生物化学实验蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定1蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质及氨基酸的呈色反应1.学习蛋白质的鉴定方法并了解其原理;2.学习氨基酸的鉴定方法并了解其原理.目的要求目的要求2实验内容n双缩脲反应（尿素和蛋白液）n黄色反应（头发，指甲，蛋白液）n茚三酮反应（氨基酸，蛋白质）3原理原理双缩脲反应双缩脲反应双缩脲双缩脲络合物双缩脲4个肽键的氨基与铜离子形成络合物4多肽链双缩脲似络合物原理原理5实验内容实验内容1.加热尿素生成双缩脲加热尿素生成双缩脲,观察双缩脲反应的观察双缩脲反应的颜色变化颜色变化;2.观察透析蛋白液的双缩脲反应的颜色变观察透析蛋白液的双缩脲反应的颜色变化化.双缩脲反应双缩脲反应6n尿素(晶体)n10%氢氧化钠溶液n1%硫酸铜溶液n蛋白液（取鸡蛋清，加6-10倍水混匀，过滤）双缩脲反应双缩脲反应实验试剂实验试剂7n试管及试管架n试管夹n酒精灯实验器材实验器材双缩脲反应双缩脲反应8实验操作n见教材9注意事项注意事项n选用干燥的试管选用干燥的试管,尿素加热时间不能过长尿素加热时间不能过长(1分钟以内分钟以内);n避免加入过量避免加入过量CuSO4 ,否则生成兰色的否则生成兰色的Cu(OH)2能掩盖紫红色能掩盖紫红色.双缩脲反应双缩脲反应10黄色反应酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸硝酸对苯环发生硝化作用，生成黄色的芳香硝基化合物，使蛋白质发生变性反应原理反应原理硝基酚（黄色）邻硝醌酸钠（橙黄色）11实验试剂与器材n见教材12实验操作n见教材13原理原理茚三酮反应茚三酮反应14实验内容实验内容1.蛋白质(蛋白液)的茚三酮反应;2.氨基酸的茚三酮反应.茚三酮反应茚三酮反应15n0.5%茚三酮乙醇溶液n透析蛋白液n0.5%甘氨酸溶液茚三酮反应茚三酮反应实验试剂实验试剂16n试管n试管架n酒精灯n电吹风茚三酮反应茚三酮反应实验器材实验器材17注意事项注意事项n在滤纸上观察茚三酮反应时,滤纸应该跟火焰保持一定距离.茚三酮反应茚三酮反应18思考题思考题1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果,可对水解作用作出什么结论?2.能否利用茚三酮反应可靠的鉴定蛋白质的存在?茚三酮反应茚三酮反应19蛋白质含量测定（设计性实验）2010.420蛋白质的浓度测定方法n根据它们的物理性质，如折射率、比重、吸光值来测定，如蛋白质的紫外吸收法；n利用蛋白质的化学性质，用化学反应的方法测定，如凯氏定氮法、双缩脲法、Folin酚试剂法测定；n还可用染色法，如用氨基黑、考马斯亮蓝-G250测定；n另外还可用萤光激发、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法测定。n上述方法中，紫外吸收法、双缩脲法、Folin酚试剂法、凯氏定氮法、考马斯亮蓝染色法最为常用，它们操作相对简单，不需要昂贵的设备。以下主要介绍这几种方法。21双缩脲法测定蛋白质含量原理：在碱性溶液中蛋白质与铜离予形成紫红色络合物，可在540nm比色测定，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸组成无关，该法测定的蛋白质浓度范围为1-10g/l。22器材试剂n双缩脲试剂n标准蛋白液（牛血清白蛋白）n分光光度计n离心机23实验操作n尽量详细，涉及计算的最好提前计算好；n提前掌握相关仪器设备的使用24紫外吸收法测定蛋白质含量n由干蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm处有一个紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在280nm的光吸收值与其浓度成正比，因此可作定量测定，该法测定蛋白质的浓度范围为0l1g/L。25器材试剂n分光光度计n离心机26实验操作n标准曲线制备27考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量n原理：考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质结合后，变为蓝色，可在590nm处比色测定，该法反应快、操作简便，消耗样品最少。n缺点：不同蛋白质之间差异大（why?），且标准曲线线性较差。测定蛋白质的浓度范围为0.01-1.0g/l。28器材试剂n考马斯亮蓝G-250染色液配制29实验操作n标准曲线制备n待测样品测定30重点难点n测定方法的选择；n待测蛋白质的选材（蛋白质的含量；蛋白质种类；干扰因素）；n制备蛋白质溶液（尽可能多的含有目标蛋白，澄清，无沉淀）；n标准曲线制备（待测蛋白液浓度在标准曲线中间）。31 蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定原理原理32测定白明胶的等电点:配置不同PH值的缓冲液,加入白明胶后,再加入脱水剂,观察溶液的浑浊程度,指出等电点蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定实验内容实验内容33n0.1mol/l醋酸钠溶液n0.1mol/l醋酸溶液n95%乙醇n1%白明胶溶液n1mol/l醋酸溶液蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定实验试剂实验试剂34n试管4支(大)n试管架n吸量量管(5毫升2支,2毫升3支,1毫升1支)蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定实验器材实验器材35蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定36n白明胶应先在水浴锅加热,搅拌并溶解,待完全溶解才能使用;n滴加乙醇时应边加边振荡.蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定注意事项注意事项37n什么是蛋白质的等电点?n蛋白质在等电点溶液中必然沉淀,请结合蛋白质的胶体性质说明以上结论对吗?蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定思考题思考题38氨基酸的甲醛滴定n2011.339实验目的n掌握甲醛滴定法测量氨基酸含量的原理和方法40实验原理n氨基酸是两性电解质，在水溶液中达水解平衡是弱酸，完全解离时pH为1112或更高；n一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。41指示剂名称指示剂名称低低pH值时颜色值时颜色过渡、转变颜色的过渡、转变颜色的pH范围范围高高pH值时颜色值时颜色石蕊红4.5 - 8.3蓝酚酞无色8.2 - 10.0粉红酚红黄6.6 - 8.0红甲基橙红3.1 - 4.4黄甲基紫黄0.0 - 1.6紫蓝甲基黄红2.9 - 4.0黄甲基红红4.2 - 6.3黄刚果红蓝3.0 - 5.2红百里酚蓝黄8.0 - 9.6蓝孔雀石绿黄0.2 - 1.8蓝绿溴甲酚绿黄3.8 - 5.4蓝绿溴甲酚紫黄5.2 - 6.8紫溴酚蓝黄3.0 - 4.6紫溴百里酚蓝黄6.0 - 7.6蓝百里酚酞无色9.4 - 10.6蓝42实验原理43R-CH-COOHR-CH-COOHNH2甲醛N(CH20H)2(氨基酸)(二羟甲基氨基酸）PK:10-12PK:7酚酞（PH9左右由无色变成粉红色）PK：氨基酸完全解离时的PH值实验原理44实验试剂和器材三、器材三、器材1锥形瓶2吸量管（2mL、5mL）3碱式滴定管、滴定台、蝴蝶夹四、试剂四、试剂101m01L标准甘氨酸溶液201molL标准氢氧化钠溶液3.0.5酚酞指示剂4. 中性甲醛溶液中性甲醛溶液45实验操作n1取3个25mL的锥形瓶，编号。向第1、2号瓶内各加入2mL0.01molL的标准甘氨酸溶液和1-2滴酚酞指示剂,向3号瓶内加入2mL水1-2滴酚酞指示剂;然后向1号瓶中加入4mL甲醛溶液，混匀，再向1号瓶滴加0.01molL标准氢氧化钠溶液至溶液显微红色。向2、3号瓶中各加入4mL甲醛溶液，混匀，再分别向2、3号瓶滴加0.01molL标准氢氧化钠溶液至1号瓶颜色。46重复以上实验2次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的mL数。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。 氨基氮的实际测得量： 氨基氮(mg/ml)=（V2-V3）0.14008/2 甘氨酸氨基氮回收率= 实际测得量 / 理论加入量 100%实验操作C2H2NO247482.取未知浓度的甘氨酸溶液2ml，依上述方法进行测定，平行做2份，取平均值。计算每ml甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg数。氨基氮(mg/ml)=（V2-V3）0.14008/2实验操作4950注意事项n配制中性甲醛溶液时，密切观察溶液颜色变化（酚酞的呈色范围8.2-10.0，粉红-紫红）；n滴加氢氧化钠时，一定要边滴边摇晃；51PHNaOH2.54.39.7A B7.0突跃范围滴定误差52