LOGO基因分析的基本技术基因分析的基本技术1LOGOwww.themegallery.com Central Dogma ProteinDNARNATranslation Transcription脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸Deoxyribonucleic acidLOGOwww.themegallery.com 碱基碱基 Base脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸Deoxyribonucleotide：腺嘌呤腺嘌呤 （Adenine,A） 胸腺嘧啶胸腺嘧啶 （Thymine,T） 鸟嘌呤鸟嘌呤 （Guannine,G） 胞嘧啶胞嘧啶 （Cytosine,C）磷酸磷酸PhosphateOP-OO-OCH25OOHH4321戊糖戊糖PentoseLOGOwww.themegallery.com H2OOHCH25OH4321OP OO O5OP OO O5CH25OH4321OP OO OCH25OH4321OH3,5-Phosphodiester bond脱氧核糖核苷酸通过脱氧核糖核苷酸通过3 3,5,5- -磷酸二酯键磷酸二酯键连接起来，形成多核苷酸长链连接起来，形成多核苷酸长链HOP OO OOP OO OOP OO OCH25OH4321OHLOGOwww.themegallery.com A TG CDouble Helix Modell Base pairing：l Sugar-phosphate backbone脱氧核糖和磷酸交替连接排在外侧，脱氧核糖和磷酸交替连接排在外侧，构成基本构成基本骨架骨架。碱基排在内侧，根据碱基排在内侧，根据碱基互补配对原则碱基互补配对原则通过通过氢键氢键相结合，形成碱基对。相结合，形成碱基对。Francis Crick Jmes Watson26-yr35-yrl DNA分子由分子由两条两条相互平行的脱氧核糖核相互平行的脱氧核糖核苷酸长链盘绕而成苷酸长链盘绕而成Nobel Prize in Physiology or MedicineLOGOwww.themegallery.com一一. 核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交二二. DNA芯片技术芯片技术三三. 几种特殊的几种特殊的PCR技术技术Outline LOGOwww.themegallery.com 一、一、核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization1. Southern印迹（印迹（Southern Blot）2. Northern印迹（印迹（Northern Blot ）3.点杂交（点杂交（Dot Blot ）4. 原位分子杂交（原位分子杂交（in situ hybridization）LOGOwww.themegallery.com什么是核酸分子杂交什么是核酸分子杂交（molecular hybridization） l以以DNA的变性与复性的变性与复性为理论基础为理论基础l指具有一定同源序列的两条核酸单链（指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。则经过复性处理后，形成异源双链的过程。LOGOwww.themegallery.comHigh pHLow saltHigh temperature 氢键断裂是氢键断裂是DNA的的变性变性过程过程DNA变性：变性： 氢键断裂氢键断裂 两条单链分开两条单链分开 磷酸二酯键不受影响磷酸二酯键不受影响 碱基排列顺序不变碱基排列顺序不变 LOGOwww.themegallery.com 互补单链重新形成氢键是互补单链重新形成氢键是DNA的的复性复性过程过程low pHhigh saltlow temperatureDNA的复性：的复性：单链单链DNA在溶液中随机在溶液中随机碰撞碰撞互补单链通过碱基配对互补单链通过碱基配对形成氢键形成氢键两条重新缠绕在一起的两条重新缠绕在一起的互补链不一定是原来的互补链不一定是原来的两条链两条链 LOGOwww.themegallery.com 核酸分子杂交核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两是指具有一定同源序列的两条核酸单链（条核酸单链（DNA或或RNA），在一定条件下按），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。双链的过程。 用用带有标记的带有标记的、已知序列的核酸片段已知序列的核酸片段 (单链单链RNA或或DNA)作为作为探针探针，与待测，与待测DNA或或RNA 样品进行核酸分子杂交，样品进行核酸分子杂交，来检测被测样品中来检测被测样品中是否有与探针序列同源的目标序列，以及目是否有与探针序列同源的目标序列，以及目标序列的量的一种方法。标序列的量的一种方法。LOGOwww.themegallery.com 核酸探针核酸探针l基因组基因组 DNA 探针：外显子区探针：外显子区lcDNA 探针：特异性高探针：特异性高lRNA探针：特异性高，本底低探针：特异性高，本底低l寡核苷酸寡核苷酸探针：人工合成，检测突变探针：人工合成，检测突变 类型：类型：标记物：标记物：l同位素同位素:l非同位素非同位素:3232P P， 3535S S，3 3HH 生物素、地高辛、荧光素生物素、地高辛、荧光素LOGOwww.themegallery.comDetect HybridsdenatureHybridizeAdd denatured probe DNA (labeled,complementary to the desired template), Mix2. 加入变性的探针加入变性的探针DNA1. 变性变性3. 杂交杂交4. 检测杂交体检测杂交体 LOGOwww.themegallery.com 1. Southern Blotl1975年，英国人年，英国人Edwin Mellor Southern创建创建制备待测制备待测 DNA 样品样品、标记基因探针；、标记基因探针；电泳分离待测电泳分离待测DNA样品；样品；待测待测DNA样品的变性、转膜；样品的变性、转膜；杂交；杂交；显色。显色。l将电泳分离的待测基因组将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固酶切片段转移到一定的固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程，相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程， 基本流程如下：基本流程如下： LOGOwww.themegallery.com .将内切酶消化的将内切酶消化的DNA片段进行片段进行电泳分离电泳分离DNA Isolation RE Digestion Agarose gel electrophoresis. 胶中的胶中的DNA经经变性变性及及中和中和后后, 转膜转膜Neutralize Blot：Transfer DNA onto NC membraneDNA is denatured by NaOHSouthern Blot基本操作过程基本操作过程LOGOwww.themegallery.com 转膜方法（转膜方法（1 1）（Note：All the layers are pressed tightly together）dry毛细管虹吸法毛细管虹吸法SouthernSouthern转膜示意图转膜示意图LOGOwww.themegallery.com LOGOwww.themegallery.com 转膜方法（转膜方法（2 2）电转法转膜装置示意图电转法转膜装置示意图LOGOwww.themegallery.com 标记的探针标记的探针杂交袋杂交袋将硝酸纤维素膜放入杂交袋中：将硝酸纤维素膜放入杂交袋中：l 预杂交预杂交: Pre-hybridization (Blocking)l 杂交：与标记的核酸探针共孵育杂交：与标记的核酸探针共孵育 (Hybridization) l 洗膜：洗膜：remove extra probes bound to NC membrane放射自显影后的放射自显影后的X X光底片光底片将硝酸纤维将硝酸纤维素膜与素膜与X-X-光光片曝光片曝光.检测杂交信号检测杂交信号: 放射放射自显影（或显色）自显影（或显色）. 标记的探针与标记的探针与DNA的的杂交杂交Detect the hybridization signals:the position of the annealed probe signal on the membrane.琼脂糖胶取下硝酸取下硝酸纤维素膜纤维素膜硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜LOGOwww.themegallery.com 基因的基因的定性定性分析分析Southern blot 的用途的用途 基因的基因的定量定量分析分析如确定转基因鼠体如确定转基因鼠体内外源基因的拷贝内外源基因的拷贝数。数。 1 2 3LOGOwww.themegallery.com l将电泳分离的待测将电泳分离的待测RNA从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物上，从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物上，然后与核酸探针杂交，进而定性分析然后与核酸探针杂交，进而定性分析mRNA。 2. Northern Blotl确定特定基因的组织分布情况、确定基因的表达时相。确定特定基因的组织分布情况、确定基因的表达时相。 28S28S18S18STotal RNA electrophoresis基本程序：基本程序：1 1、RNARNA的电泳的电泳2 2、转膜、转膜: : 将将RNARNA转移到固相支持物上转移到固相支持物上3 3、杂交、杂交: :膜上的膜上的RNARNA的与探针的杂交的与探针的杂交4 4、检测杂交信号、检测杂交信号LOGOwww.themegallery.com与与与与Southern Blot Southern Blot Southern Blot Southern Blot 极为相似极为相似极为相似极为相似与与与与SouthernSouthernSouthernSouthern杂交的不同杂交的不同杂交的不同杂交的不同靶核酸：靶核酸：靶核酸：靶核酸：RNARNARNARNARNARNARNARNA电泳电泳电泳电泳: : : :甲醛变性电泳甲醛变性电泳甲醛变性电泳甲醛变性电泳转膜：不需变性转膜：不需变性转膜：不需变性转膜：不需变性LOGOwww.themegallery.com lNorthern杂交的探针可杂交的探针可以是以是DNA，也可以是，也可以是RNA。lNorthern杂交可以相对杂交可以相对定量检测细胞内的特定定量检测细胞内的特定mRNA表达水平。表达水平。LOGOwww.themegallery.com 优点：简单、快速、可同时检测多个样品优点：简单、快速、可同时检测多个样品 斑点杂交：将斑点杂交：将RNARNA或或变性变性变性变性DNADNA样品点到一张硝样品点到一张硝酸纤维素膜上，并将膜按区域划分，点多个样品，酸纤维素膜上，并将膜按区域划分，点多个样品，烘烤固定，然后与特定烘烤固定，然后与特定探针探针探针探针进行杂交。进行杂交。3. Dot BlotLOGOwww.themegallery.com 4. 原位分子杂交原位分子杂交l原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）：利用分子杂交技）：利用分子杂交技术进行基因及其表达产物定位分析。术进行基因及其表达产物定位分析。l具备的条件：具备的条件：组织、细胞或染色体的固定；组织、细胞或染色体的固定；探针的制备：核苷酸序列探针的制备：核苷酸序列 + 标记物。标记物。LOGOwww.themegallery.com （1）利用原位杂交技术进行基因定位分析）利用原位杂交技术进行基因定位分析l荧光原位杂交（荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH） l基因组原位杂交（基因组原位杂交（genome in situ hybridization，GISH）检测染色体、细胞和组织原位的检测染色体、细胞和组织原位的DNA。判断特定序列是否存在或确定其在判断特定序列是否存在或确定其在染色体上位置。染色体上位置。鉴别、定位基因组鉴别、定位基因组DNA箭头所示为杂交信号箭头所示为杂交信号样本制备样本制备探针制备探针制备探针标记探针标记杂交杂交（染（染色体显带）色体显带）荧光显微镜检测荧光显微镜检测结果分析结果分析LOGOwww.themegallery.com （2）利用原位杂交技术确定特定基因的表达定位）利用原位杂交技术确定特定基因的表达定位lRNA原位杂交原位杂交 l整体原位杂交（整体原位杂交（Whole mount in situ hybridization, WISH）检测细胞、组织的原位检测细胞、组织的原位RNA检测动物胚胎和分离器官的检测动物胚胎和分离器官的RNALOGOwww.themegallery.com 一、一、 核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization分子杂交的基本原理、分子杂交的基本原理、“探针探针”。1. Southern Blot （原理，过程，用途）（原理，过程，用途）2. Northern Blot （过程，用途）（过程，用途）4. in situ hybridization（ FISH ）*Short Summary of this part：3. Dot Blot （特点）（特点）LOGOwww.themegallery.com 二、二、DNA芯片技术芯片技术DNA Chip TechnologiesLOGOwww.themegallery.com 什么是什么是DNA芯片技术芯片技术DNA芯片（芯片（DNA chip）在固相支持物上有序固化寡核苷酸或在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧探针，与待测荧光标记样品进行杂交；光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达基因序列及表达)； 亦被称作亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。大规模检测基因表达的最好方法之一大规模检测基因表达的最好方法之一LOGOwww.themegallery.com 基因芯片工作流程基因芯片工作流程LOGOwww.themegallery.com 三、三、几种特殊的几种特殊的PCR技术技术1. RT-PCR2. Real-time qPCR 3.染色质免疫沉淀染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）LOGOwww.themegallery.com 1. RT-PCR 分析基因及其产物分析基因及其产物l反转录反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将是将RNA的反转录反应和的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。反应联合应用的一种技术。LOGOwww.themegallery.coml反转录反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将是将RNA的反转录反应和的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。反应联合应用的一种技术。 mRNAReverse TranscriptionPCROligo dTAMV DNA Pol1. RT-PCR 分析基因及其产物分析基因及其产物LOGOwww.themegallery.com l反转录反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将是将RNA的反转录反应和的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。反应联合应用的一种技术。lRT-PCR是目前从组织或细胞中，获得目的基因以及对已知是目前从组织或细胞中，获得目的基因以及对已知序列的序列的RNA进行进行定性定性定性定性及及半定量半定量半定量半定量分析的最有效方法。分析的最有效方法。l广泛应用于基因表达检测和分子诊断。广泛应用于基因表达检测和分子诊断。1. RT-PCR 分析基因及其产物分析基因及其产物LOGOwww.themegallery.com 看家基因看家基因的转录产物作为的转录产物作为内掺照内掺照内掺照内掺照以证明各组间作为以证明各组间作为模板的总模板的总RNA的用量一致，例如：的用量一致，例如：actin。Actin 内掺内掺RT-PCR每个基因的引物设每个基因的引物设计：最好是外显子计：最好是外显子中间含有内含子！中间含有内含子！LOGOwww.themegallery.com 2. Real-time qPCR PCR技术可进行实时定量分析技术可进行实时定量分析l实时定量实时定量PCR技术（技术（real-time quantitative polymerase chain reaction, real-time qPCR）是目前确定样品中）是目前确定样品中DNA（或（或cDNA）拷贝数最敏感、最准确的方法。拷贝数最敏感、最准确的方法。常规常规PCR技术技术：对：对PCR扩增反应的扩增反应的终产物终产物进行定性及半定量分析进行定性及半定量分析实时实时PCR技术技术： 通过对通过对PCR反应中反应中每一个循环产物每一个循环产物荧光荧光信号的信号的实时实时检测检测，从而实现对从而实现对起始模板起始模板（DNA/cDNA)浓度的浓度的定量定量分析。分析。LOGOwww.themegallery.com 探针探针TaqMan:水解型杂交探针水解型杂交探针与目标序列互补与目标序列互补5 Reporter 3 Quencher探针的探针的5端是报告荧光基团（端是报告荧光基团（R Reportereporter) , 3端是荧光素淬灭基团（端是荧光素淬灭基团（QQuencheruencher）。）。荧光基团、淬灭基团距离较近：无荧光信号！荧光基团、淬灭基团距离较近：无荧光信号！LOGOwww.themegallery.com LOGOwww.themegallery.com SYBR Green实时定量实时定量PCR原理示意图原理示意图 LOGOwww.themegallery.com Threshold line C(t) value CtCt值：样品的荧光信号达到设定荧光域值时所经历的循环数值：样品的荧光信号达到设定荧光域值时所经历的循环数荧光域值（荧光域值（Threshold)：在在PCR曲线上人为设定的曲线上人为设定的一个荧光强度值一个荧光强度值(T值值)初始模板量越多初始模板量越多, Ct, Ct值越小。值越小。每个模板的每个模板的CtCt值与该模板的起始浓度的对数存在线性关系。值与该模板的起始浓度的对数存在线性关系。LOGOwww.themegallery.com 标准曲线：标准曲线：CtCt值与起始浓度的对数成线性关系值与起始浓度的对数成线性关系由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线，由此计算待测样由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线，由此计算待测样品的初始模板浓度。品的初始模板浓度。LOGOwww.themegallery.com 利用标准样品作出标准曲线利用标准样品作出标准曲线, ,通通过未知样品的过未知样品的CtCt值值, ,从标准曲线上从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。计算出该样品的起始浓度。 荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-循环数曲线循环数曲线.未知未知10410310610510210定量原理：定量原理：LOGOwww.themegallery.com53RT-PCR35探针标记探针标记 RReporter QQuencher RQ5335加热变性引物、探针与单链模板退火形成双链3Exponential growthCycles of real time PCR0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 加热变性为PCR提供单链模板RQ探针PCR引物Taq DNA pol.535RQRQ55primerprimer5335QQ55primerprimerRR退火延伸DNA聚合酶以引物3端延伸时遇到预先结合到模板上的探针时，以其53外切酶活性切割探针，从而释放荧光染料PCR产物分析以荧光信号的强度绘制PCR产物的产量曲线5-3以末端标记法标记核酸探针5-35335QQ55primerprimerRRcDNAmRNA逆转录oligo探针LOGOwww.themegallery.com 实时定量实时定量PCR的特点的特点1、精确定量模板、精确定量模板DNA/RNA。2、灵敏度强、特异性高。、灵敏度强、特异性高。3、不需要取出、不需要取出PCR产物进行电泳分析，减少了污产物进行电泳分析，减少了污染的机会。染的机会。4、 实时、准确。实时、准确。5、自动化程度高。、自动化程度高。LOGOwww.themegallery.com 3. ChIP PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的合的DNA序列序列l染色质免疫沉淀（染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）PCR + IP，研究体内，研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。与蛋白质相互作用的方法。真实、完整地反应结合在真实、完整地反应结合在DNA序列上的调控蛋白。序列上的调控蛋白。目前确定与特定蛋白质结目前确定与特定蛋白质结合的基因组区域或确定与合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。白质的最好方法。LOGOwww.themegallery.com 三、几种特殊的三、几种特殊的PCR技术技术3. ChIP PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的DNA序列序列2. Real-time qPCR PCR技术可进行实时定量分析技术可进行实时定量分析1. RT-PCR PCR技术分析基因及其产物技术分析基因及其产物Short Summary of this part：LOGO