1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序专题专题1 基因工程基因工程（1 1）目的基因的获取）目的基因的获取（2 2）基因表达载体的构建）基因表达载体的构建（3 3）将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入受体细胞（4 4）目的基因的检测与鉴定）目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作程序主要包括四个步骤：基因工程基本操作程序主要包括四个步骤：一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）（一）目的基因：目的基因：主要是主要是_的基因的基因编码蛋白质编码蛋白质如：与生物如：与生物如：与生物如：与生物抗逆性相关抗逆性相关抗逆性相关抗逆性相关的基因的基因的基因的基因 与与与与优良品质相关优良品质相关优良品质相关优良品质相关的基因的基因的基因的基因 与生物与生物与生物与生物药物和保健品相关药物和保健品相关药物和保健品相关药物和保健品相关的基因的基因的基因的基因 与与与与毒物降解相关毒物降解相关毒物降解相关毒物降解相关的基因的基因的基因的基因 与与与与工业所需酶相关工业所需酶相关工业所需酶相关工业所需酶相关的基因的基因的基因的基因也可是也可是具有调控作用的因子具有调控作用的因子（如增强子等）（如增强子等）（二）（二）目的基因的获取方法：目的基因的获取方法：1、从基因文库中获取从基因文库中获取（1）基因文库：基因文库： 将含有将含有某种生物不同基因某种生物不同基因的许多的许多DNA片断片断，导入到受体菌的导入到受体菌的群体群体中中，各个受体菌分别含有，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库。（2） 基因文库的种类：基因文库的种类：部分基因部分基因文库文库基因组基因组文库文库基因组文库：基因组文库：包含包含了了一种生物一种生物的的所有基因，所有基因，其目的是分离其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。部分基因文库：部分基因文库：包含包含了了一种生物一种生物的的部分基因，部分基因，如如cDNA文库。文库。 提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNA用适当的用适当的 限制酶切限制酶切 一定大小的一定大小的DNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库基因组文库的构建方法：基因组文库的构建方法：cDNA文库的构建方法文库的构建方法-反转录法反转录法某种生物的单链某种生物的单链mRNA合成互补合成互补DNA形成双链形成双链DNA（即（即cDNA）导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNA文库文库 逆转录酶逆转录酶 （反转录酶）（反转录酶）DNA聚合酶聚合酶 原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子编码区编码区: : 能能编码蛋白质的序列编码蛋白质的序列非编码区非编码区: : 不能能编码蛋白质的序列不能能编码蛋白质的序列（含基因（含基因表达的表达的调控序列调控序列）知识补充：知识补充：真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构能够能够编码蛋白质的序列编码蛋白质的序列叫做外显子叫做外显子 不能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列叫做内含子叫做内含子内含子内含子： 外显子：外显子： 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子外显子：能：能编码蛋白质的序列编码蛋白质的序列内含子内含子：不能编码蛋白质的序列：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点（启动子）。聚合酶结合位点（启动子）。非编码序列：非编码序列：包括包括非编码区非编码区和和内含子内含子基因组文库和基因组文库和cDNA文库比较：文库比较：（3）从基因文库中得到目的基因的方法：）从基因文库中得到目的基因的方法：依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的如：根据基因的核苷酸序列核苷酸序列 基因的基因的功能功能 基因基因在染色体上的位置在染色体上的位置 基因的基因的转录产物转录产物mRNA 基因基因翻译产物蛋白质翻译产物蛋白质等特性等特性2、利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（1）PCR技术：技术：是一项在生物是一项在生物体外体外复制特定复制特定DNA片段片段的核酸合的核酸合成技术，成技术，短时间内大量扩增目的基因短时间内大量扩增目的基因。（2）原理：原理：DNA双链复制双链复制（3）条件：条件：DNA模板模板 引物（一对）引物（一对） 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸 Taq酶（耐高温的酶（耐高温的DNA聚合酶）聚合酶）缓冲液缓冲液（4）过程：过程：变性、退火、延伸变性、退火、延伸三步曲三步曲 变性：变性： 双链双链DNA单链单链DNA55 60 退火退火：90 95引物与单链引物与单链DNA模板结模板结合合( (碱基互补配对碱基互补配对) ) 延伸：延伸：70 75 Taq酶酶的作用下，的作用下，从引从引物起始物起始进行互补链的延伸进行互补链的延伸（5）结果：结果：每循环一次，目的基因可增加一倍，每循环一次，目的基因可增加一倍，呈呈指数形式（指数形式（2n）扩增。扩增。 PCR扩增仪扩增仪PCR技术扩增技术扩增与与DNA复制复制的比较的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原则原则原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸模板、能量、模板、能量、DNA聚合酶聚合酶DNA在在高温变性高温变性解旋解旋解旋酶解旋酶催化催化体外体外复制复制细胞内细胞内热稳定热稳定的的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成形成整个整个DNA分子分子3、人工合成法人工合成法如果如果基因比较小基因比较小，核苷酸序列又已知核苷酸序列又已知，也可，也可以通过以通过DNA合成仪合成仪用化学方法直接人工合成。用化学方法直接人工合成。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1、构建表达载体的构建表达载体的目的目的： 使使目的基因在受体细胞中稳定存在目的基因在受体细胞中稳定存在，并且，并且可以可以 遗传遗传给下一代；给下一代； 使目的基因能够使目的基因能够表达表达和和发挥作用发挥作用。2、基因表达载体的基因表达载体的构成及作用构成及作用：复制原点复制原点目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因启动子：启动子： 位于基因首端的位于基因首端的一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNA片断片断，它是它是RNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位；作用：作用：驱动基因转录出驱动基因转录出mRNA终止子：终止子：位于基因尾端的位于基因尾端的一段有特殊结构一段有特殊结构DNA片断。片断。作用：作用：使转录终止使转录终止标记基因：标记基因：为了为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而，从而将有目的基因的细胞筛选出来将有目的基因的细胞筛选出来（如（如抗生素抗性抗生素抗性基因基因）。）。注意：注意：启动子与终止子不同于起始密码和终止密码启动子与终止子不同于起始密码和终止密码 启动子与终止子启动子与终止子位于位于DNA上，上，是是DNA片段片段，与与基因的基因的转录有关转录有关。起始密码和终止密码起始密码和终止密码位于位于mRNA上上， 是是3个相邻个相邻的碱基的碱基，与，与翻译翻译（蛋白质的合成）（蛋白质的合成）有关有关。 克隆载体克隆载体与与表达载体表达载体的构成：的构成： 二者都有标记基因和复制原点两部分二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片片 段。段。表达载体表达载体在克隆载体基础上在克隆载体基础上增加增加了了启动启动 子、终止子，子、终止子，启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因对于目的基因 表达必不可少。表达必不可少。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1、转化转化：目的基因进入受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内，并且在受体细胞内内维持稳定和表达维持稳定和表达的过程的过程。2、常用的转化方法：常用的转化方法：（1）导入导入植物细胞植物细胞的方法：的方法： 农杆菌转化法农杆菌转化法（最常用最常用）a. 农杆菌农杆菌：土壤中的一种微生物，自然条件下土壤中的一种微生物，自然条件下感染双子叶感染双子叶植物和裸子植物植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感对大多数单子叶植物没有感染能力。染能力。 b.农杆菌转化法的原理农杆菌转化法的原理：植物受伤时，伤口处细胞会分泌大量植物受伤时，伤口处细胞会分泌大量酚类化合酚类化合物物，吸引农杆菌，吸引农杆菌，农杆菌农杆菌Ti质粒上的质粒上的T-DNA可可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的的DNA上上。 目的基因目的基因插入插入Ti质粒的质粒的T-DNA上上 c. 过程过程： 优点：优点：经济、有效经济、有效 基因枪法基因枪法单子叶植物常用单子叶植物常用的方法，的方法，成本较高成本较高。 花粉管通道法花粉管通道法简便经济简便经济 （我国（我国转基因抗虫棉转基因抗虫棉）（2）导入导入动物细胞动物细胞的方法：的方法： 常用常用方法：方法： 显微注射法显微注射法 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 受精卵受精卵目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物 流程：流程：（3）导入导入微生物细胞微生物细胞的方法：的方法： 原核生物特点：原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 方法：方法：用用Ca2+（或或CaCl2溶液溶液）处理细胞）处理细胞 感受态细感受态细胞胞 表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合 感感受态细胞吸收受态细胞吸收DNA分子，完成转化。分子，完成转化。四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1、转基因生物、转基因生物DNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因（1）方法：方法：DNA分子杂交分子杂交技术技术（2）过程：过程：. 提取提取转基因生物的转基因生物的基因组基因组DNA. 用用放射性同位标记放射性同位标记的目的基因的的目的基因的DNA片段片段 做做探针探针，与转基因生物的基因组杂交与转基因生物的基因组杂交， 若若显示出杂交带显示出杂交带，表明目的基因已插入表明目的基因已插入染染 色体色体DNA中。中。2、目的基因、目的基因是否转录出是否转录出mRNA（1）方法：方法：分子杂交分子杂交技术技术（2）过程：过程：. 提取提取转基因生物的转基因生物的mRNA. 用用放射性同位标记放射性同位标记的目的基因的的目的基因的DNA片段片段 做做探针探针，与与转基因生物的转基因生物的mRNA杂交杂交， 若若显示出杂交带显示出杂交带，表明目的基因转录出表明目的基因转录出 mRNA。3、检测目的基因、检测目的基因是否翻译成蛋白质是否翻译成蛋白质（1）方法：方法：抗原抗原抗体杂交抗体杂交 （2）原理：原理： 抗原与抗体的特异性结合抗原与抗体的特异性结合（3）过程：过程：. 提取提取转基因生物的转基因生物的蛋白质蛋白质. 用用针对目的基因表达的蛋白质针对目的基因表达的蛋白质（抗原）的（抗原）的 抗体（放射性标记）抗体（放射性标记），与与转基因生物的转基因生物的蛋蛋 白质（抗原）杂交白质（抗原）杂交，若，若显示出杂交带显示出杂交带，表表 明目的基因已形成相应的蛋白质明目的基因已形成相应的蛋白质。除了上述除了上述分子水平分子水平的鉴定，有时还需进行的鉴定，有时还需进行个体个体生物学水平生物学水平的鉴定：的鉴定：比如做比如做抗虫、抗病抗虫、抗病的的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；以确定是否有抗性以及抗性的程度；或对或对基因工程产品与天然产品的功能进行基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较活性比较，以确定功能是否相同，以确定功能是否相同【特别提示】【特别提示】关注关注“操作程序操作程序”中的四个易混点中的四个易混点(1)(1)目的基因的插入位点不是随意的。目的基因的插入位点不是随意的。目的基因目的基因 应插入到启动子与终止子之间的部位应插入到启动子与终止子之间的部位。(2)(2)目的基因与载体相连接时，可能出现目的基因与载体相连接时，可能出现3种连接种连接 方式方式，如，如目的基因目的基因目的基因、目的基因目的基因、目的基因 载体、载体载体、载体载体载体。为了防止目的基因或载。为了防止目的基因或载 体自连，基因工程中体自连，基因工程中常用常用2种不同的限制酶种不同的限制酶对对 目的基因和载体进行目的基因和载体进行切割切割，并保证目的基因，并保证目的基因 的的定向连接定向连接（启动子在其前，终止子在其（启动子在其前，终止子在其 后，保证目的基因正常转录）后，保证目的基因正常转录）(3)(3)基因工程基因工程4步曲中，只有步曲中，只有第第3步步“将目的基因将目的基因导入受体细胞导入受体细胞”没有发生碱基互补配对没有发生碱基互补配对，其他，其他三步中都涉及碱基互补配对，具体过程如下三步中都涉及碱基互补配对，具体过程如下: :第第1步中发生在步中发生在反转录法反转录法合成目的基因或合成目的基因或PCR 技术技术扩增目的基因过程中。扩增目的基因过程中。第第2步中发生在步中发生在黏性末端相互连接黏性末端相互连接过程中。过程中。第第4步中目的步中目的基因的导入检测、转录检测基因的导入检测、转录检测发生发生 碱基互补配对。碱基互补配对。