实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色一、实验目的1、熟练掌握无菌操作技术（从试管菌种中转接微生物到新的试管培养基中），体会无菌操作的重要性；2、学习并掌握微生物的制片及简单染色的基本技术。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色二、实验原理1、高温对微生物具有致死效应，因此在微生物的转接过程中，一般在酒精灯火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环（针、铲），以达到灭菌的目的。2、简单染色：利用单一染料对菌体进行染色的方法。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色二、实验原理 发色集团：色原，赋予染料颜色特征染料 助色集团：能够形成盐，与细菌细胞结合使着色。 碱性染料：包括美蓝（亚甲基）、结晶紫、 染料 碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等 酸性染料：酸性复红、伊红和刚果红等。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色二、实验原理微生物细胞在碱性、 中性及弱酸性溶液中通常带负电荷，而碱性染料电离后部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色；当微生物细胞处于酸性条件下所带正电荷增加时，可采用酸性染料着色。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色三、实验仪器与用具超净工作台、接种环、酒精灯、火柴、试管架、显微镜、擦镜纸、双层瓶、装有蒸馏水的滴瓶等四、实验材料与试剂大肠杆菌（E.coli）营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌（B.subtilis）营养琼脂斜面金黄色葡萄球菌（S.aureus）营养琼脂斜面实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色五、实验操作（一）无菌操作技术（用接种环转接菌种）1、手持试管左手：拿细菌斜面培养物和营养斜面右手：持接种环2、拔棉塞在火焰旁打开斜面培养物的试管棉塞，注意不能放在桌面上，并将试管口在火焰上灼烧一下。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色（一）无菌操作技术（用接种环转接菌种）3、取菌使用灼烧并冷却的接种环在细菌的琼脂斜面上轻轻刮取。4、划线从下到上划一直线，然后再从其底部开始向上做蛇形划线（或“之”字形）实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色（一）无菌操作技术（用接种环转接菌种）5、塞棉塞6、灼烧接种环7、作标记使用记号笔在试管口部注明菌种名称、接种日期和接种人姓名。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色五、实验操作（二）细菌的简单染色1、涂片在载玻片的中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜（直径约1cm）。注意事项：1）载玻片要洁净无油迹； 2）滴生理盐水或取菌不宜过多； 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色（二）细菌的简单染色2、干燥自然干燥3、固定涂面朝上，通过火焰23次。固定的目的：1）使细胞质凝固变性，固定细胞形状；2）使菌体牢固附着在载玻片上。注意：热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫注意：热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色（二）细菌的简单染色4、染色滴加染液覆盖涂菌部位即可。染色时间：吕氏碱性美蓝 1.5min； 草酸铵结晶紫或齐氏石炭酸复红 1min5、水洗倒去染液，用自来水冲洗，直至图片上留下的水无色为止。注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端留下，水流不宜过急、过大，以免涂片薄片的一端留下，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。膜脱落。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色五、实验操作（二）细菌的简单染色6、干燥用吸水纸吸取多余的水分，自然干燥或电吹风吹干。7、镜检涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色六、实验作业1、根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。2、在进行细菌涂片时应注意哪些环节？3、进行细菌制片时为什么要进行加热固定？在加热固定时应注意什么？4、进行简单染色的目的及原理是什么？进行微生物制片时是否都需要进行染色？为什么？