高效毛细管电泳及其在农药分析中的应用一、问题的提出 我国现有中药种类已达12807种，其中药用植物11146种，药用动物1581种，药用矿物80种中草药在保护人民群众健康方面起着重要作用由于需求量大，野生中草药远远不能满足市场的需求，目前大部分中草药都依赖人工栽培全国药材种植面积超过580万亩，药材生产基地600多个，常年栽培的药材达200余种为了保障种植药材的产量，药农不得不频繁地使用各种农药农药残留不仅影响群众的健康，还影响我国名贵药材的出口创汇如80年代末云南省出口日本的三七大量退货，目前我国人参在海外市场日益受韩国高丽参的排挤等，都有农药残留超标的原因二、CE的特点高质量灵敏度：常用紫外检测器的检测限可达10-1310-15mol，激光诱导荧光检测器(LIF)则达10-19-10-21。高分辨率：每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万乃至几千万。高速度：许多分析可在10分钟内完成，有的可在60秒内完成。所需样品少：只需纳升(10-9升)的进样量。成本低：只需少量(几毫升)的流动相和低廉的毛细管。应用范围广：除分离生物大分子（肽、蛋白、DNA和糖等）外，还可用于小分子(氨基酸、药物等)及离子(无机及有机离子等)，甚至可分离各种颗粒(如硅胶颗粒等)。 ：三高二少一广 不足之处：不足之处：进样不够方便。应用范围相对较窄。分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。三、CE的仪器组成及基本原理毛细管电泳仪在实验室中高效毛细管电泳仪器（高效毛细管电泳仪器（1）高效毛细管电泳仪器（高效毛细管电泳仪器（2）+原理以高压电场为驱动力,以毛细管为支撑物,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术.电泳:电渗:在高电压作用下,双电层中的外层阳离子引起流体整体向负极方向移动的现象.3.3.电泳现象与电渗流现象电泳现象与电渗流现象 电泳现象电泳现象： 带电离子在电场作用下的迁移，速度电泳 电渗流现象电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基, pH3时, 形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。待测化合物粒子在毛细管内电解质中的迁移速度(离子淌度或表观淌度)等于自身电泳和电渗两种速度的矢量和.正离子的电泳和电渗流方向一致,最先流出;中性粒子的电泳流速为0,所以其迁移速度等于电渗速度;负离子的电泳方向和电渗流方向相反,它将在中性粒子之后流出,从而因各种栗子的迁移速度的不同而实现分离.4. 分离过程分离过程 电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反，电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。四、CE的分离模式 1 毛细管区带电泳(capilary zone electrophoresis,CZE) CZE的分离机理是基于各被分离物质的净电荷与质量比(荷质比)间的差异。应用范围包括氨基酸、肽、蛋白、离子分析、对映体拆分和很多其它离子态物质的分析。 2 胶束电动色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC) MECC是唯一既能分离中性溶质又能分离带电组分的CE模式。采用表面活性剂(如十二烷基硫酸钠，SDS)在操作缓冲液内形成有一疏水内核、外部带负电的胶束相。利用溶质具有不同的疏水性，在水相和胶束相(准固定相)间分配的差异得以分离。主要用于小分子、中性化合物，手性对映体、各种药物等。(3) (3) 毛细管胶束电动色谱（毛细管胶束电动色谱（MECC） 在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳 ，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。3毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis，CGE) CGE是将凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。不同体积的溶质分子在起“分子筛”作用的凝胶中电泳分离。常用于蛋白质、寡聚核苷酸、RNA、DNA片断分离和测序及PCR产物分析。现在还有采用无胶筛分方法，同样可达分离目的。 4毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing，CIEF) CIEF是用两性电解质在毛细管内建立pH梯度，使各种具有不同等电点的蛋白质在电场作用下迁移到等电点的位置，形成一非常窄的聚焦区带。已成功用于测定蛋白质等电点，分离异构体或用其它方法难于分离的蛋白质。 5毛细管等速电泳(capillary isotachophoresis ，CITP) CITP采用先导电解质和尾随电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离，是一种较老的方式。现在可作为柱前浓缩方法用于富集样品。 6毛细管电色谱(capillary electrochromatography，CEC) CEC是将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。虽然柱效有所下降，但增加了选择性，是一种有发展前景的模式。 三、影响柱效的因素及改进方法三、影响柱效的因素及改进方法热效应热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。电渗流控制电渗流控制：电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。五、 在农药分析中的应用 1. 定量分析研究 2. 在农药制剂和原药中有效成分的测定 3. 在农药中杂质的分离和测定 4. 手性农药分析六、应用实例 毛细管电泳法研究提取剂对黄连黄柏共煎剂中生物碱含量的影响1.样品制备 粉碎过筛浸泡回流用水提取 提取剂提取2. 电泳分析 稳定仪器确定检测波长选择缓冲溶液电泳检测 3、结果与分析成分分析 按照图1b中所示得试验条件，采用加入法测定小檗碱等得溶液电泳图，结果见图2。1至6峰对应的化合物分别为黄连碱、小菜碱、麦小菜碱、巴马汀、药根碱、小菜红碱。与图1b的结果相比较，黄连。黄柏配伍后共煎浸膏中的主要成分为黄连碱、小果碱、麦小菜碱、巴马汀和药根碱。 线性关系配制一系列小菜碱和巴马汀的标准混合镕液，在同一条件下测定电泳图，以峰面积对浓度作图，结果小菜碱和巴马汀分别在15.065.0mgL，12.550.0mg/L之间有良好的线性关系，回归方程为：小檗碱：y1455.3C2134 r09984 (1) 巴马汀：y79763C十34622 r09995 (2)八、结束语 CE作为一种新的分离手段，在农药分析中有广泛的应用前景。它的微量，解决了中药提取的困难。它的高效，使中药多种成分的同时分离成为可能，它的快捷提高了分析效率。与MS联用，在定量的同时对每种成分的结构进行了解析。另外，CE的其它分离模式，如毛细管电色谱（CEC）也将相继应用于农药分析。我们相信CE作为一种强有力的分析技术，势必在中药成分分析中发挥更大的作用，为实现中药现代化和国际化作出贡献。