病理解剖技术Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望序：病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮，病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮，缺一不可，互为依存，互相促进，两者的结合决缺一不可，互为依存，互相促进，两者的结合决定病理学的发展。定病理学的发展。病理学的技术主要体现在几个结合上病理学的技术主要体现在几个结合上1.传统病理学技术与现代生物新技术相结合传统病理学技术与现代生物新技术相结合2.宏观、脏器、组织、细胞、超微与分子基因不同层次技术宏观、脏器、组织、细胞、超微与分子基因不同层次技术相结合相结合3.形态、机能与代谢变化相结合形态、机能与代谢变化相结合4.定性、定位与定量观测相结合定性、定位与定量观测相结合5.实验研究技术与临床应用技术相结合实验研究技术与临床应用技术相结合6.技术的基本原理与具体方法相结合技术的基本原理与具体方法相结合7.基本技术知识与作者实践经验相结合基本技术知识与作者实践经验相结合病理学的发展与使用的工具病理学的发展与使用的工具和方法的更新密切相关和方法的更新密切相关1.用解剖刀剪等进行尸体检查，开展了器官病理学用解剖刀剪等进行尸体检查，开展了器官病理学2.显微镜发明百年之后，建立了细胞病理学显微镜发明百年之后，建立了细胞病理学3.电子显微镜的问世，发展了超微病理学电子显微镜的问世，发展了超微病理学4.免疫组织化学促进了免疫病理学的发展免疫组织化学促进了免疫病理学的发展5.分子生物学带动了分子病理学的兴起分子生物学带动了分子病理学的兴起6.计算机及其网络的应用，将病理学走向信息病理学时代计算机及其网络的应用，将病理学走向信息病理学时代传统病理学技术：传统病理学技术：传统的传统的Formalin固定，石蜡切片和固定，石蜡切片和HE染色技染色技术仍是病理学的基本技术，大量应用与基础和临术仍是病理学的基本技术，大量应用与基础和临床病理学日常工作中，保证和提高常规质量和现床病理学日常工作中，保证和提高常规质量和现代设备水平十分重要。代设备水平十分重要。第一章：病理解剖技术第一章：病理解剖技术一、病理解剖的意义一、病理解剖的意义病理解剖技术是病理学的基础之一，是病理学不可病理解剖技术是病理学的基础之一，是病理学不可分割的一部分。分割的一部分。通过病理解剖收集病理教学及科研资料是其中一个通过病理解剖收集病理教学及科研资料是其中一个途径，大量病理资料的积累促进了医学的发展与进步。途径，大量病理资料的积累促进了医学的发展与进步。病理解剖是通过解剖尸体观察和发现死者器官、组病理解剖是通过解剖尸体观察和发现死者器官、组织的病理变化，找出主要病变，分析判断直接死亡的一织的病理变化，找出主要病变，分析判断直接死亡的一个重要方法。个重要方法。二、病理解剖室的设备和器械二、病理解剖室的设备和器械1.设备：设备：1解剖室的设计要求解剖室的设计要求最好位于太平间；最好位于太平间；室内面积要大，必须有两个门；室内面积要大，必须有两个门；地面用水磨石，四周有排水沟或地漏；地面用水磨石，四周有排水沟或地漏；室内通风好；室内通风好；有消毒室，男女更衣室，浴室等。有消毒室，男女更衣室，浴室等。2解剖台的设计解剖台的设计高低和大小要合适高低和大小要合适台面可用水磨石或不锈钢台面可用水磨石或不锈钢有条件可购置能够升降的解剖台有条件可购置能够升降的解剖台解剖台可带有抽气的功能等解剖台可带有抽气的功能等水磨石台面的解剖台水磨石台面的解剖台水磨石台面的解剖台水磨石台面的解剖台不锈钢台面的解剖台不锈钢台面的解剖台病理解剖器械2.器械：3.清洁、消毒和个人保护清洁、消毒和个人保护1病理解剖室的清洁和消毒病理解剖室的清洁和消毒2病理解剖器械的清洁和消毒病理解剖器械的清洁和消毒3个人保护等个人保护等三、病理解剖的方法和步骤三、病理解剖的方法和步骤1.病理解剖前的准备病理解剖前的准备主要办理一切手续，非常重要。主要办理一切手续，非常重要。2.体表检查体表检查体表检查体表检查尸斑，尸僵尸斑，尸僵3.胸腹腔检查胸腹腔检查1切口切口2腹腔检查腹腔检查3胸腔检查胸腔检查腹腔有渗出液腹腔有渗出液心包积液（血液气管周围血液液体称量4.内脏器官的取出及检查内脏器官的取出及检查一般有两种方法：一般有两种方法：1各脏器分别取出法各脏器分别取出法是病理解剖最常用的方法是病理解剖最常用的方法2多脏器联合取出法多脏器联合取出法此法比较简单，可保持各器官的完整性。此法比较简单，可保持各器官的完整性。心脏表面充血绒毛心双肺和支气管肝脏表面有结节胰腺，出血改变肠管，出血脑脑干出血第二章第二章病理大体标本的制作病理大体标本的制作一、大体标本的收集、取材、固定和保存一、大体标本的收集、取材、固定和保存1.大体标本的收集大体标本的收集通过尸体解剖和活体组织（包括外科手术切通过尸体解剖和活体组织（包括外科手术切除标本和活体组织穿刺标本除标本和活体组织穿刺标本检查时发现并收检查时发现并收集。集。2.大体标本的取材大体标本的取材取材室条件：取材室条件：通风要好，必须有排风通风要好，必须有排风设备；设备；固定的组织取材前要用固定的组织取材前要用流水充分冲洗；流水充分冲洗；排水要远离住宅区等排水要远离住宅区等不同器官的取材和固定不同：不同器官的取材和固定不同：1实质性的器官：如肝、脾等实质性的器官：如肝、脾等要注意，实质器官不容易被固定液所穿透。要注意，实质器官不容易被固定液所穿透。肝癌肝癌肝癌肝癌肝癌肝癌肝癌2空腔器官：如胃、肠等空腔器官：如胃、肠等取材时要看全层，保持粘膜、肌层和浆膜全取材时要看全层，保持粘膜、肌层和浆膜全层的组织。层的组织。胃癌，呈菜花状胃癌，呈菜花状切面的形状切面的形状胃癌，溃疡型胃癌，溃疡型切面的形状切面的形状切面的形状，切面的形状，浸润性至浆膜浸润性至浆膜溃疡型胃癌溃疡型胃癌溃疡型胃癌溃疡型胃癌切面的形状，浸润切面的形状，浸润性至浆膜性至浆膜3肺肺肺组织比较疏松，固定液容易渗透。肺组织比较疏松，固定液容易渗透。肺组织的取材要清楚的了解各叶肺组织所伴随肺组织的取材要清楚的了解各叶肺组织所伴随的支气管。的支气管。A：主支气管B：叶支气管肺肺和和气气管管周周围围的的淋淋巴巴结结肺癌肺癌肺门型肺门型肺癌肺癌肺门与周肺门与周围之间围之间肺癌肺癌周围型周围型肺癌肺癌空洞型空洞型4）其它类型外科手术标本常见：乳腺癌子宫颈癌肠癌卵巢肿瘤等乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌子宫颈癌子宫颈癌子宫颈癌子宫颈癌子宫颈癌，切面3.大体标本的固定大体标本的固定1固定的目的：固定的目的：将受检组织尽快地侵入固定液内，使组织和细胞将受检组织尽快地侵入固定液内，使组织和细胞的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐败，使其保持与的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐败，使其保持与生活状态有相似的结构，以利于切片和观察。生活状态有相似的结构，以利于切片和观察。2固定液的选择：固定液的选择：A.甲醛（甲醛（Fomaldehyde，又称福尔马林，其浓度在，又称福尔马林，其浓度在4，它是一种还原剂，极易挥发，散发出强烈的刺，它是一种还原剂，极易挥发，散发出强烈的刺激性气体，使人流鼻涕、流眼泪，呼吸道有异物感。激性气体，使人流鼻涕、流眼泪，呼吸道有异物感。B.95酒精（乙醇酒精（乙醇，除具有固定组织的作用外，尚，除具有固定组织的作用外，尚有脱水作用。有脱水作用。3固定液的特性固定液的特性甲醛固定液渗透力强，固定均匀，对组织收甲醛固定液渗透力强，固定均匀，对组织收缩较小，并能增加组织韧性的优点，而且可以保缩较小，并能增加组织韧性的优点，而且可以保存组织内的脂类物质，对组织的主要作用为硬化存组织内的脂类物质，对组织的主要作用为硬化和防腐。和防腐。酒精可以保存组织内的糖类物质及尿酸结晶，酒精可以保存组织内的糖类物质及尿酸结晶，不过，它常使组织明显收缩，且使脂类物质溶解。不过，它常使组织明显收缩，且使脂类物质溶解。4.大体标本的脱水、包埋和切片大体标本的脱水、包埋和切片为能制成满意的切片，固定后的组织还要经过为能制成满意的切片，固定后的组织还要经过脱水、透明、浸蜡及包埋等一系列程序。脱水、透明、浸蜡及包埋等一系列程序。1脱水：目的是将固定了的组织内水分除去。以脱水：目的是将固定了的组织内水分除去。以便使切片时的支撑物（石蜡便使切片时的支撑物（石蜡充分进入组织内。常充分进入组织内。常用的是酒精。用的是酒精。2透明：目的是使能与石蜡结合溶解的媒介剂进透明：目的是使能与石蜡结合溶解的媒介剂进入组织，进而将不能与石蜡结合的脱水剂置换出来，入组织，进而将不能与石蜡结合的脱水剂置换出来，并使组织透明。常用的是二甲苯。并使组织透明。常用的是二甲苯。3浸透和包埋：可使组织具有一定的硬度和韧度，浸透和包埋：可使组织具有一定的硬度和韧度，便于切成薄的切片。常用的石蜡溶点为便于切成薄的切片。常用的石蜡溶点为6062，有时为保存更多的抗原成分。可采用低溶点石蜡有时为保存更多的抗原成分。可采用低溶点石蜡（4850。4切片切片切片机类型：切片机类型：旋转式切片机旋转式切片机滑动式切片机滑动式切片机旋转式切片机旋转式切片机5.HE（HematoxinEosin,HE染色染色1苏木素染色配方：苏木素染色配方：苏木素苏木素1g纯酒精纯酒精10ml钾明矾钾明矾20g蒸馏水蒸馏水200ml氯化汞氯化汞0.5g2伊红染色配方：伊红染色配方：伊红伊红0.5-1g蒸馏水蒸馏水99mlHE染色法：染色法：1苏木素染色苏木素染色57分钟；分钟；2自来水冲洗多余的染液；自来水冲洗多余的染液；31盐酸酒精分化数秒钟，使细胞核呈紫蓝色盐酸酒精分化数秒钟，使细胞核呈紫蓝色4自来水中充分洗涤；自来水中充分洗涤；51氨水中数秒，至返蓝；氨水中数秒，至返蓝；6自来水中至蒸馏水冲洗；自来水中至蒸馏水冲洗；71的伊红染色，的伊红染色，3分钟左右；分钟左右；结果：细胞核呈紫蓝色，细胞浆呈粉红色，基结果：细胞核呈紫蓝色，细胞浆呈粉红色，基底膜，胶原纤维及肌纤维呈粉红色。底膜，胶原纤维及肌纤维呈粉红色。HE切片切片第三章第三章特殊染色特殊染色HE染色虽是一种快速、经济、且易掌握的染色虽是一种快速、经济、且易掌握的方法，但它不能回答病因学、方法，但它不能回答病因学、Z组织发生及发病组织发生及发病机制等方面的许多问题。而特殊染色可以协助机制等方面的许多问题。而特殊染色可以协助解决病理诊断问题。解决病理诊断问题。目前市场上有配制好的特殊染色试剂目前市场上有配制好的特殊染色试剂介绍常用的几种特殊染色介绍常用的几种特殊染色1.脂肪染色脂肪染色主要用于心、肝、肾的脂肪变性，动脉粥样硬化，主要用于心、肝、肾的脂肪变性，动脉粥样硬化，以及因脂肪栓塞导致的死亡病例鉴定等。以及因脂肪栓塞导致的死亡病例鉴定等。1试剂配制：苏丹染液试剂配制：苏丹染液苏丹苏丹III或苏丹或苏丹IV0.5g，70%乙醇乙醇250ml，丙酮，丙酮250ml。2染色方法：染色方法：（1标本常规甲醛固定后流水冲洗标本常规甲醛固定后流水冲洗12h；（2用滤纸吸干标本表面的水分，把标本放入苏丹用滤纸吸干标本表面的水分，把标本放入苏丹III染液中染液中浸泡浸泡30min；（3用用70乙醇分化，以脂肪组织呈橙黄色，其它组织不着色乙醇分化，以脂肪组织呈橙黄色，其它组织不着色为佳；为佳；（4水洗后浸存在水洗后浸存在5甲醛液中，为了防腐可加入适量的防腐甲醛液中，为了防腐可加入适量的防腐剂。剂。肝脂肪变苏丹III染色2.过碘酸过碘酸(periodicacid)-schiff染色，即染色，即PAS染色染色此技术主要显示糖原（在淀粉酶消化对照下此技术主要显示糖原（在淀粉酶消化对照下、中性粘液物质、基底膜、霉菌和寄生虫等。中性粘液物质、基底膜、霉菌和寄生虫等。1schiff氏试剂的配方：氏试剂的配方：（1将将200ml蒸馏水煮沸；蒸馏水煮沸；（2冷却至冷却至90时，慢慢加入碱性复红时，慢慢加入碱性复红1g;（3搅拌并煮沸搅拌并煮沸5分钟使其全溶；分钟使其全溶；（4冷却至冷却至50时过滤，并加入时过滤，并加入1N盐酸盐酸20ml；（5冷却至冷却至25时，再加入无水亚硝酸钠时，再加入无水亚硝酸钠1g并搅拌匀。并搅拌匀。（6置入遮光瓶内并放入在置入遮光瓶内并放入在4冰箱内保存备用。冰箱内保存备用。2PAS染色方法：染色方法：（11过碘酸水溶液染过碘酸水溶液染10分钟，使含有乙二醇的化合物氧分钟，使含有乙二醇的化合物氧化形成醛基；化形成醛基；（2蒸馏水洗去过碘酸；蒸馏水洗去过碘酸；（3schiff氏试剂反应氏试剂反应15分钟，使醛基和分钟，使醛基和schiff氏试剂结合，氏试剂结合，形成紫红色产物；形成紫红色产物；（40.5%亚硝酸钠亚硝酸钠(NaHSO3)处理三次，每次处理三次，每次2分钟；分钟；（5流水冲洗流水冲洗510分钟；分钟；（6用苏木素染色液复染细胞核；用苏木素染色液复染细胞核；7水洗或水洗或1盐酸酒精分化。盐酸酒精分化。3结果：结果：细胞核呈蓝色，基底膜呈红色，胶原纤维、肌纤细胞核呈蓝色，基底膜呈红色，胶原纤维、肌纤维及细胞浆呈红色。维及细胞浆呈红色。过碘酸Schiff反应：糖元及其他PAS反应阳性物质呈红色，细胞核呈蓝色PAS念珠菌（念珠菌（PAS染色）染色）附：附：AB/PAS法（阿尔辛蓝过碘酸雪夫染色法法（阿尔辛蓝过碘酸雪夫染色法结果：中性粘液物质呈红色，酸性粘液物质呈蓝结果：中性粘液物质呈红色，酸性粘液物质呈蓝色，中性和酸性粘液的混合物质呈紫色。色，中性和酸性粘液的混合物质呈紫色。阿尔辛蓝阿尔辛黄法：常用于黏液上皮肿瘤的鉴别诊断阿尔辛蓝阿尔辛黄法：常用于黏液上皮肿瘤的鉴别诊断阿尔辛蓝过碘酸雪夫反应：是显示中性和酸性黏液物质的有效方法阿尔辛蓝过碘酸雪夫反应：是显示中性和酸性黏液物质的有效方法HID/AB:高铁二胺奥新蓝法高铁二胺奥新蓝法AB/PAS3.六胺银（六胺银（PASM染色染色在肾脏活体组织检查和一些真菌感染的组织在肾脏活体组织检查和一些真菌感染的组织选用此方法。选用此方法。1PASM染液的配方：染液的配方：2硝酸银水溶液硝酸银水溶液3ml；3六次甲基四胺液六次甲基四胺液25ml；5硼砂硼砂2ml。注：注：2硝酸银配制胺溶液，染色时间硝酸银配制胺溶液，染色时间40分钟，温度分钟，温度5560，随时镜下观察便于控制。，随时镜下观察便于控制。2PASM染色法染色法：（11过碘酸水溶液内染过碘酸水溶液内染10分钟；分钟；（2自来水冲洗，蒸馏水冲洗；自来水冲洗，蒸馏水冲洗；（3入入5铬酸水溶液铬酸水溶液40分钟，出此溶液后用分钟，出此溶液后用1亚硫酸钠除亚硫酸钠除掉铬酸；掉铬酸；（4自来水洗数次，蒸馏水洗自来水洗数次，蒸馏水洗34次；次；（5入六胺银染液（入六胺银染液（506040分钟，分钟，20分钟后，每分钟后，每5分钟分钟镜下观察一次，蒸馏水洗四次；镜下观察一次，蒸馏水洗四次；（6入入0.2%氯化金水溶液氯化金水溶液12分钟，蒸馏水洗三次；分钟，蒸馏水洗三次；（7入入5硫代硫酸钠水溶液硫代硫酸钠水溶液12分钟，蒸馏水洗数次；分钟，蒸馏水洗数次；（8复染复染HE，脱水、透明、封片，脱水、透明、封片结果：结果：底膜呈黑色，网状纤维呈黑色，细胞核呈蓝色，底膜呈黑色，网状纤维呈黑色，细胞核呈蓝色，背景呈粉红色。背景呈粉红色。PASM染色染色PASM染色染色PASMPASM附：附：PASM对真菌的染色对真菌的染色真菌（真菌（fungus，又称霉菌，其种类较多。，又称霉菌，其种类较多。真菌的基本结构成分是含有较多的粘多糖和蛋白质。真菌的基本结构成分是含有较多的粘多糖和蛋白质。1试剂的配制：试剂的配制：（1六次甲基四胺、硝酸银原液（简称六胺银原液六次甲基四胺、硝酸银原液（简称六胺银原液。3六六次甲基四胺水溶液次甲基四胺水溶液100ml，5硝酸银水溶液硝酸银水溶液5ml；（2六胺银硼砂染色液。六胺银原液六胺银硼砂染色液。六胺银原液25ml，蒸馏水，蒸馏水25ml，5硼砂水溶液硼砂水溶液2ml；（3核固红染液。核固红核固红染液。核固红0.1g，硫酸铝，硫酸铝5g，蒸馏水，蒸馏水100ml；（4亮绿染色液。亮绿亮绿染色液。亮绿0.2g，蒸馏水，蒸馏水100ml，冰醋酸，冰醋酸0.2ml。2染色步骤：染色步骤：（15铬酸水溶液氧化铬酸水溶液氧化1小时，流水洗小时，流水洗2分钟，蒸馏水洗分钟，蒸馏水洗2次；次；（2浸入浸入1亚硫酸钠水溶液除掉铬酸亚硫酸钠水溶液除掉铬酸1分钟，流水洗分钟，流水洗5分钟，分钟，蒸馏水洗蒸馏水洗3次；次；（3浸入六胺银硼砂液染色浸入六胺银硼砂液染色11.5小时（小时（4050温箱内温箱内，至切片呈浅棕色，蒸馏水至切片呈浅棕色，蒸馏水3次；次；（4用用0.2%氯化金水溶液调色氯化金水溶液调色3分钟，蒸馏水稍洗；分钟，蒸馏水稍洗；（5核固红染色细胞核核固红染色细胞核10分钟，流水洗，蒸馏水洗；分钟，流水洗，蒸馏水洗；（6亮绿染色液亮绿染色液30秒，用蒸馏水快速稍洗；秒，用蒸馏水快速稍洗；（7无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：结果：真菌均呈黑色，菌丝和孢子呈黑褐色，细胞核真菌均呈黑色，菌丝和孢子呈黑褐色，细胞核呈红色，背景呈淡绿色。呈红色，背景呈淡绿色。念珠菌（假菌丝）念珠菌（假菌丝）新生隐球菌性脑膜炎新生隐球菌性脑膜炎4.淀粉样物质染色（介绍刚果红染色）淀粉样物质染色（介绍刚果红染色）淀粉样物质是一种嗜伊红性物质，性质属于糖蛋淀粉样物质是一种嗜伊红性物质，性质属于糖蛋白成分。组织出现此物质称为淀粉样变性。白成分。组织出现此物质称为淀粉样变性。1试剂配制：试剂配制：（1刚果红染色液。刚果红刚果红染色液。刚果红1g，蒸馏水，蒸馏水100ml；（2Harris苏木素染色液。苏木素染色液。2染色步骤：染色步骤：（1苏木素染色液浸染苏木素染色液浸染2分钟；分钟；（20.5%盐酸乙醇分化数秒钟；盐酸乙醇分化数秒钟；（3流水洗，蒸馏水洗流水洗，蒸馏水洗2次；次；（4刚果红染色液中刚果红染色液中25分钟；分钟；（5无水乙醇迅速脱水无水乙醇迅速脱水2次；次；（6二甲苯透明，中性树胶封固。二甲苯透明，中性树胶封固。结果：结果：淀粉样物质呈红色，细胞核呈蓝色。淀粉样物质呈红色，细胞核呈蓝色。刚果红染色刚果红染色5.Mallory三色染色法（属于结缔组织复合染色法三色染色法（属于结缔组织复合染色法1试剂配制：试剂配制：（1重铬酸钾液。重铬酸钾重铬酸钾液。重铬酸钾2.5g，醋酸，醋酸5ml，蒸馏水，蒸馏水95ml；（2苯胺蓝橘黄苯胺蓝橘黄G液。苯胺蓝液。苯胺蓝0.5g，橘黄，橘黄2g，磷钨酸，磷钨酸1g，蒸馏水蒸馏水100ml；（3酸性复红液。酸性复红酸性复红液。酸性复红0.5g，蒸馏水，蒸馏水100ml。2染色步骤：染色步骤：（1重铬酸钾液重铬酸钾液10分钟；分钟；（2流水洗流水洗2分钟，蒸馏水洗分钟，蒸馏水洗2次；次；（3酸性复红液酸性复红液2分钟，蒸馏水稍洗；分钟，蒸馏水稍洗；（4苯胺蓝液苯胺蓝液20分钟，分钟，95乙醇快速分化；乙醇快速分化；（5直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：结果：胶原和网状纤维呈蓝色，软骨、粘液、淀粉胶原和网状纤维呈蓝色，软骨、粘液、淀粉样变性物质呈淡蓝色，神经胶质纤维、肌纤维和酸样变性物质呈淡蓝色，神经胶质纤维、肌纤维和酸性颗粒呈红色，髓鞘和红细胞呈橘红色。性颗粒呈红色，髓鞘和红细胞呈橘红色。特点：利用酸性复红、苯胺蓝、橘黄特点：利用酸性复红、苯胺蓝、橘黄G这三种染料对结缔组织和这三种染料对结缔组织和非结缔组织进行着色。非结缔组织进行着色。Mallory6.Masson三色染色法三色染色法1试剂配制试剂配制（1Masson复合染色液。碱性复红复合染色液。碱性复红1g，丽春红，丽春红2g，橘黄，橘黄G2g，0.25%醋酸醋酸300ml；（2）亮绿染色液。亮绿）亮绿染色液。亮绿SF0.1g，0.2%醋酸醋酸100ml。2染色步骤染色步骤（1Masson复合染色液复合染色液5分钟；分钟；（20.2%醋酸水溶液稍洗；醋酸水溶液稍洗；（35磷钨酸磷钨酸510分钟；分钟；（40.2%醋酸水溶液浸洗醋酸水溶液浸洗2次；次；（5亮绿染色液亮绿染色液5分钟；分钟；（60.2%醋酸水洗醋酸水洗2次；次；（7无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：结果：细胞核呈红色，基底膜、胶原纤维呈蓝绿细胞核呈红色，基底膜、胶原纤维呈蓝绿色，免疫复合物呈红色。色，免疫复合物呈红色。适用于脑垂体、上皮、甲状腺、神经的正常和肿瘤组织适用于脑垂体、上皮、甲状腺、神经的正常和肿瘤组织Masson肾小球肾小球左：左：HE染色染色右：右：Masson染色，胶原组织呈蓝色，弹力纤维棕色，肌纤维、染色，胶原组织呈蓝色，弹力纤维棕色，肌纤维、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈黑蓝色。纤维素、红细胞呈红色，胞核呈黑蓝色。7.弹力纤维染色法弹力纤维染色法病理诊断应用弹力纤维染色，目的是观察组织内弹力病理诊断应用弹力纤维染色，目的是观察组织内弹力纤维是否增生或破坏、断裂和崩解，从而帮助诊断。纤维是否增生或破坏、断裂和崩解，从而帮助诊断。试剂配制：试剂配制：地衣红酒精液地衣红酒精液1g70%酒精酒精100ml浓盐酸浓盐酸1ml结果：结果：Taner-Unna法，弹力纤维呈深棕红色。法，弹力纤维呈深棕红色。Verhoeff铁苏木素染色法，弹力纤维呈黑色。铁苏木素染色法，弹力纤维呈黑色。Verhoeff铁苏木素染色法：弹力纤维黑色或黑蓝色，胞核黑色，胶原纤维呈红色Verhoeff铁苏木铁苏木素染色素染色法法Lendrum纤维纤维素染色法素染色法显示肾小球毛显示肾小球毛细血管腔内血细血管腔内血栓形成栓形成第四章：第四章：免疫组织化学（免疫组织化学（Immunohistochemistry）一定义：一定义：应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位、或定量研本中的某些化学成分进行原位的定性、定位、或定量研究，这种技术称免疫组织化学究，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistry）或免疫细胞化学或免疫细胞化学（immunocytochemistry），简称免疫组化。免疫组化），简称免疫组化。免疫组化技术是技术是1941年年Coons等学者首创的，随着其理论及技术等学者首创的，随着其理论及技术的发展，目前已发生了日新月异的变化。的发展，目前已发生了日新月异的变化。1免疫组化的方法：免疫组化的方法：1）直接法）直接法2）间接法：）间接法：SPA、PAP、ABC、LAB法等，间接法法等，间接法的灵敏度高于直接法。的灵敏度高于直接法。2标记的物质：荧光染料、放射性同位素，酶（辣根过氧标记的物质：荧光染料、放射性同位素，酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）铁蛋白、胶体金等。化物酶、碱性磷酸酶等）铁蛋白、胶体金等。3根据标记物区分：免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和根据标记物区分：免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法。其中免疫荧光法和酶标法应用免疫金银法。其中免疫荧光法和酶标法应用广泛。广泛。反差二免疫组化的基本知识二免疫组化的基本知识1原理原理：抗体与抗原间的结合具有高度的特异性，免疫纽织：抗体与抗原间的结合具有高度的特异性，免疫纽织化学正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某种化学物质化学正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性抗提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。由于抗原与体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。由于抗原与抗体结合后形成的免疫复合物是无色的，因此还必须借助于组抗体结合后形成的免疫复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来，以期达到对组化或织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来，以期达到对组化或细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。组织或细细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、氨基酸、多糖、胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等，都可以用相应的特磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等，都可以用相应的特异性抗体进行检测。异性抗体进行检测。2.抗原性的保存：上述谈到的抗原或半抗原物质，防止在组抗原性的保存：上述谈到的抗原或半抗原物质，防止在组织或细胞内丢失是非常重要的。在组织处理过程中，如固定、织或细胞内丢失是非常重要的。在组织处理过程中，如固定、包埋、薄切、反应，必须保持其抗原性，特别是选择的固定包埋、薄切、反应，必须保持其抗原性，特别是选择的固定液及包埋方法要十分注意。液及包埋方法要十分注意。3.抗体：抗体是机体受抗原刺激后，由抗体：抗体是机体受抗原刺激后，由B淋巴细胞、特别是淋巴细胞、特别是浆细胞分泌产生的一种与相应抗原发生反应的一种球蛋白，浆细胞分泌产生的一种与相应抗原发生反应的一种球蛋白，即免疫球蛋白（即免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig)，共有五类：，共有五类：IgG,IgA,IgM,IgD,和和IgE，主要分布在血清或外分泌物中，以，主要分布在血清或外分泌物中，以IgG为为主，约占主，约占7080。1抗体的制备方法：抗体的制备方法：A多克隆抗体多克隆抗体（血清抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被动：指机体接受抗原主动免疫或被动免疫后从血清中分离提纯的抗体。免疫后从血清中分离提纯的抗体。B单克隆抗体单克隆抗体：是：是1975年由年由KohlenhMilstein发明的一种新技发明的一种新技术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆抗体（抗体（monoclonalantibody,McAb)2)单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较特性特性多克隆多克隆单克隆单克隆组成组成多种类抗体的混合物多种类抗体的混合物单一种类的抗体单一种类的抗体特异性特异性低针对多个抗原决定族低针对多个抗原决定族高针对单一的抗原决定族高针对单一的抗原决定族亲和力亲和力平均亲和力较高平均亲和力较高不定，较低不定，较低交叉反应交叉反应高高低低4抗原与抗体的特异性结合抗原与抗体的特异性结合抗原与抗体的结合具有高度的特异性。在抗体的轻链和重抗原与抗体的结合具有高度的特异性。在抗体的轻链和重链的可变区中有链的可变区中有3个特殊的易变部位，即在第个特殊的易变部位，即在第30位、位、50一一60位和位和第第100位氨基酸残基附近，这些部位称为超变区。超变区直接参位氨基酸残基附近，这些部位称为超变区。超变区直接参与抗原接合部位的组成，形成的接合部位是一个浅平穴槽，槽与抗原接合部位的组成，形成的接合部位是一个浅平穴槽，槽大小约大小约I.5nm0.6nm0.6nm抗原决定族在空间呈互补性地嵌入抗原决定族在空间呈互补性地嵌入槽内，借分子间的范德华力、疏水作用静电引力以及氢键而相槽内，借分子间的范德华力、疏水作用静电引力以及氢键而相互结合。抗原与抗体分子的结合不受两者数量比例的限制，但互结合。抗原与抗体分子的结合不受两者数量比例的限制，但如要出现肉眼可见的反应，如要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需有一定的适当则抗原与抗体的量需有一定的适当的比例，否则在抗原与抗体过量的情况下，不能聚合成大颗粒，的比例，否则在抗原与抗体过量的情况下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。因此不能出现肉眼可见的反应。三免疫组织化学的基本技术（一取材1实验动物：麻醉（处死，锋利刀片切成大小适中，厚度3mm4mm;小型实验动物：灌注（流）固定（生理盐水和4多聚甲醛取材2人体材料：活检组织、手术标本、细胞和组织（二二）固固定定：原原则则是是保保持持组组织织形形态态良良好好和和被被检检测测抗抗原原的的前前提提下下，应应采采用用浓浓度度最最低低的的固固定定剂剂和和最最短短的的固固定定时时间间，固固定定时时间间一一般般为为112h。1常用的固定剂：常用的固定剂：1）甲甲醛醛缓缓冲冲液液：广广泛泛应应用用于于病病理理标标本本的的固固定定，甲甲醛醛在在很很好好地地保保护护组组织织形形态态结结构构完完整整的的同同时时也也有有效效地地保保存存某某些些抗抗原原。由由于于甲甲醛醛的的交交联联作作用用会会影影响响被被固固定定细细胞胞膜膜的的通通透透性性不不利利于于染染色色时时抗抗体体的的渗渗透透，因因此此染染色色前前常常用用酶酶进进行行消消化化以以使使抗抗原原决决定定簇簇充充分分暴暴露露，固定时间不直超过固定时间不直超过24h。2）4多聚甲醛磷酸缓冲液：广泛应用于光镜细胞化学研究。多聚甲醛磷酸缓冲液：广泛应用于光镜细胞化学研究。3）戊戊二二醛醛多多聚聚甲甲醛醛缓缓冲冲液液：适适用用于于光光镜镜、电电镜镜免免疫疫组组织织化化学学研究。研究。4）其其它它：如如PLP液液（过过碘碘酸酸赖赖AA多多聚聚甲甲醛醛固固定定液液）、丙丙酮酮及醇类、锇酸等。及醇类、锇酸等。2固定注意事项：固定注意事项：1）固定液的选择标准：）固定液的选择标准：A.组织形态结构保存良好；组织形态结构保存良好；B.最大限度最大限度保存抗保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是应用最广的固定剂。原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是应用最广的固定剂。2）组织块的大小：）组织块的大小：1.5cm1.5cm0.5cm为宜。为宜。3）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。反比。4）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时可放置在可放置在4冰箱。冰箱。5固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。（三）包埋：（三）包埋：1.石蜡包埋；石蜡包埋；2.冷冻包埋；冷冻包埋；3.环氧树脂包理。环氧树脂包理。（四）切片：（四）切片：1.载玻片的处理：载玻片的处理：1）清洗）清洗；2）涂胶（防止脱片）涂胶（防止脱片）常用粘附剂：常用粘附剂：明胶：铬矾明胶和甲醛明胶；明胶：铬矾明胶和甲醛明胶；树脂胶：树脂胶：也称白胶；也称白胶；多聚赖氨酸（多聚赖氨酸（PLL）；）；商品化粘附剂。商品化粘附剂。2.切片类型：切片类型：l）石蜡切片：厚约）石蜡切片：厚约35m放置放置37温箱烘烤过夜，温箱烘烤过夜，以减少脱片。以减少脱片。2）冷冻切片：）冷冻切片：2m。3）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用胶水粘在）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。神经组织应用神经组织应用较多。较多。四免疫组化染色过程中的基本技术四免疫组化染色过程中的基本技术（一）蛋白酶消化技术（一）蛋白酶消化技术进进行行固固定定时时，抗抗原原决决定定簇簇有有可可能能被被固固定定剂剂所所封封闭闭，因因此此在在抗抗原原抗抗体体反反应应前前，常常用用蛋蛋白白酶酶处处理理组组织织切切片片，使使抗抗原原决决定定簇簇充充分分暴暴露露出出来来，并并使使组组织织的的通通透透性性增增高高，以以利利抗抗原原抗抗体体最大限度地结合增强特异性染色。最大限度地结合增强特异性染色。1常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶2消消化化时时间间：因因组组织织而而异异，一一般般为为530分分钟钟，消消化化时时间间不不宜宜太太长长，以以免免损损伤伤组组织织形形态态，破破坏坏抗抗原原决决定定族族。消消化化结结束束后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。1）非特异染色的控制）非特异染色的控制非非特特异异染染色色或或背背景景染染色色是是指指在在免免疫疫组组化化染染色色过过程程中中凡凡不不属属于特异性抗原抗体反应所出现的染色。于特异性抗原抗体反应所出现的染色。1原因分析：原因分析：组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶、内源性生物素等；性磷酸酶、内源性生物素等；试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。2消除方法：消除方法：A.加加1抗前加正常血清抗前加正常血清1030分，以封闭组织中带电荷的基分，以封闭组织中带电荷的基因，避免与因，避免与1抗的非特异性结合。抗的非特异性结合。B.减少非特异性染色：减少非特异性染色：a免疫酶组化染色时，在加免疫酶组化染色时，在加1抗前，用抗前，用0.3的的H2O2甲醇溶甲醇溶液将组织切片处理液将组织切片处理30分（若是分（若是3的的H2O2甲醇溶液处甲醇溶液处理理510分）。分）。b免疫荧光染色时，可用免疫荧光染色时，可用0.010.05伊文思蓝稀释荧光伊文思蓝稀释荧光抗抗体。体。（二）对照实验（二）对照实验阳性对照片：用已知抗原为阳性的标本作对照。阳性对照片：用已知抗原为阳性的标本作对照。阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照。阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照。（三）抗体的分装、稀释、滴加及保存（三）抗体的分装、稀释、滴加及保存1抗体的分装：不能用完的抗体分装在小的抗体的分装：不能用完的抗体分装在小的EP管内，保存在管内，保存在-20-40的低温冰箱中持用可保持数年有效。的低温冰箱中持用可保持数年有效。2抗体稀释：常用抗体稀释：常用0.01MPBS（磷酸缓冲溶液）或（磷酸缓冲溶液）或BSA（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白）3滴滴加加：滴滴加加的的抗抗体体要要充充分分覆覆盖盖组组织织切切片片，一一般般加加3050l，最最好好在在滴滴加加前前，用用蜡蜡笔笔或或特特制制的的组组化化笔笔在在组组织织周周围围画画一一圈圈，以以防防溶液的扩散。溶液的扩散。4保保存存：未未用用完完的的抗抗体体可可在在低低温温冰冰箱箱或或冻冻干干保保存存，已已稀稀释释未未用完的抗体最好在一周内用完，不宜长期保存。用完的抗体最好在一周内用完，不宜长期保存。（四）免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术（四）免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术1免疫酶染色原理：免疫酶染色原理：用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免疫用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP法）和双法）和双PAP法等。法等。1）直接法原理：用酶直接标记在特异性）直接法原理：用酶直接标记在特异性1抗上，与标本中的抗上，与标本中的抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗原抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗原抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测。抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。2）间接法原理：先用标记的特异性）间接法原理：先用标记的特异性1抗与标本中相应抗原结抗与标本中相应抗原结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（2抗）孵育，然后再加抗）孵育，然后再加酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部位，以对抗原进行检测。位，以对抗原进行检测。如：如：1抗是由免产生的多克隆抗体：抗是由免产生的多克隆抗体：则则2抗常用羊抗兔抗常用羊抗兔IgG；如：如：1抗是由鼠产生的单克隆抗体：抗是由鼠产生的单克隆抗体：则则2抗常用羊或马抗鼠抗常用羊或马抗鼠IgG。以上两种方法称为酶标抗体法以上两种方法称为酶标抗体法3）非非酶酶标标记记的的抗抗体体酶酶法法：是是以以酶酶为为抗抗原原免免疫疫动动物物，产产生生抗抗酶酶的的抗抗体体。通通过过酶酶与与抗抗体体的的特特异异性性结结合合进进行行标标记记。该该方方法法适适用用于于石蜡包埋的组织切片。石蜡包埋的组织切片。原理：首先用酶作为抗原免疫动物，制备效价高、特异性原理：首先用酶作为抗原免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后以强的抗酶抗体，然后以2抗为桥梁，将在组织中与抗原结合的抗为桥梁，将在组织中与抗原结合的lffo抗酶抗体连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经呈色反抗酶抗体连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经呈色反应显示抗原的分布。在这种过程中酶是通过免疫学原理与抗酶应显示抗原的分布。在这种过程中酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了酶标时化学反应对抗体和酶活性的破坏。不抗体结合，避免了酶标时化学反应对抗体和酶活性的破坏。不但提高了敏感性，同时还节省了但提高了敏感性，同时还节省了1抗的用量。抗的用量。常用的有常用的有PAP、sABC、LsAB法（附图表说明）。法（附图表说明）。（酶标识特异抗体（酶标识特异抗体（酶标识二次抗体（酶标识二次抗体生物素生物素HRPALP1常用的酶种类：常用的酶种类：常常用用的的酶酶大大多多为为辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（horseradishperoxidase,HRP）介介绍绍几种酶的底物及产生沉淀的颜色。几种酶的底物及产生沉淀的颜色。常见的几种酶的一般情况常见的几种酶的一般情况酶酶底物底物沉淀颜色沉淀颜色HRPA3,3氨基联苯胺氨基联苯胺DABH2O2深褐色深褐色B5氨基水杨酸氨基水杨酸H2O2棕色棕色ALPA苯酚磷酸盐重氮盐苯酚磷酸盐重氮盐红色红色BP校际酚磷酸盐校际酚磷酸盐黄色黄色酸性磷酸酶酸性磷酸酶Gomoui液液葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶D葡萄糖葡萄糖MTT酚嗪磷酸酚嗪磷酸甲酯化合物甲酯化合物蓝色蓝色五免疫组化的实际操作五免疫组化的实际操作（一）实验准备（一）实验准备1.必须器材：必须器材：1）实验台：光线充足，方便操作。）实验台：光线充足，方便操作。2）湿润盒：放置抗原抗体反应过程中反应，避免干燥。）湿润盒：放置抗原抗体反应过程中反应，避免干燥。3微量移液器：微量移液器：120l、20200l、1001000l必备。必备。4其它：滤纸、纱布、吸头、其它：滤纸、纱布、吸头、EP管、染缸、提篮等。管、染缸、提篮等。2.试剂药品试剂药品1缓冲液：缓冲液：PBS,0.01M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.2）TBS,0.05MTris盐酸缓冲液（盐酸缓冲液（pH7.6）2抗体稀释液抗体稀释液:1BSA或或0.01MPBS3102抗免疫动物的正常血清抗免疫动物的正常血清4DBAH2O2显色液显色液5核复染液：苏木素或甲基绿核复染液：苏木素或甲基绿（二（二sABC法的操作过程法的操作过程1.基本原理：基本原理：sABC（strepto-avidin-biotinperoxidasecomplex）链球菌抗生物素（卵白蛋）生物素过氧化物酶复合物链球菌抗生物素（卵白蛋）生物素过氧化物酶复合物生物素（生物素（biotin）：是一种分子量为）：是一种分子量为244da的小分子的维生素。的小分子的维生素。抗生物素（抗生物素（avidin）：是一种糖蛋白，分子量为）：是一种糖蛋白，分子量为68KDa。生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很难解生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很难解离。同时生物素与抗生物素都有与其它示踪剂如荧光素，胶体金离。同时生物素与抗生物素都有与其它示踪剂如荧光素，胶体金和过氧化物酶等相结合的能力。所以生物素和过氧化物酶等相结合的能力。所以生物素-抗生物素系统具有抗生物素系统具有灵敏度高、特异性强及方便快速等显著优点。灵敏度高、特异性强及方便快速等显著优点。基本操作步骤：基本操作步骤：六操作过程中的各种注意事项及结果判定六操作过程中的各种注意事项及结果判定要要想想得得到到理理想想的的结结果果，组组织织细细胞胞形形态态的的保保存存、抗抗原原性性的的保保存存、充充分分的的显显示示是是非非常常必必要要的的。要要满满足足这这些些条条件件，取取材材、固固定定、切切片片厚厚度度、操操作作过过程程、抗抗体体浓浓度度及及特特异异性性的的选选择择、操操作作前前蛋蛋白白酶酶的的消消化化、抗抗原原修修复复及及显显色色等等各各程程序序的的操操作作不不当当均均可可导导致致不不满满意意结果的产生。结果的产生。1取取材材固固定定：标标本本要要尽尽可可能能新新鲜鲜，取取材材固固定定要要及及时时，固固定定液液要要新新鲜充足，防止组织破坏和抗原性的失活。鲜充足，防止组织破坏和抗原性的失活。2切切片片：切切片片不不宜宜过过厚厚，一一般般4m左左右右。切切片片不不宜宜过过大大，载载玻玻片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放37温箱保存。温箱保存。3脱蜡：脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯脱蜡：脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯5min3。4蛋白酶消化：由于组织在固定时抗原决定簇可能被固定蛋白酶消化：由于组织在固定时抗原决定簇可能被固定剂所封闭，因此在抗原抗体反应前常用蛋白酶处理组织剂所封闭，因此在抗原抗体反应前常用蛋白酶处理组织切片（根据切片（根据1抗要求），使抗原决定簇充分暴露出来，并抗要求），使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织通透性增高，使抗体充分结合抗原，增强特异性使组织通透性增高，使抗体充分结合抗原，增强特异性染色。一般用染色。一般用0.1%胰蛋白酶或胃蛋白酶消化胰蛋白酶或胃蛋白酶消化530min。5抗原修复：一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，抗原修复：一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，8595，10min左右。左右。6抗体的选择：选择抗体时要注意是用于冰冻切片还是用于抗体的选择：选择抗体时要注意是用于冰冻切片还是用于石蜡切片的抗体，或是二者均可；其次要看抗体说明，是石蜡切片的抗体，或是二者均可；其次要看抗体说明，是单抗还是多抗；适用于哪些组织；抗体来源于哪种动物，单抗还是多抗；适用于哪些组织；抗体来源于哪种动物，由此来选择由此来选择2抗；还有抗体的稀度（在实验前根据预实验抗；还有抗体的稀度（在实验前根据预实验选择最佳浓度选择最佳浓度。7特异性的确定：阴性对照（不加特异性的确定：阴性对照（不加1抗，用抗，用PBS或或TBS代代替），阳性对照（已知确定阳性的组织）或买阳性对照片。替），阳性对照（已知确定阳性的组织）或买阳性对照片。8DABH2O2显色：注意显色：注意H2O2的浓度，必须在显示前加入的浓度，必须在显示前加入H2O2均匀搅拌，最佳显色时间在均匀搅拌，最佳显色时间在35min，过短或过长都，过短或过长都不会出现满意的效果。不会出现满意的效果。9复染：一般用苏木素复染：一般用苏木素30s，过长复染将掩盖免疫组化的染，过长复染将掩盖免疫组化的染色效果。色效果。10结果判定：以下用图片说明。结果判定：以下用图片说明。膜性肾病，IgG染色免疫组织化学ABC法胃癌淋巴结转移胃癌淋巴结转移cerbB-2癌基因表达癌基因表达sABC法法HE染色免疫组化染色胃癌，胃癌，P53抑癌基因表达，抑癌基因表达，sABC法法胃癌胃癌CerbB-2的表达，的表达，sABC法法胃癌胃癌cerbB-2的淋巴管侵袭，的淋巴管侵袭，sABC法法胃淋巴组织反应胃淋巴组织反应性增生，性增生，CD20/CD43检测检测sABC法法胃组织中的反应性增生的淋巴组织，胃组织中的反应性增生的淋巴组织，CD43表达，表达，sABC法法骨骼肌营养不良，骨骼肌营养不良，myosin蛋白表达，蛋白表达，sABC法法IgAN，TGF2表达，主要在近曲表达，主要在近曲肾小管内，小管内，sABC法法IgAN,TGF2的表达，的表达，sABC法法IgAN，bFGF的表达，的表达，sABC法法IgAN,PDGF的表达，的表达，sABC法法免疫组织化学在病理诊断中的应用范围免疫组织化学在病理诊断中的应用范围1.肿瘤诊断：肿瘤诊断：未分化恶性肿瘤性质判定；未分化恶性肿瘤性质判定；圆形、梭形、多形性肿瘤细胞鉴别；圆形、梭形、多形性肿瘤细胞鉴别；转移肿瘤的原发部位的确定。转移肿瘤的原发部位的确定。2.淋巴瘤的诊断：淋巴瘤的诊断：鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。各种淋巴瘤的分型。3.内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素4.软组织肿瘤；神经系统肿瘤软组织肿瘤；神经系统肿瘤5.小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否与否6.微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓7.细针穿刺（细胞学诊断细针穿刺（细胞学诊断8.部分肿瘤来源分类部分肿瘤来源分类9.乳腺癌激素受体检测（乳腺癌激素受体检测（ER，PR10.肿瘤基因产物（肿瘤基因产物（p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（Ki-67，PCNA)判定肿判定肿瘤的预后瘤的预后12.病因诊断（病因诊断（HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等等免疫组织化学在病理诊断中存在的不足免疫组织化学在病理诊断中存在的不足1.与分子生物学等技术相比，范围有限与分子生物学等技术相比，范围有限2.并非所有肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的并非所有肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的抗体抗体3.相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗体，常常可表达多种肿瘤体，常常可表达多种肿瘤4.免疫组织化学标准化问题免疫组织化学标准化问题哈尔滨医科大学病理教研室哈尔滨医科大学病理教研室 金晓明金晓明一、免疫电镜技术一、免疫电镜技术(immunoelection (immunoelection microscopy,IEM)microscopy,IEM) 是利用抗原和抗体特异性结合的原理，在超微结构水平定是利用抗原和抗体特异性结合的原理，在超微结构水平定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。从细胞超微结构水平位、定性及半定量显示抗原的技术方法。从细胞超微结构水平研究和观察抗原抗体的免疫反应，必须使抗体带上具有高电子研究和观察抗原抗体的免疫反应，必须使抗体带上具有高电子密度的标记物，这样才能在电镜下观察反应分结果。密度的标记物，这样才能在电镜下观察反应分结果。 到目前为止，已有三种标记技术：到目前为止，已有三种标记技术： (1)(1)铁蛋白标记技术铁蛋白标记技术 (2)(2)酶标记技术酶标记技术 (3)(3)胶体金标记技术胶体金标记技术二、免疫金标记技术（二、免疫金标记技术（immunogold staining immunogold staining technique)technique) 用胶体状态的金颗粒，作为抗体的标记物，制成免疫用胶体状态的金颗粒，作为抗体的标记物，制成免疫胶体金来研究抗原抗体的反应。在光镜下，胶体金呈鲜红胶体金来研究抗原抗体的反应。在光镜下，胶体金呈鲜红色。电镜下，金颗粒电子密度大，有利于超微结构的观察。色。电镜下，金颗粒电子密度大，有利于超微结构的观察。 根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞水平定性定位。根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞水平定性定位。对抗体加以标记，形成高电子密度区，在电镜下观察反应对抗体加以标记，形成高电子密度区，在电镜下观察反应过程。在对细胞内抗原定性研究中，还可用不同的金颗粒过程。在对细胞内抗原定性研究中，还可用不同的金颗粒标记同一细胞内不同的抗原。进行多重标记。标记同一细胞内不同的抗原。进行多重标记。 三、免疫电镜的基本技术方法三、免疫电镜的基本技术方法1.1.标本的处理标本的处理(1)(1)取材取材: :各种培养细胞和分离的血细胞应随用随取；游离的培各种培养细胞和分离的血细胞应随用随取；游离的培 养细胞可先进行离心；贴壁细胞可在载玻片上固定，养细胞可先进行离心；贴壁细胞可在载玻片上固定， 也可用胰蛋白酶将细胞消化下来；取组织块时应做到也可用胰蛋白酶将细胞消化下来；取组织块时应做到 越快越好，最好在没有停止血流前取材。越快越好，最好在没有停止血流前取材。 （2 2）固定）固定 固定液的选择：固定液的选择： 既要保存细胞的超微结构，又要尽可能的保存抗原的活性。既要保存细胞的超微结构，又要尽可能的保存抗原的活性。A.A.多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液（多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液（PGPG固定液）固定液）B.B.过碘酸盐赖氨酸多聚甲醛混合固定液（过碘酸盐赖氨酸多聚甲醛混合固定液（ PLPPLP固定液）固定液）C.C.苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液（苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液（PAPGPAPG固定液固定液) ) 固定方法与时间：固定方法与时间：A.A.血管灌注固定（最好方法）血管灌注固定（最好方法）B.B.浸泡固定浸泡固定C.C.微波固定微波固定2.2.基本技术方法基本技术方法（1 1）包埋前免疫电镜技术）包埋前免疫电镜技术 是指先对标本进行免疫标记，然后进行包埋、切片、是指先对标本进行免疫标记，然后进行包埋、切片、观察。观察。（2 2）包埋后免疫电镜技术）包埋后免疫电镜技术 是指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再是指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学染色方法。进行免疫化学染色方法。详见详见包埋前和包埋后电镜技术的比较包埋前和包埋后电镜技术的比较包埋前与包埋后的比较包埋前与包埋后的比较包埋前包埋前包埋后包埋后优点优点缺点缺点修正修正未经锇酸固定、脱水、树脂包埋未经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，标记的阳性及高温聚合的过程，标记的阳性率高，提高电镜的检出率。率高，提高电镜的检出率。免疫染色完毕后用戊二醛与锇酸免疫染色完毕后用戊二醛与锇酸作后固定，可使抗原抗体结合的作后固定，可使抗原抗体结合的更加牢固，并有利于膜结构的保更加牢固，并有利于膜结构的保存。存。标记前细胞内抗原受到标记抗体标记前细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制（因是组织块）的穿透性限制（因是组织块）制作厚切片；增加细胞膜的通透制作厚切片；增加细胞膜的通透性性具有阳性结果重复性高、方法简具有阳性结果重复性高、方法简便可靠的优点，可对同一组织块便可靠的优点，可对同一组织块的连续切片作各种对照染色，能的连续切片作各种对照染色，能十分准确的解释染色结果，而且十分准确的解释染色结果，而且还能在同一张切片上进行多重免还能在同一张切片上进行多重免疫染色。疫染色。抗原在脱水、浸透及树脂包埋过抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，使免疫染色的程中可能被破坏，使免疫染色的阳性率下降。阳性率下降。细胞膜保存差（锇酸作用）细胞膜保存差（锇酸作用）固定液选择苦味酸固定液选择苦味酸(保护细胞膜保护细胞膜)包埋剂协作低温树脂包埋剂协作低温树脂肝细胞内肝细胞内的内质网的内质网和核膜，和核膜，可见可见G-6-PG-6-P酶阳性反酶阳性反应产物。应产物。(32000)(32000)肝细胞。箭头指线粒体，线粒体嵴、内膜基质侧呈现琥珀酸肝细胞。箭头指线粒体，线粒体嵴、内膜基质侧呈现琥珀酸脱氢酶阳性反应颗粒（脱氢酶阳性反应颗粒（3600036000） IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表达，免疫金银法的表达，免疫金银法IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表达，免疫金银法的表达，免疫金银法K4MK4M低温包埋剂和紫外线低温包埋机联合的低温包埋剂和紫外线低温包埋机联合的免疫电镜法免疫电镜法 （实验结果介绍）（实验结果介绍） 免疫电镜技术是从超微结构水平能显示抗原和抗体结合免疫电镜技术是从超微结构水平能显示抗原和抗体结合后在细胞微细结构水平的定位，这一技术已成为目前生物医后在细胞微细结构水平的定位，这一技术已成为目前生物医学领域的一项重要研究手段。但是，由于免疫电镜技术因多学领域的一项重要研究手段。但是，由于免疫电镜技术因多种原因造成的重复性差或技术的不稳定性，加之目前电镜包种原因造成的重复性差或技术的不稳定性，加之目前电镜包埋所采用的是环氧树脂埋所采用的是环氧树脂618618或或812812，都需高温聚合，这样可使，都需高温聚合，这样可使多种抗原活性减低或丧失。本研究组选用了多种抗原活性减低或丧失。本研究组选用了Lowicryls K4MLowicryls K4M低低温包埋剂和紫外线低温包埋机（温包埋剂和紫外线低温包埋机（SPI#17020SPI#17020），对免疫电镜观），对免疫电镜观察的标本进行了处理，目的是更好的保存被检测组织中抗原察的标本进行了处理，目的是更好的保存被检测组织中抗原的活性，提高检出率。现将一些不成熟的经验和存在的问题的活性，提高检出率。现将一些不成熟的经验和存在的问题进行一下总结。进行一下总结。一、一、紫外线低温包埋机紫外线低温包埋机（SPI#17020SPI#17020） SPI#17020SPI#17020是美国特殊研制的低温包埋机，它最主要的特是美国特殊研制的低温包埋机，它最主要的特点是采用数字化温度控制，点是采用数字化温度控制， 通常采用干冰制冷，也可以使用通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，温度可以控制在液氮制冷，温度可以控制在-10-10-37-37之间。通过温度控之间。通过温度控制风扇可以使机内的温度控制在某一恒定温度，持续长达制风扇可以使机内的温度控制在某一恒定温度，持续长达3636小时，完全可以满足低温脱水、浸透和包埋所需的时间。它小时，完全可以满足低温脱水、浸透和包埋所需的时间。它占地面范围小，但机内空间较大，可以同时放入占地面范围小，但机内空间较大，可以同时放入7272个包埋胶个包埋胶囊。而且机箱上方有两个封闭起来的波长为囊。而且机箱上方有两个封闭起来的波长为360nm360nm的紫外灯，的紫外灯，低温和室温下的紫外线聚合都可以在包埋机中进行。低温和室温下的紫外线聚合都可以在包埋机中进行。 总之，紫外线低温包埋机是很理想的低温脱水、浸透、总之，紫外线低温包埋机是很理想的低温脱水、浸透、聚合的机器。聚合的机器。 二、Lowicryls K4M Lowicryls K4M 低温包埋剂低温包埋剂 Lowicryls K4MLowicryls K4M是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，其特点是能在低温下保持低粘度，能很快渗入组织以及具其特点是能在低温下保持低粘度，能很快渗入组织以及具有在波长有在波长360nm360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无关，而且作用与温度无关，而且Lowicryls K4MLowicryls K4M具有亲水性，因此具有亲水性，因此它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。三、方法三、方法1.1.包埋剂的配制包埋剂的配制 商品提供的商品提供的Lowicrys K4MLowicrys K4M包埋剂由三个部分组成：单体，交包埋剂由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组联剂和引发剂。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下：织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下： （1 1）Lowicryls K4MLowicryls K4M：单体：单体 17.30g17.30g；交联剂；交联剂2.70g2.70g；引发剂；引发剂0.10g0.10g。可量取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻璃棒轻搅。可量取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻璃棒轻搅3 35 5分钟。勿过分搅拌，以防空气的气泡进入包埋剂中。分钟。勿过分搅拌，以防空气的气泡进入包埋剂中。（2 2）Lowicryls K4MLowicryls K4M的贮存：应保存在暗处室温下，该物质有刺的贮存：应保存在暗处室温下，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部。免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部。2.2.组织和细胞的取材、固定、处理组织和细胞的取材、固定、处理（1 1）组织的取材与固定：用锐刀将新鲜组织切成）组织的取材与固定：用锐刀将新鲜组织切成1 13mm3mm3 3的小块的小块, , 迅速置于迅速置于3%3%多聚甲醛多聚甲醛- 1%- 1%戊二醛固定液中戊二醛固定液中, 2, 23h3h。（2 2）细胞的取材与固定：将含有细胞的培养液转移到离）细胞的取材与固定：将含有细胞的培养液转移到离心管中，离心心管中，离心15min15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上上3%3%多聚甲醛多聚甲醛1%1%戊二醛固定液固定戊二醛固定液固定2 23h3h。（3 3）组织或细胞处理过程）组织或细胞处理过程 将固定好的标本用将固定好的标本用0.01mol/L 0.01mol/L 磷酸缓冲液冲洗磷酸缓冲液冲洗, , 10min310min3次；用次；用0.5mmol/L NH4CL-0.1mmol/L PB0.5mmol/L NH4CL-0.1mmol/L PB（pH7.4pH7.4）封闭游离的醛基封闭游离的醛基30min30min； 0.01mol/L 0.01mol/L 磷酸缓冲液磷酸缓冲液1h1h；4 4 30%,50%30%,50%乙醇脱水乙醇脱水30min30min； -20-20乙醇系列逐级脱水至乙醇系列逐级脱水至100%100%，各各1h1h（乙醇溶液应先在冰箱中预冷）。（乙醇溶液应先在冰箱中预冷）。-20-20低温包埋剂逐低温包埋剂逐级渗透级渗透 , , 纯包埋剂浸透过夜。标本放入含包埋剂的胶囊加纯包埋剂浸透过夜。标本放入含包埋剂的胶囊加盖后放入紫外线低温包埋机中，盖后放入紫外线低温包埋机中，-20-20下用紫外线灯照射下用紫外线灯照射24h24h；室温紫外线灯继续照射；室温紫外线灯继续照射3 34 4天，使样品完全聚合固化。超天，使样品完全聚合固化。超薄切片厚度薄切片厚度505070nm70nm，展片后捞在覆有福尔马膜的镊网上。，展片后捞在覆有福尔马膜的镊网上。 3.3.免疫染色免疫染色 免疫标记的切片用免疫标记的切片用3%3%的的H H2 2O O2 2 室温下处理室温下处理6 610min10min后，用后，用0.01mmol/L PBS0.01mmol/L PBS缓冲液冲洗缓冲液冲洗10min310min3次。然后在次。然后在1%BSA-PBS1%BSA-PBS封闭也上封闭封闭也上封闭30min30min，甩去不洗，滴加稀释好的一抗（如果，甩去不洗，滴加稀释好的一抗（如果用来自植物或微生物的蛋白做探针，标记温度最好在用来自植物或微生物的蛋白做探针，标记温度最好在2525左左右右202060min60min；用来自动物的蛋白做探针时，标记温度最好；用来自动物的蛋白做探针时，标记温度最好在在3030左右下左右下202060min60min）。再次用）。再次用0.01mmol/L PBS0.01mmol/L PBS缓冲液缓冲液漂洗和漂洗和1%BSA-PBS1%BSA-PBS封闭后用封闭后用5nm5nm胶体金胶体金IgGIgG探针标记探针标记60min60min，最，最后经缓冲液冲洗，每次后经缓冲液冲洗，每次10min10min。阴性对照样品在标记前省却。阴性对照样品在标记前省却一抗孵育步骤。标记后的切片经醋酸铀和柠檬酸铅各染色一抗孵育步骤。标记后的切片经醋酸铀和柠檬酸铅各染色10min ,10min ,用用JEM-122OJEM-122O透射电镜下观察。透射电镜下观察。利用羊抗兔利用羊抗兔IgGIgG胶体金探胶体金探针对大鼠肺组织进行免针对大鼠肺组织进行免疫金标记，结果显示在疫金标记，结果显示在大鼠的肺泡壁内毛细血大鼠的肺泡壁内毛细血管内皮细胞胞浆中可见管内皮细胞胞浆中可见散在分布的金颗粒。对散在分布的金颗粒。对细胞进行免疫标记，待细胞进行免疫标记，待检测的物质位于细胞内检测的物质位于细胞内时，最好采用时，最好采用10nm10nm胶体胶体金进行精细定位。如果金进行精细定位。如果待检测物质位于细胞壁，待检测物质位于细胞壁，则采用则采用151520nm20nm胶体金。胶体金。 四、结果四、结果五、讨论五、讨论 免疫电镜技术面临微细结构的保存和组织中抗原活性的保免疫电镜技术面临微细结构的保存和组织中抗原活性的保存这一对矛盾，本研究采用低温包埋剂和紫外线低温包埋机的存这一对矛盾，本研究采用低温包埋剂和紫外线低温包埋机的方法缓解了这一对矛盾的发生。方法缓解了这一对矛盾的发生。3%3%戊二醛和戊二醛和1%1%锇酸等固定液虽锇酸等固定液虽然有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响。采用的低浓然有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响。采用的低浓度的戊二醛和多聚甲醛固定液既保存了抗原活性又有利于微细度的戊二醛和多聚甲醛固定液既保存了抗原活性又有利于微细结构的观察。电镜常温包埋所采用的环氧树脂结构的观察。电镜常温包埋所采用的环氧树脂618618或或812812，在聚，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质，且二者都合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质，且二者都需高温聚合，可使多种抗原活性减低或丧失，包埋在环氧树脂需高温聚合，可使多种抗原活性减低或丧失，包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应。中的组织不易进行免疫反应。 Lowicryls K4MLowicryls K4M低温包埋剂具有亲水性，可以在紫外线低温包埋剂具有亲水性，可以在紫外线低温包埋机中进行低温聚合，它能较好地保持组织结构和低温包埋机中进行低温聚合，它能较好地保持组织结构和抗原性，并可减少非特异的抗体吸附。紫外线低温包埋机抗原性，并可减少非特异的抗体吸附。紫外线低温包埋机内承载胶囊的承载架与紫外灯源的距离适中，其下面的反内承载胶囊的承载架与紫外灯源的距离适中，其下面的反射体可以将紫外光均匀的反射到胶囊的底端，从而使包埋射体可以将紫外光均匀的反射到胶囊的底端，从而使包埋块硬度均匀，因此二者的结合使用能较好地应用在免疫电块硬度均匀，因此二者的结合使用能较好地应用在免疫电镜技术中。镜技术中。总之，免疫电镜技术在科学研究和对疾病组织内特殊总之，免疫电镜技术在科学研究和对疾病组织内特殊物质表达位置的鉴定以及量的多少具有着广阔的发展前景。物质表达位置的鉴定以及量的多少具有着广阔的发展前景。特别是在判定和评价光镜免疫细胞化学假阴性及假阳性结特别是在判定和评价光镜免疫细胞化学假阴性及假阳性结果时起着关键作用，其固定方法及包埋剂是免疫电镜标本果时起着关键作用，其固定方法及包埋剂是免疫电镜标本制作过程中对抗原活性及超微结构保存最为关键的影响因制作过程中对抗原活性及超微结构保存最为关键的影响因素。使用低温包埋剂是免疫细胞化学方法成功的关键之一，素。使用低温包埋剂是免疫细胞化学方法成功的关键之一，紫外线低温包埋机可以自动控制温度，机箱内可容纳大量紫外线低温包埋机可以自动控制温度，机箱内可容纳大量的包埋块，并且紫外线能充分均匀的照射组织块，使包埋的包埋块，并且紫外线能充分均匀的照射组织块，使包埋块硬度均匀，利于切片。二者的结合使用为免疫电镜技术块硬度均匀，利于切片。二者的结合使用为免疫电镜技术的普及创造了广阔的空间。的普及创造了广阔的空间。附：免疫金标记技术的应用范围附：免疫金标记技术的应用范围（1 1）免疫金标记技术是金探针作为抗体与组织和细胞内抗原）免疫金标记技术是金探针作为抗体与组织和细胞内抗原发生抗原抗体特异性反应，使金颗粒附着在反应部位，定位准发生抗原抗体特异性反应，使金颗粒附着在反应部位，定位准确，金颗粒电子密度很高，确，金颗粒电子密度很高，EMEM下清晰可辨。下清晰可辨。（2 2）商品化的金探针购买方便，价格低廉。根据实验要求可）商品化的金探针购买方便，价格低廉。根据实验要求可选择大小直径不同的胶体金颗粒（如选择大小直径不同的胶体金颗粒（如3nm3nm，5nm5nm，10nm 10nm ）（3 3）在超微结构水平上观察研究细胞表面和细胞器中的特异）在超微结构水平上观察研究细胞表面和细胞器中的特异抗原和抗体等物质。也可对突触小泡内神经递质进行标记。抗原和抗体等物质。也可对突触小泡内神经递质进行标记。（4）金标探针可以加入到培养液中，对培养细胞抗原进）金标探针可以加入到培养液中，对培养细胞抗原进行标记定位。行标记定位。（5）用于细胞骨架的研究。）用于细胞骨架的研究。（6）可用于）可用于SEM和和X线衍射分析。线衍射分析。（7）分别使用不同直径的金探针，可以在同一切片上显）分别使用不同直径的金探针，可以在同一切片上显示两种或两种以上的抗原即所谓双标记或多标记。示两种或两种以上的抗原即所谓双标记或多标记。（8）可用于标记石腊切片和半薄切片。）可用于标记石腊切片和半薄切片。（9）金探针无毒性，对人体无损伤，使用安全。）金探针无毒性，对人体无损伤，使用安全。