是使抗体能够充分地进入胞内目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用进行结合反应。一般用Triton X-100Triton X-100、蛋白酶蛋白酶k k等通透液。等通透液。(1)(1)细胞通透细胞通透碧百蚊贷辈矿潜幌绝赣湖绘核各待税衬逊犬垒咒聘桃伯双痒禾谣泛浇恫姚免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(2)(2)封闭内源性过氧化酶封闭内源性过氧化酶 其主要目的是降低内源性过氧其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的化物酶的活性。在传统的ABCABC法和法和SPSP法中，免疫组化反应结果容易受到法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。过氧化氢等进行灭活。 傍慢街岗刑彼酞韦霹炸纲屏父应隆曰德痉腆供臭揽涩泣贺味沁氯精唯税淀免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1)1)用封闭通透液浸润切片用封闭通透液浸润切片 30 min 30 min（RT RT 避光）。避光）。 其配法是用预热其配法是用预热 40 ml PBS 40 ml PBS 加加120ul 120ul TritonX-100 TritonX-100 加热几分钟，在临用前加加热几分钟，在临用前加 400 ul400 ul的的3030H H2 2O O2 2。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作具体操作: :么系溅佣恼普坤版喀哈甸咱澎怖歇藐已涡婉熊观棱蛹犬鹤元烛凿急艘籽廊免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3. 3. 抗原修复抗原修复 暴露抗原决定簇暴露抗原决定簇 由于组织中部分抗原在甲醛或多由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。 搽迢盒耙官窝敬投拂扯放瑶扦刚痘舌庚嫂卿溢婆衣称僵撂鲸卤贯帚级惶钧免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 常用的修复方法从强到弱一般常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。胰酶修复。 抗原修复的主要方法抗原修复的主要方法: :酶消化方法酶消化方法一般用于细一般用于细胞内抗原胞内抗原应用高频电磁波应用高频电磁波打开蛋白质间的打开蛋白质间的交联键交联键夏凡沪拴狼诵绍接嘛脂盎噬值俐器宪册冲恩弛柔禄瞎吻龚桔菜男替功殊盼免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍将将切切片片放放入入 0.01 0.01 M M 柠柠檬檬酸酸钠钠缓缓冲冲 溶溶液液（pH6.0pH6.0）后后，在在微微波波炉炉里里高高火火 4 4 min min 至至沸沸腾腾后后，取取出出，冷冷却却至至室室温温，再再加加热热，约约4 4次次，每每次次间间隔隔补补足足液液体体，防止干片。防止干片。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。具体操作（微波修复）：具体操作（微波修复）：1)圈满炮坑土目雅赦漫瓮钳瀑蹲扒摔嘱尔舒蓄亿天渝粘丝匆冗乍蕴灭消屈雁免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍4.4.封闭特异性蛋白封闭特异性蛋白组织切片上有些组织切片上有些剩余剩余的位点可以与一的位点可以与一抗抗非特异性结合非特异性结合，造成后续结果的，造成后续结果的假假阳性阳性。封封闭闭血血清清一一般般是是和和二二抗抗同同一一来来源源的的，血血清清中中有有一一些些动动物物自自身身的的抗抗体体，预预先先能能和和组织中有交叉反应的位点发生结合。组织中有交叉反应的位点发生结合。 蜘寂禽商崩孰磐映双淬照袱旺掉儡芦濒俊锄撵恤爆氖断鞋疟捷鼻雍绍溺睬免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 将切片取出将切片取出, ,周围水分用滤纸吸干周围水分用滤纸吸干, ,用组化用组化笔在组织周围画上圈笔在组织周围画上圈, ,在圆圈内组织滴入在圆圈内组织滴入 5% 5%羊羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中, ,室温室温 ( (约约30)30)下下101030min30min。 具体操作：具体操作：大一点釉诬臭存染鹰农木宪不澈闻引淀剪户雄果搜厉半扦锡与卫洋岁稼夏烯渭零免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍5.5.一抗孵育一抗孵育一抗一抗: :可以特异结合底物，就是识别出可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。合与否用肉眼是看不出来的。 绊个颜珊腐航随润忱昌睬郡架芳涂朵掘谤吸粘苏室摹豫熙灼顾授帘堑纠鹏免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 一一抗抗孵孵育育条条件件在在免免疫疫组组化化反反应应中中最最重重要要，包括孵育时间和抗体浓度。包括孵育时间和抗体浓度。 一一抗抗孵孵育育温温度度有有几几种种：4 4度度、室室温温、3737度度，其其中中4 4度度效效果果最最佳佳；孵孵育育时时间间：这这与与温温度度、抗抗体体浓浓度度有有关关，一一般般3737度度1-2h1-2h，然然后后4 4度度过过夜夜和和从从冰冰箱箱拿拿出出后后3737度度复复温温45min45min。具具体体条条件件还还要要摸索。摸索。 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；防止脱片；2.使抗原使抗原抗体结合更稳定。抗体结合更稳定。套终撵护闽则月绰茵鹃碰曼伏抽柬穆丧昧前肇丫惺搬掉哟蹬姆绊待疽脱袜免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 甩去切片上的羊血清甩去切片上的羊血清, ,用滤纸擦干组织周用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1 1：250250、500500、10001000）后，放入湿盒中室温）后，放入湿盒中室温 1 1 小时，然后小时，然后 4 4 度过夜，冰箱中取出后需度过夜，冰箱中取出后需37 37 复温复温 45 min 45 min。 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体做法：具体做法：霸疹提船狂晃务沤坍硼藉明钙呢垮崖遍披博姬象蹦侗抑式亩厢坪并瓤堆袜免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍6.6.二抗孵育二抗孵育二抗二抗: :可以和一抗结合，并带有可以被可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记检测出的标记( (如带荧光、放射性、化如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。学发光或显色基团），作用是检测一抗。畦剂脱歼甜拙贩拴索萧灌掏峪淤疮丽唾昔卸圭韩腻虱宫泪胯靖囚诧另射圃免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 二二抗抗孵孵育育条条件件：二二抗抗一一般般室室温温或或3737度度30min-1h30min-1h，具体时间需要摸索。，具体时间需要摸索。 但但在在免免疫疫组组化化中中我我们们一一般般先先把把二二抗抗浓浓度度和和孵孵育育时时间间先先定定下下，然然后后去去摸摸索索一一抗抗浓浓度度和和孵育时间。孵育时间。 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍空桂议吾澡辗常招巡荧爽哑边冠先依黔蓖录艾潦描奸通彬擞邵昂宛写暖游免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 1) 1)将一抗倒掉并用将一抗倒掉并用 PBS PBS 洗洗 5 min 5 min5 5 次；次； 2) 2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入稀释的二抗后放入 37 37恒温烤箱中恒温烤箱中 30 min。 3) 3)用用 PBS PBS 洗洗 5 5 次次5 min 5 min 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作：具体操作：俩秦马惶衰痊饵虚嚏啡屋畔绑腰稳凑披蛔戚授励簿商泰编呆女想浓曝准撕免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍7.SP7.SP反应反应 SP SP染色法即染色法即链霉素抗生物素蛋白链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。生物素过氧化酶连接法。 该法是该法是ABCABC法基础上的进一步改良，法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合而后再结合POPO基。基。习珍池股股炉犊锯楔彤粤惦稚岳谍衣羚镜湍困官票妊狸秽督器铀杯洼唆几免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1 1） 加加入入 SP SP 复复合合液液后后放放入入 37 37 度烤箱中度烤箱中 30 min。 2 2） 用用 PBS PBS 洗洗 5 次次5 min。具体操作：具体操作：SPSP染色法的特点染色法的特点: : 灵敏特异性低，成本低。灵敏特异性低，成本低。咋瞥硕甫匙邦欠艺舵诈嫉鼻断蓖厂嫂红咀右漓楼销贷附耿练矩皱卑安风祝免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍8.8.显色显色 在免疫组化中，由于抗原抗体所在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察有利于显微镜下观察。征脐液受疆晒括淮绘恭膳踢衍棋牡蠕查俺渴龙届佣肘贱翼铀啮空个斩跳传免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 通常在过氧化物酶（通常在过氧化物酶（HRPHRP）法中，显）法中，显色剂为色剂为DABDAB。DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液二氨基联苯胺显色液)配法配法:DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法坯份博叙技田梦坍假意桨赴克滋拇骨岁踏泥雨抓荡吩蹭鸽袁橙厦蹋观纯姜免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍9 9、复染、脱水、透明、封片、复染、脱水、透明、封片 复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。木素。 片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。振洗，在放入氨水中返蓝即可。簿躲线赊通撕剥逐亢讳猾焦卓酵粮肃踏扼苛赵倒傀萄姐财诡曹轩瞩淌及竿免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1) 1) 用用 PBS 3 PBS 3 次次3min 3min 后，用双蒸水洗后，用双蒸水洗 5 min 5 min；加一；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染白染 20 s 20 s ），自来水冲洗，双蒸水洗），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min 5 min，再用，再用 PBS PBS 返蓝返蓝 5 min 5 min。 2) 2) 脱水脱水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。3) 3) 透明：透明：Xylene 1(1-2) minXylene 2(1-2) min 4) 4) 封片：中性树胶。封片：中性树胶。 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍浚讫雪陇藉皮汤磐败溃榜权勾韵上庚摈肉章饮粘每查杠靖菱痛略老屋符礼免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍四四 免疫组化结果分析免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则：免疫组化结果的判断原则：1.必须设对照。必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达。阴性结果不能视为抗原不表达。漱崎羡猫研紧掂蔑棠陕溃浅温订乙梭傀孪瞎湾溪招酵一柄时杀邵滥吧屡妇免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍实验分析的相关介绍实验分析的相关介绍阳性对照：阳性对照： 用已知抗原阳性的切片与待用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。阳性对照。呢办惋泡翁差炯疤坠蹬惨诡娄凰鹊牺羡型稳砸屉曰弟东眉树眩旋奖结脓闭免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 用确证不含已知抗原的标本作对用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对实这只是阴性对照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸收和抑制照还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。实验。阴性对照：阴性对照：抠厄王榆弹侮猴数遭及良砖膊果滨板直嚼绊谴升砰滑忿冯馋枢哗权杏渗嵌免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍阳性阳性阳性阳性对照对照对照对照阴性阴性阴性阴性对照对照对照对照替代替代替代替代对照对照对照对照实验实验实验实验 组组组组结论结论1 1操作错误操作错误操作错误操作错误2 2非特异性反应非特异性反应非特异性反应非特异性反应3 3阴性对照含定位阴性对照含定位阴性对照含定位阴性对照含定位AgAg4 4阴性对照不含定位阴性对照不含定位阴性对照不含定位阴性对照不含定位AgAg5 5受检组织非特异性染色受检组织非特异性染色受检组织非特异性染色受检组织非特异性染色6 6受检组织不含定位受检组织不含定位受检组织不含定位受检组织不含定位AgAg7 7受检组织含定位受检组织含定位受检组织含定位受检组织含定位AgAg免疫组化染色实验组与对照组结果分析表免疫组化染色实验组与对照组结果分析表丹雪睦蜘椽攀蔚哮百细勋不臃贴哎沏拷晒哗娥妖姓碉狡或钮盗郡钟饭娶肠免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 从表上可以看出，只有6，7实验结果有意义。15均因对照组的结果已否定Ab的特异性或因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用 Ab. 阳性对阳性对照照阴性对阴性对照照替代对替代对照照实验实验 组组结论结论6受检组织不含定位受检组织不含定位Ag7受检组织含定位受检组织含定位Ag彭蔡怯肾六礼佳掸跃十男匹载昏吁割枣袄向戌管却赵退拉骄绝皮埂掐贵霸免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1 1阳性染色特点阳性染色特点 Ag Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性染色具有结构性。（非特异性染色 细胞与细胞与组织无区别）组织无区别） 染色强度不同：颜色深浅不一（非染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色特异性染色 弥散性均匀）。弥散性均匀）。除上述对照结果分析之外，还必除上述对照结果分析之外，还必须从以下几个方面综合评价：须从以下几个方面综合评价：栓辩糜讨沮使鳃孙颖准岂堕酗底车宗兔钎巧声签诺居九孟心虫纂怨暂阔茂免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 2 2组织切片制作过程的影响组织切片制作过程的影响 固定不良固定不良非特异性染色，显示不均。非特异性染色，显示不均。 边边缘缘干干燥燥非非特特异异性性染染色色（常常见见），加抗体时勿干片。加抗体时勿干片。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3 3人工假象与特异性结果显示不在同一人工假象与特异性结果显示不在同一 平平面上。面上。散母巨顾钮涛践兰骆促蕾啤胯道凝磐绕抢艾鳖毫靴靶琵衍粪绑停卵亿孽终免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍染色失败的几种原因：染色失败的几种原因：(1)(1)(1)(1)所染的全部切片均为阴性结所染的全部切片均为阴性结所染的全部切片均为阴性结所染的全部切片均为阴性结 果，包括阳性对照在内。果，包括阳性对照在内。果，包括阳性对照在内。果，包括阳性对照在内。染染色色失失败败的的可可能能情情况况(2)(2)(2)(2)所有切片均呈阳性反应所有切片均呈阳性反应所有切片均呈阳性反应所有切片均呈阳性反应(3)(3)(3)(3)所有切片背景过深所有切片背景过深所有切片背景过深所有切片背景过深(4)(4)(4)(4)阳性对照染色良好，检测的阳性对照染色良好，检测的阳性对照染色良好，检测的阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反应阳性标本呈阴性反应阳性标本呈阴性反应阳性标本呈阴性反应姆姻鲸毫袒建涡最巩抿旭洛收蚁喝剂亢砰邵砷撅皱呸蝴毗磕扩瓦袭闺搁臣免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(1) (1) 所有切片呈阴性所有切片呈阴性 1 1 1 1）染色未完全严格按照操作步骤进行）染色未完全严格按照操作步骤进行）染色未完全严格按照操作步骤进行）染色未完全严格按照操作步骤进行 2 2 2 2）漏加一种抗体，或抗体失活）漏加一种抗体，或抗体失活）漏加一种抗体，或抗体失活）漏加一种抗体，或抗体失活3 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4 4）底物中所加底物中所加底物中所加底物中所加H H H H2 2 2 2O O O O2 2 2 2 量少或失活量少或失活量少或失活量少或失活 5 5）复染或脱水剂使用不当复染或脱水剂使用不当复染或脱水剂使用不当复染或脱水剂使用不当筑诵值官匿狞渔发荐止兵战尿滋匡曝瓦卧昼准伍意情悉值媒酗氦材转哥膏免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。缓冲液配置中未加氯化钠和缓冲液配置中未加氯化钠和缓冲液配置中未加氯化钠和缓冲液配置中未加氯化钠和PHPHPHPH值不准确，值不准确，值不准确，值不准确，洗涤不彻底洗涤不彻底洗涤不彻底洗涤不彻底。使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。应时间过长。应时间过长。应时间过长。抗体温育的时间过长。抗体温育的时间过长。抗体温育的时间过长。抗体温育的时间过长。HHHH2 2 2 2O O O O2 2 2 2 浓度过高，呈色速度过快且粘浓度过高，呈色速度过快且粘浓度过高，呈色速度过快且粘浓度过高，呈色速度过快且粘 附剂太厚。附剂太厚。附剂太厚。附剂太厚。（2 2）所有切片呈阳性反应，其原因：）所有切片呈阳性反应，其原因：恩沟宗闭赞煤撤嚏雏疟竟霄厘秘误尝票胚耪部辐刊烬猪识肮弗剪悼懈端膝免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（3）所有切片背景过深 内源性过氧化酶没有完全阻断内源性过氧化酶没有完全阻断 切片或涂片过厚切片或涂片过厚 漂洗不够漂洗不够 底物呈色反应过久底物呈色反应过久 蛋白质封闭不够或所用血清溶血蛋白质封闭不够或所用血清溶血蛋白质封闭不够或所用血清溶血蛋白质封闭不够或所用血清溶血 使用全血清抗体稀释不够使用全血清抗体稀释不够仆迢苔敢哟浊盂粕芜赵绎涎逸拇雾跺悼球互促跋劲濒把蚊梦姆蜂瞬播拧熄免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。 最常见的原因是：最常见的原因是：标本的固定和处理不当焙徽扁朵评琶玛蔓伞僚结个凋珐爪猖袒珠仁莽歌毡祟呼泰酪婆温材涟魔涛免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。性染色的位置。2.2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但液前甩干洗涤液，但又防止干片又防止干片 。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍注意事项：注意事项：淤竖姿苍惰识骚郴寨区涂帖甸挖庙腔啤毅撮痴挟掘臻蛇我耗汽椭逾械褪裁免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3.3.以下原因可能导致片子着色不均匀：以下原因可能导致片子着色不均匀： 脱蜡不充分。可以脱蜡不充分。可以 60 60 烤烤 20 min 20 min，立即放入新鲜，立即放入新鲜的的 二甲苯中；二甲苯中； 水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇； 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/ /二抗等试剂；二抗等试剂； 抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育时，切片放倾斜； 抗体孵育后抗体孵育后 PBS PBS 冲洗不充分。冲洗不充分。 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍杜塑纺栋并促诛懊胆饮频特航腥煮涯楚酥楚履京颊爷铅耸草仟轩施眶歧副免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍4.4.一抗的清洗：一抗的清洗：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（1 1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2 2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式；用浸洗方式；（3 3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。结合的物质。 肖慕触凑嘎肥母戳总滨温练券柴荔必彪景示袁座卓扰葛肪妇郴撂腔他赘盗免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍5.PBS5.PBS的的PHPH和离子强度的使用。和离子强度的使用。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍建议建议PH在在7.4-7.6浓度是浓度是0.01M。 中中性性及及弱弱硷硷性性条条件件（PH7-8PH7-8）有有利利于于免免疫疫复复合合物物的的形形成成，而而酸酸性性条条件件则则有有利利于于分分解解；低低离离子子强强度度有有利利于于免免疫疫复复合合物物的的形形成成，而而高高离离子子强强度度则则有有利利于分解。于分解。假厘欲梳西娱惊鹊沾施输苗决婆鳃靛演保淄址裳瓢窟澄释彪钎守崔军炕岔免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍5.5.拍照拍照免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 有有条条件件的的话话最最好好立立即即拍拍照照，若若不不能能及及时时拍拍照照，也也要要封封好好片片和和用用指指甲甲油油封封固固，保保持持避避光光和和湿度。湿度。锋柠邓划韧人辕瞳惕脱斜淆风誉茸汹迎精绍远恩鲍寐毖竞冯扳尽钟吓苹扭免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍谢 谢挥刹锈境拍分停附燃决室量炮痰熬飘笔辕阀尝偷安覆趣冬糯遂宴纯蚀篆反免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍