实实 验验 九九蛋白质的诱导表达蛋白质的诱导表达背景理论知识背景理论知识Section 19.1.1 9.1.1 实实 验验 目目 的的1.掌握蛋白质诱导表达的原理掌握蛋白质诱导表达的原理2.学习蛋白质诱导表达的方法学习蛋白质诱导表达的方法3.了解重组蛋白质表达的体系及其优缺点了解重组蛋白质表达的体系及其优缺点外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞基因工程的最终目的主要步骤主要步骤制备表达载体制备表达载体制备目的制备目的DNA将目的将目的DNA 克隆到载体上克隆到载体上 操作操作1. 酶切酶切, 去磷酸化去磷酸化2. 胶回收纯化胶回收纯化1. 质粒纯化质粒纯化/PCR2. 酶切酶切3. 胶回收纯化胶回收纯化1. 目的片断与载体连接目的片断与载体连接2. 转化非表达型宿主菌转化非表达型宿主菌3. 筛选阳性克隆筛选阳性克隆: 菌落菌落PCR, 质粒质粒提取酶提取酶,测序确定阅读框测序确定阅读框蛋白表达操作流程蛋白表达操作流程 转化表达宿主菌转化表达宿主菌 诱导优化表达目的蛋白诱导优化表达目的蛋白 纯化目的蛋白纯化目的蛋白1. 转化带有转化带有T7RNA 聚合酶基因聚合酶基因 的菌株的菌株1. 检测质粒稳定性检测质粒稳定性2. 确定表达时间和温度的最佳条件确定表达时间和温度的最佳条件3. 分析蛋白溶解性和活性分析蛋白溶解性和活性4. SDS-PAGE, Western 印迹等印迹等 确定目的蛋白确定目的蛋白1. 放大培养放大培养2. 制备粗提物制备粗提物3. 亲和纯化亲和纯化4. 切除融合标签并去除蛋白酶切除融合标签并去除蛋白酶蛋白质表达系统原核表达系统原核表达系统真核表达系统真核表达系统大肠杆菌大肠杆菌枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌YEASTYEASTYEASTYEASTCELL CULTURECELL CULTURECELL CULTURECELL CULTUREINSECT CELLINSECT CELLINSECT CELLINSECT CELLTRANSFERRED GENETRANSFERRED GENETRANSFERRED GENETRANSFERRED GENE简单简单, ,便宜便宜, ,大量大量, ,无修饰无修饰复杂复杂复杂复杂, , , ,昂贵昂贵昂贵昂贵, , , , 有修饰有修饰有修饰有修饰大大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。低，生产成本低廉。9.1.2 9.1.2 原核表达的特点原核表达的特点细菌细菌RNARNA聚合酶不能识别真核基因启动子聚合酶不能识别真核基因启动子真核基因真核基因mRNAmRNA无无SDSD序列，不能启动翻译序列，不能启动翻译缺乏转录后加工系统，不能切除内含子缺乏转录后加工系统，不能切除内含子, cDNA, cDNA,表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏缺乏翻译后加工体系缺乏翻译后加工体系不溶性的包涵体不溶性的包涵体在在E.coliE.coli中中表达重组蛋白功能最强大表达重组蛋白功能最强大目的基因受噬菌体目的基因受噬菌体T7T7强转录及翻译信号控制强转录及翻译信号控制表达由宿主细胞提供的表达由宿主细胞提供的T7 RNAT7 RNA聚合酶诱导聚合酶诱导充分诱导充分诱导: : 几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白, , 数小时后达细胞总蛋白的数小时后达细胞总蛋白的50%50%以上以上非诱导条件下非诱导条件下: : 可使目的基因完全处于沉默状态而不转录可使目的基因完全处于沉默状态而不转录结结构构基基因因：编编码码 - -半半乳乳糖糖苷苷酶酶（Z Z）、透透性性酶酶（Y Y）和和硫硫半半乳乳糖糖苷苷乙乙酰酰转移酶（转移酶（A A）的基因的基因。操操纵纵子子：包包括括启启动动子子、操纵基因和结构基因操纵基因和结构基因调节基因、调节基因、阻遏蛋白阻遏蛋白乳乳糖糖+ +阻阻遏遏蛋蛋白白，改改变变阻阻遏蛋白遏蛋白的形状。的形状。9.1.3 9.1.3 乳糖操纵子乳糖操纵子9.1.4 9.1.4 诱导原核表达的原理诱导原核表达的原理E.coliE.coli BL21BL21(DE3)(DE3)：DE3DE3是整合在细菌基因组上的一种是整合在细菌基因组上的一种携带携带T7 RNAT7 RNA聚合酶基因和聚合酶基因和lacIlacI基因的基因的噬菌体，其基噬菌体，其基因型为：因型为：lacIlacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5lacIlacI产生的阻遏蛋白与产生的阻遏蛋白与laclac操纵基因结合，从而不能操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTGIPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。基因大量转录并高效表达。9.1.5 9.1.5 蛋白原核表达载体蛋白原核表达载体具备与克隆载体相同的条件：自主复制序列具备与克隆载体相同的条件：自主复制序列, ,可供筛选的遗传性状，可供筛选的遗传性状，MCSMCS还必须具有用于外源基因表达的启动子、还必须具有用于外源基因表达的启动子、SDSD序序列、及转录终止子等元件。列、及转录终止子等元件。 pETpET系列：系列：6 His Tag(660Da-2kDa)6 His Tag(660Da-2kDa) pGEXpGEX系列：系列：GST(26kDa)GST(26kDa) pMALpMAL系列：系列：Maltose Binding Protein Maltose Binding Protein (52kDa)(52kDa)pETpET系列系列pGEXpGEX系列系列pMALpMAL系列系列9.1.6 9.1.6 融合蛋白融合蛋白融合蛋白融合蛋白: : 将两个或多个开放阅读框按一定顺序连将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接接, , 融合阅读框表达出一杂合蛋白融合阅读框表达出一杂合蛋白融合标签融合标签: : 1. 1. 保护目的蛋白使之不被降解保护目的蛋白使之不被降解 2. 2. 用于检测和纯化目的蛋白用于检测和纯化目的蛋白 3. 3. 增加目的蛋白在细胞质中的可溶性增加目的蛋白在细胞质中的可溶性 4. 4. 帮助将目的蛋白运转到细胞周质中帮助将目的蛋白运转到细胞周质中 以提高其生物活性以提高其生物活性9.1.7 9.1.7 阅读框架的保证阅读框架的保证pGEXpGEX系列系列D DNANA转转录录和和RNARNA翻翻译译，即即遗遗传传信信息息从从基基因因流流向向RNARNA又又流流向向蛋蛋白白质质的的过过程程总总称称为为基基因因表表达达, ,基基因因表表达达可可以以在在不不同同的的水水平平上上进进行行调调控控，如如控控制制基基因因的的开开启启、关关闭闭和和活活性性的的大大小小，影影响响和和控控制制转转录录和翻译等都属于基因表达的调控。和翻译等都属于基因表达的调控。1.1.影响转录水平的因素：强启动子，强终止子影响转录水平的因素：强启动子，强终止子 等。等。2.2.影响翻译水平的因素：影响翻译水平的因素：SDSD序列，序列，mRNAmRNA稳定性等。稳定性等。3.3.影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易降解。影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易降解。9.1.8 9.1.8 影响表达效率的主要因素影响表达效率的主要因素9.1.9 9.1.9 优化表达优化表达(1)(1)增加蛋白质溶解性及折叠增加蛋白质溶解性及折叠: : 温度温度: 37 : 37 C C 蛋白质以聚集的形式表达蛋白质以聚集的形式表达-包涵体包涵体 30 30 C C 可溶的有活性的蛋白可溶的有活性的蛋白 细胞周质定位细胞周质定位: : 有利于蛋白折叠及二硫键的形成有利于蛋白折叠及二硫键的形成稀有密码子稀有密码子: : 多数氨基酸都有一个以上的密码子多数氨基酸都有一个以上的密码子, , 但有一些但有一些 E.coliE.coli很少很少 使用使用, , 当异源目的基因的当异源目的基因的mRNAmRNA过过表达时表达时, , tRNAtRNA 的的数量直接数量直接 反应密码子的偏倚性反应密码子的偏倚性, , 一个或多个一个或多个tRNAtRNA的的稀有或缺少会导稀有或缺少会导 致翻译的停止致翻译的停止毒性基因和质粒稳定性毒性基因和质粒稳定性: : 抗生素的使用抗生素的使用 补充葡萄糖补充葡萄糖提高翻译水平：提高翻译水平： 调整调整SDSD序列与序列与AUGAUG间的距离、点突变改变碱基、增加间的距离、点突变改变碱基、增加mRNAmRNA稳定性稳定性减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平：减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平： 细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。 化学诱导，温度诱导。化学诱导，温度诱导。提高蛋白质稳定性，防止降解。提高蛋白质稳定性，防止降解。 表达融合蛋白，表达分泌蛋白表达融合蛋白，表达分泌蛋白( (防止降解，减轻代谢负防止降解，减轻代谢负荷、恢复天然构象荷、恢复天然构象) )9.1.9 9.1.9 优化表达优化表达(2)(2)实验操作实验操作Section 29.2.1 9.2.1 实验器材实验器材1 1、基因工程菌、基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-eGFPBL21(DE3)/pET28a-eGFP 每位同学每位同学(20ml(20ml菌液菌液/ /三角瓶三角瓶) )2 2、IPTG(IPTG(乳糖结构类似物乳糖结构类似物) )3 3、LB(KanLB(Kanr r) )4 4、离心机、离心机9.2.2 9.2.2 实验步骤实验步骤(1)(1)1.1.原核表达载体转化到原核表达载体转化到BL21(DE3)BL21(DE3)菌株中。菌株中。2.2.挑取单菌落于挑取单菌落于2mL Kan2mL Kan+ + LBLB培养基培养过夜。培养基培养过夜。( (已做已做) )3.3.以以5%5%的比例转接于的比例转接于20mL 20mL KanKanr r LB LB培养基中培养基中( (加加2020LKan)LKan)，培养约，培养约1 1小时至约小时至约ODOD600600=0.4-0.6=0.4-0.6，即即可开始诱导目的蛋白的表达。可开始诱导目的蛋白的表达。4.4.取取1.5mL1.5mL菌液菌液, ,制样作为未诱导对照。制样作为未诱导对照。5.5.三角瓶中加入三角瓶中加入IPTG 20IPTG 20L(0.2M)L(0.2M)至终浓度为至终浓度为0.2mM0.2mM，继续培养。，继续培养。取样：分别于培养后，取样：分别于培养后，40min40min，80min,120min80min,120min取取1mL1mL菌液菌液制样。制样。( (0min0min样品处理一致样品处理一致) )制样：制样：12000rpm12000rpm离心离心1min,1min,去掉上清。去掉上清。加入加入2525L ddHL ddH2 2O,O,重悬重悬( (充分分散细胞充分分散细胞) )。加入加入2525L 2L 2SDSSDS凝胶加样缓冲液，混匀。凝胶加样缓冲液，混匀。沸水浴沸水浴5min(5min(蛋白质变性蛋白质变性),),取出后立即置于冰上。取出后立即置于冰上。冷却后冷却后, ,冰箱冷藏冰箱冷藏, ,备用。备用。9.2.2 9.2.2 实验步骤实验步骤(2)(2)9.2.2 9.2.2 实验步骤实验步骤(3)(3)待纯化样品的收集和制备：待纯化样品的收集和制备：l收集10ml诱导好的菌液（180min）于15ml 离心管中，5000g离心5min。l倒掉上清液，用1.0ml lysis buffer（洗涤缓冲液）重悬菌体，转移至1.5ml离心管。l10000rpm离心2min，去上清。细菌冻存-20备用。实验关键点实验关键点n诱导和取样时要进行无菌操作。诱导和取样时要进行无菌操作。n制备样品时制备样品时, ,细菌培养基上清除细菌培养基上清除干净干净, ,且要充分悬浮。且要充分悬浮。n每个时间点的样品要立即制样每个时间点的样品要立即制样 并做好标记。并做好标记。l 如何通过调节如何通过调节IPTGIPTG的浓度和温度来的浓度和温度来控制蛋白表达速度，从而提高蛋白的控制蛋白表达速度，从而提高蛋白的可溶性？可溶性？思思 考考 题题下下 次次 实实 验验诱导表达蛋白的诱导表达蛋白的SDS-PAGE SDS-PAGE 电泳检测电泳检测开始工作吧！开始工作吧！LETS BEGIN NOW！