陆惠论文答辩陆惠论文答辩PPTPPT课课件件硕士论文答辩报告硕士论文答辩报告本实验来源于本实验来源于2011年常德市科技局基金课题年常德市科技局基金课题 课题编号课题编号:2011SK18右归丸对自身免疫性右归丸对自身免疫性POFPOF模型小鼠卵模型小鼠卵巢组织巢组织Th17/TregTh17/Treg蛋白表达的影响蛋白表达的影响 研研 究究 生：生： 陆陆 惠惠 导导 师：师： 丁丁 青青 教授教授 专专 业：业： 中西医结合临床中西医结合临床 研究方向：研究方向： 妇科内分泌妇科内分泌12345引言引言引言引言实验材料与方法实验材料与方法实验材料与方法实验材料与方法结果与分析结果与分析结果与分析结果与分析讨论讨论讨论讨论结论结论结论结论论文答辩报告论文答辩报告引引 言言卵巢早衰是指性卵巢早衰是指性器官发育正常的器官发育正常的女性在女性在40岁以前岁以前出现闭经，伴出现闭经，伴LH和和FSH水平升高，水平升高，E2水平降低，卵水平降低，卵泡数量减少，卵泡数量减少，卵巢体积缩小并最巢体积缩小并最终萎缩的卵巢功终萎缩的卵巢功能衰退现象能衰退现象。 本病发病率逐年上本病发病率逐年上升，病因复杂，治升，病因复杂，治疗难度大疗难度大 。西医有。西医有激素替代疗法、辅激素替代疗法、辅助赠卵法及助赠卵法及 近年报近年报道的卵巢组织冻存道的卵巢组织冻存法等疗法。中医主法等疗法。中医主要从要从“肾虚肾虚”论治。论治。右归丸为补肾中药右归丸为补肾中药代表方。代表方。本实验通过观察右本实验通过观察右归丸对自身免疫性归丸对自身免疫性POF模型小鼠卵巢模型小鼠卵巢组织组织TH17/Treg蛋蛋白表达的影响，探白表达的影响，探讨右归丸对自身免讨右归丸对自身免疫性疫性POF的疗效及的疗效及机制，为临床用药机制，为临床用药提供实验依据。提供实验依据。实验药物实验药物山药山药 山茱萸山茱萸 枸枸 杞杞 鹿角胶鹿角胶菟丝子菟丝子杜杜 仲仲当当 归归肉肉 桂桂制附子制附子 熟熟 地地右归丸中药组成实验材料与方法实验材料与方法实验药物补佳乐安宫黄体酮实验材料与方法实验材料与方法SPF级健康BALB/c雌性小鼠体重202g饲养温度20-25C湿度50-70%由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供（许可证号：SCXK（湘）2009-0004小鼠透明带多肽3片段（pZP3）弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂E2、FSH定量检测试剂盒一步法RT-PCR试剂盒Th17与Treg引物合成台式高速离心机全自动酶标检测仪 ThermoPxZ型 PCR仪电泳仪紫外分光光度仪DNA热循环扩增仪凝胶扫描成像分析系统动动动动 物物物物试试试试 剂剂剂剂 仪仪仪仪 器器器器 实验材料与方法实验材料与方法实验设备实验设备实验材料与方法实验材料与方法SPFSPF级健康级健康BALB/cBALB/c雌性小雌性小鼠由湖南斯莱鼠由湖南斯莱克景达实验动克景达实验动物有限公司提物有限公司提供。饲养温度供。饲养温度20-2520-25，湿，湿度度50-70%50-70%。实验材料与方法实验材料与方法-造模造模取透明带多取透明带多肽片粉末，肽片粉末，溶于三蒸水溶于三蒸水中；分别与中；分别与弗氏完全佐弗氏完全佐剂、弗氏不剂、弗氏不完全佐剂按完全佐剂按1 1：1 1比例配免比例配免疫试剂及免疫试剂及免疫强化试剂疫强化试剂。第一次免第一次免疫：取疫：取0.15mL0.15mL免免疫试剂在疫试剂在小鼠双脚小鼠双脚掌及腹腔掌及腹腔皮下多点皮下多点注射。注射。第二次免疫：第二次免疫：第一次免疫第一次免疫14d14d后予免后予免疫强化试剂疫强化试剂0.15mL0.15mL加强加强免疫，方法免疫，方法同前。同前。小鼠阴道脱小鼠阴道脱落细胞涂片、落细胞涂片、血清激素水血清激素水平及卵巢形平及卵巢形态学抽查判态学抽查判断是否造模断是否造模成功。成功。二、实验材料与方法二、实验材料与方法右归丸右归丸水提纯水提纯液加雌液加雌孕激素孕激素序贯治序贯治疗疗中西组中西组中西组中西组每每20g小小鼠鼠0.2mL蒸馏水灌蒸馏水灌胃胃模型组模型组模型组模型组每每20g小小鼠鼠0.2mL右归丸水右归丸水提纯液灌提纯液灌胃胃右归组右归组右归组右归组每每20g小小鼠鼠0.2mL补佳乐与补佳乐与安宫黄体安宫黄体酮序贯治酮序贯治疗疗西药组西药组西药组西药组每每20g小小鼠鼠0.2mL蒸馏水灌蒸馏水灌胃胃正常组正常组正常组正常组SPF级动物房灌胃眼眶静脉取血眼眶静脉取血处死老鼠处死老鼠保存卵巢保存卵巢4静置30min后3500r/min转速离心10min，分离血清，分装后分别置-4和-20冰箱中冷冻 。将老鼠放在有大量冰块的操作台，取出双卵巢，冰冻生理盐水洗净，滤纸干燥后称重 。一侧卵巢立即置液氮罐中冰冻，待行RT-PCR检测；一侧固定于4 %多聚甲醛，待行HE染色，观察卵巢形态学改变。 实验材料与方法实验材料与方法HEHE染色法观察小鼠卵巢形态学改变染色法观察小鼠卵巢形态学改变RT-PCRRT-PCR法检测方法小鼠卵巢组织法检测方法小鼠卵巢组织Th17Th17、TregTreg蛋白表达水平蛋白表达水平ELISAELISA法检测小鼠血清性激素（法检测小鼠血清性激素（E2E2、FSHFSH）水平）水平检测方法检测方法实验材料与方法实验材料与方法统计学方法统计学方法n本实验全部数据均采用SPSS18.0软件包进行统计学处理。n计量资料以均数标准差（xs）表示，满足正态分布、方差齐性的指标，采用单因素方差分析（AVOVA）。n多组与一组比较采用Dunnett法，每两组比较用LSD法；对于方差不齐的数据用TamhanesT2法。n（检验水准=0.05，P0.05表示无统计学意义；P0.05说明有统计学意义；P0.01表示有显著统计学意义）。实验结果实验结果-一般情况毛色润泽，毛色润泽，干净。精神干净。精神好，反应灵好，反应灵敏，活泼，敏，活泼，好动。好动。弓背，喜蜷弓背，喜蜷缩，反应淡缩，反应淡漠，活动减漠，活动减少，体毛分少，体毛分叉，污秽。叉，污秽。饮水、进食饮水、进食正常，精力正常，精力好，活动灵好，活动灵敏、毛色润敏、毛色润泽光亮。泽光亮。正常组正常组模型组模型组药物干预组药物干预组实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果卵巢组织卵巢组织Th17Th17与与TregTreg蛋白表达蛋白表达实验结果实验结果-卵巢形态学v空白组空白组: :卵巢组织结构清晰，可见各级卵泡形态结构正常。卵巢组织结构清晰，可见各级卵泡形态结构正常。间质未见炎细胞浸润及纤维化。间质未见炎细胞浸润及纤维化。 实验结果-卵巢形态学v模型组模型组: :可见卵巢组织体积缩小，部分被纤维组织取代；可见卵巢组织体积缩小，部分被纤维组织取代；卵巢内极少有成熟卵泡，生长的卵泡亦明显减少，卵泡细卵巢内极少有成熟卵泡，生长的卵泡亦明显减少，卵泡细胞形态欠规则，卵泡边缘不规则地向邻近的间质延伸，且胞形态欠规则，卵泡边缘不规则地向邻近的间质延伸，且卵泡周边颗粒细胞排列紊乱，数量减少；卵泡闭锁明显增卵泡周边颗粒细胞排列紊乱，数量减少；卵泡闭锁明显增多；黄体数目极少；卵巢间质及卵泡内可见淋巴细胞及浆多；黄体数目极少；卵巢间质及卵泡内可见淋巴细胞及浆细胞浸润。细胞浸润。 实验结果-卵巢形态学v右归组：卵巢体积增大，与正常组相近；各级卵泡数目增多，右归组：卵巢体积增大，与正常组相近；各级卵泡数目增多，卵泡生长较模型组活跃，成熟卵泡增多，与正常组成熟卵泡卵泡生长较模型组活跃，成熟卵泡增多，与正常组成熟卵泡体积接近，卵泡液含量增多；颗粒细胞层次较模型组多，排体积接近，卵泡液含量增多；颗粒细胞层次较模型组多，排列未见紊乱；黄体数量较多。列未见紊乱；黄体数量较多。实验结果实验结果-卵巢形态学v西药组西药组: :卵巢体积较正常组稍小；各级卵泡可见，有少部分卵泡发育卵巢体积较正常组稍小；各级卵泡可见，有少部分卵泡发育不良；卵泡颗拉细胞层较模型组增多；卵巢间质偶见少量淋巴细胞及不良；卵泡颗拉细胞层较模型组增多；卵巢间质偶见少量淋巴细胞及浆细胞浸润。浆细胞浸润。实验结果实验结果-卵巢形态学v中西组：卵巢体积、各级卵泡及卵泡生长情况、卵泡液含量、中西组：卵巢体积、各级卵泡及卵泡生长情况、卵泡液含量、颗粒细胞层次均与正常组接近，颗粒细胞排列尚整齐；黄体颗粒细胞层次均与正常组接近，颗粒细胞排列尚整齐；黄体数量基本正常。数量基本正常。讨论讨论君君肉肉 桂桂附附 子子鹿角胶鹿角胶臣臣熟地黄熟地黄 枸杞子枸杞子山茱萸山茱萸 淮山药淮山药佐佐使使菟丝子杜 仲当归当归温阳化气温阳化气直补肾阳直补肾阳 滋补肾阴滋补肾阴补养肝脾补养肝脾滋补肝肾滋补肝肾养血活血养血活血共奏养血调经之功共奏养血调经之功垂体性腺轴垂体性腺轴调节作用调节作用 激活巨噬激活巨噬细胞系统细胞系统 调节机体免疫调节机体免疫延缓衰老延缓衰老右归丸右归丸四、讨论四、讨论 不孕症、更年期不孕症、更年期综合症、骨质疏松综合症、骨质疏松 调节卵巢功能调节卵巢功能治疗自身免治疗自身免疫性疾病疫性疾病讨论讨论 TregTregROR-tFOXP-3FOXP-3IL-23IL-17IL-17对机体产生免疫损伤IL-2IL-2初始初始CD4+TCD4+T细胞细胞IL-6IL-6 TGF-TGF- Th17Th17讨论讨论vTh17 /TregTh17 /Treg细胞平衡状态的打破是很多自身免细胞平衡状态的打破是很多自身免疫性疾病发病的重要因素。疫性疾病发病的重要因素。 Th17Th17细胞水细胞水平明显高于平明显高于健康妇女；健康妇女；TregTreg细胞水细胞水平较正常妇女平较正常妇女有增高趋势；有增高趋势；Th17/TregTh17/Treg水水平较正常妇女平较正常妇女明显增高。明显增高。有临床研究通过流式细胞仪检测有临床研究通过流式细胞仪检测POFPOF妇女外周血妇女外周血Th17Th17细胞细胞和和TregTreg细胞的表达，发现细胞的表达，发现POFPOF患者：患者：讨论讨论Th17Th17细胞的过细胞的过度激活度激活TregTreg细胞数目细胞数目减少减少多种相同或不同多种相同或不同细胞因子的正负细胞因子的正负调节。调节。自身免疫自身免疫性性POFPOF讨论讨论降低降低TH17TH17表达表达右归丸平衡平衡Th17/TregTh17/Treg 升高升高E2E2降低降低FSHFSH缓解卵巢损伤，治疗自身免疫性缓解卵巢损伤，治疗自身免疫性POFPOF讨论讨论不管是不管是Th17Th17细胞细胞和和TregTreg细胞还是细胞还是肾阴与肾阳，都肾阴与肾阳，都是相反相成，息是相反相成，息息相关的一对物息相关的一对物质，它们之间必质，它们之间必须保持平衡才能须保持平衡才能维持身体机能的维持身体机能的正常。正常。v右归丸对右归丸对Th17/TregTh17/Treg平平衡的调节可能衡的调节可能是其对肾之阴是其对肾之阴阳平衡调节的阳平衡调节的途径之一。途径之一。1 1 1 1小鼠双后脚掌及腹部皮下多点注射小鼠双后脚掌及腹部皮下多点注射Azp3加弗氏佐剂建立自身免疫性加弗氏佐剂建立自身免疫性POF模型，方模型，方法简便，可行性强法简便，可行性强,死亡率低死亡率低,成功率高。成功率高。2 2 2 2卵巢组织中卵巢组织中Th17蛋白表达水平明显上调，蛋白表达水平明显上调，Treg蛋白表达明显下调及蛋白表达明显下调及Th17/Treg表达表达失衡与自身免疫性卵巢早衰关系密切。失衡与自身免疫性卵巢早衰关系密切。3 3 3 3观察观察右归丸右归丸对对自身免疫自身免疫性性POFPOF小鼠小鼠卵巢组织卵巢组织Th17/TregTh17/Treg蛋白表达，蛋白表达，得出以下结得出以下结论：论：五、结论五、结论4 4 4 4右归丸对右归丸对Th17/Treg平衡的调节可能是其平衡的调节可能是其对肾之阴阳平衡调节的途径之一。对肾之阴阳平衡调节的途径之一。右归丸可以调节自身免疫性右归丸可以调节自身免疫性POF模型小鼠模型小鼠的的FSH和和E2水平及水平及Th17/Treg蛋白表达平蛋白表达平衡。衡。请各位评委老师提请各位评委老师提出宝贵意见！出宝贵意见！结束结束