限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 连接酶连接酶 核酸酶核酸酶 基因工程的工具酶基因工程的工具酶1核酸酶（核酸酶（nucleases）1.核酸外切酶核酸外切酶2. 核酸内切酶核酸内切酶2DNA分子糖分子糖-磷酸主键的破坏称为磷酸主键的破坏称为切口切口（nick）DNA分子中核苷酸缺失称为分子中核苷酸缺失称为缺口缺口（gap）连接修复连接修复3端羟基和端羟基和5端磷酸基团，形成端磷酸基团，形成3-5磷酸二酯键磷酸二酯键连接酶连接酶 DNA ligase T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶3T4-DNA连接酶（连接酶（T4-DNA Ligase）来源于来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌噬菌体感染的大肠杆菌连接双链连接双链DNA上的单链口（上的单链口（Nick），），亦可连接限亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端。制内切酶所产生的粘性末端。连接平头双链连接平头双链DNA速度很慢，在高浓度的底物和速度很慢，在高浓度的底物和酶的作用下方可进行，分子之间的连接。酶的作用下方可进行，分子之间的连接。反应条件：反应条件： pH为为7.57.6， 平端连接用平端连接用20-25，粘端连接用，粘端连接用12左右。左右。Use4Animation of the ligation process. When the sticky ends of two DNA fragments come together and hydrogen bond through the A-T and G-C pairing, the enzyme LIGASE will form covalent bonds between the two fragments.5The Specific Cutting and Ligation of DNAGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGAATTCGGCTTAAGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGEcoRIDNA LigaseEcoRI sticky endEcoRI sticky end6DNA聚合酶（以聚合酶（以DNA为模板合成为模板合成DNA）RNA聚合酶（以聚合酶（以DNA为模板合成为模板合成RNA）逆转录酶（以逆转录酶（以RNA为模板合成为模板合成DNA）聚合酶（聚合酶（polymerase）7大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I(大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I )Klenow片段片段T4 DNA聚合酶聚合酶T7 DNA聚合酶聚合酶Taq DNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶DNA聚合酶聚合酶8一、大肠杆菌DNA聚合酶 I1 三种酶活性1 ）DNA聚合活性聚合活性 dTTP33 A T G C A A T T G C 5 | | | |5 T A C G ppi T 1、聚合反应具有方向性: 5 3 2、DNA 聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的 3- OH 逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。93 33 3引物引物引物引物102）核酸外切酶活性）核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G 533 5 5外切酶活性外切酶活性 55 3 3外切酶活性外切酶活性能切除突变的能切除突变的 DNADNA片段片段能辨认错配的碱基对，并将其水解能辨认错配的碱基对，并将其水解11532 应用应用1)切口移位法标记DNA 在DNase的作用基础上产生链内切口，应用此酶的53聚合酶活性和53外切核酸酶活性的同步联合反应，使切口沿DNA链从5-端向3-端移动。若用于聚合反应的原料dNTP带有放射性核素32P，就能使生成的双链带有标记物。121353532) 3-粘端的末端标记 先利用此酶的35外切核酸酶活性，切除凸出的3-粘端，形成5-凸出粘端；再以其53聚合酶活性使其补平，在高浓度的dNTP条件下，使3-端的外切反应与dNTP的搀入反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3-末端带标记的DNA。14裂解裂解变性变性显影153 合成cDNA的第二链cDNA535316 53聚合酶活性：催化单核苷酸到聚合酶活性：催化单核苷酸到 DNA 3-OH端端 35外切酶活性：从游离的外切酶活性：从游离的3端降解单核苷酸端降解单核苷酸 53外切酶活性：从游离的外切酶活性：从游离的5端降解双链端降解双链DNA成为成为 单核苷酸单核苷酸大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（E.coli DNA pol I）1. 随机引物标记核酸探针2. 5-粘端补平或3端标记3. 合成cDNA的第二链4. DNA序列分析5. 3-端的末端标记应用应用17小片段小片段N N 端端端端C C 端端端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段 （ Klenow 片段片段 ） DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性18 蛋白酶降解蛋白酶降解DNA聚合酶聚合酶 I 获得其大片段称为获得其大片段称为Klenow片段片段，只有只有 53聚合酶活性聚合酶活性, 35外切酶活性。外切酶活性。Use催化催化DNA切口平移反应，制备探针切口平移反应，制备探针对对DNA分子进行末端标记分子进行末端标记19催化以催化以 RNA 为模板的为模板的 DNA 聚合反应聚合反应催化合成出催化合成出互补互补DNA（cDNA）可构建可构建cDNA文库文库Usecomplementary DNA二、反二、反(逆逆)转录酶转录酶 ( RNA依赖依赖/指导的指导的DNA聚合聚合酶酶 )20催化催化dNTP DNA分子中分子中3-OH端端给载体或给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴加上互补的多聚体尾巴; DNA片断片断3末端标记末端标记 在在Mg2+ 条件下，选择条件下，选择3OH端单链端单链DNA为引物加成核苷酸，在为引物加成核苷酸，在Co2+ 存在的条存在的条件下，选择件下，选择3OH端双链端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。 末端转移酶末端转移酶（TdT）5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdT MgMg2+2+ dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs215 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+ , , dATPdATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+ dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 AAAAAAAAAAA22催化切除催化切除DNA、RNA和和dNTP上的上的5磷酸基团磷酸基团切除切除5磷酸防止自身连接磷酸防止自身连接标记前去除标记前去除5磷酸磷酸 Use5P-DNA 5OH-DNA+Pi5P-RNA 5OH-RNA+Pi碱性磷酸酶碱性磷酸酶(去除去除5P )常用的碱性磷酸酶常用的碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，BAP）小牛肠碱性磷酸酶（小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）23Use标记标记DNA链的链的5端端连接反应中磷酸化连接反应中磷酸化将将NTP的的-磷酸转移到磷酸转移到ds/ss DNA/RNA的的5-OH来源于来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌噬菌体感染的大肠杆菌T4-多核苷酸多核苷酸(磷酸磷酸)激酶（激酶（T4-Polynucleotide kinase）24DNaseRNase核酸酶核酸酶S1水解水解DNA水解水解RNA降解单链降解单链DNA和和RNA用量增大可降解双链核酸，用于切去双链用量增大可降解双链核酸，用于切去双链-cDNA合成中产生的发夹环。合成中产生的发夹环。核酸酶核酸酶25重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，羟基末端之间形成磷酸二酯键，使使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚聚合、合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基26