组织细胞的三维培养组织细胞的三维培养学生：张旭朗学生：张旭朗 导师：马小军导师：马小军 研究员研究员2005518Seminar 组织细胞的三维培养 概念概念 三维培养的构成三维培养的构成 三维培养的特点三维培养的特点 三维培养的方法三维培养的方法 研究方法研究方法 三维培养的应用三维培养的应用 展望展望组织细胞的三维培养一、三维培养的概念一、三维培养的概念 相对于单层细胞的二维培养而言，利用相对于单层细胞的二维培养而言，利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长，形成类似体内组织的结构，发式生长，形成类似体内组织的结构，发挥其功能挥其功能组织细胞的三维培养二、三维培养的构成二、三维培养的构成1 1、辅助物：人工软骨、辅助物：人工软骨1111、PETPET聚乙烯酯聚乙烯酯2222、纤维蛋白支架纤维蛋白支架3333、胶原支架、胶原支架4-54-54-54-5、旋转生、旋转生物反应器物反应器6666、微胶囊、微胶囊7777、中空纤维、中空纤维88882 2、细胞：原代组织细胞大鼠肝、软骨、细胞：原代组织细胞大鼠肝、软骨、 脂肪脂肪9999、成骨样细胞、干细胞、成骨样细胞、干细胞10101010、 肿瘤肿瘤细胞细胞11111111组织细胞的三维培养三、三维培养的特点三、三维培养的特点1 1、生长特点：三维结构、异质性、生长速、生长特点：三维结构、异质性、生长速率及氧气、葡萄糖等梯度分布率及氧气、葡萄糖等梯度分布2 2、组织学特点：细胞分三层（直径、组织学特点：细胞分三层（直径300300m m） 可有类似组织基质的物质产生可有类似组织基质的物质产生3 3、生长动力学：三维培养细胞以、生长动力学：三维培养细胞以G G1 1/G/G0 0期细期细胞占优势，胞占优势，S S期细胞较少期细胞较少 组织细胞的三维培养四、三维培养的方法四、三维培养的方法1 1、旋转式培养：旋转细胞培养系统或培养、旋转式培养：旋转细胞培养系统或培养瓶，旋转生物反应器同时产生较多量直瓶，旋转生物反应器同时产生较多量直径为径为1 12mm2mm的细胞球的细胞球2 2、非黏附物包被的培养瓶或培养皿：琼脂、非黏附物包被的培养瓶或培养皿：琼脂、琼脂糖、蛋白聚糖、聚苯乙烯琼脂糖、蛋白聚糖、聚苯乙烯3 3、支架、支架组织细胞的三维培养五、研究方法五、研究方法1 1、细胞生长及形态：体积直径、细胞生长及形态：体积直径 免疫组化（免疫组化（BrdUBrdU、PCNAPCNA、Ki-67Ki-67） 流式细胞仪（流式细胞仪（DNADNAHoechst33342Hoechst33342、PIPI） 电镜电镜2 2、细胞球的生理特性：微电极（、细胞球的生理特性：微电极（pO2 or pHpO2 or pH） NMR( NMR(脂代谢脂代谢) ) 生物体发光技术（生物体发光技术（ATPATP、LactateLactate、glucoseglucose）组织细胞的三维培养六、三维培养的应用六、三维培养的应用1 1、实验性治疗、实验性治疗 放射效应放射效应12121212：分化程度影响放疗效：分化程度影响放疗效果果 药物耐受药物耐受13131313：培养方式是决定耐药：培养方式是决定耐药的因素之一的因素之一 免疫疗法免疫疗法14141414：肿瘤细胞与免疫细胞：肿瘤细胞与免疫细胞作用作用组织细胞的三维培养2 2、代谢及代谢环境研究、代谢及代谢环境研究 三维培养的细胞可模拟肿瘤生成中的无三维培养的细胞可模拟肿瘤生成中的无血管阶段、微转移灶或毛细血管之间的血管阶段、微转移灶或毛细血管之间的微区域微区域 模拟在体细胞的环境：模拟在体细胞的环境： 良好生长环境良好生长环境 缺氧、缺乏营养、废物积聚或缺氧、缺乏营养、废物积聚或pHpH降低降低等协同作用等协同作用“toxic “toxic enviroment” enviroment” 15151515组织细胞的三维培养3 3、细胞的生物学特性、细胞的生物学特性 浸润和转移：肿瘤细胞和基质共培养浸润和转移：肿瘤细胞和基质共培养（E-cadherinE-cadherin、 ICAM-1 ICAM-1 ）16,1716,1716,1716,17 细胞黏附：研究细胞聚集过程中黏附细胞黏附：研究细胞聚集过程中黏附因子的作用因子的作用18181818 血管形成：血管形成： VEGF VEGF（血管内皮生长因（血管内皮生长因子）在恶性肿瘤血管形成中起主要作用子）在恶性肿瘤血管形成中起主要作用19191919组织细胞的三维培养4 4、实验性组织模型、实验性组织模型 移植物以组织或器官的方式培养，使移植物以组织或器官的方式培养，使其在一定时间内保持原有功能其在一定时间内保持原有功能 简单的讲：使细胞自发或借助人工基简单的讲：使细胞自发或借助人工基质聚集并诱导细胞分化、维持细胞功能质聚集并诱导细胞分化、维持细胞功能 举例：人工肝（肝细胞、纤维细胞等举例：人工肝（肝细胞、纤维细胞等与明胶海绵、琼脂、胶原共培养）与明胶海绵、琼脂、胶原共培养）20-2220-2220-2220-22组织细胞的三维培养5 5、胚体干细胞与拟胚体、胚体干细胞与拟胚体 胚胎发育到囊胚期，此时细胞分化为胚胎发育到囊胚期，此时细胞分化为两大类，即位于周边的滋养层细胞和位两大类，即位于周边的滋养层细胞和位于腔内但居于一端的内细胞团（于腔内但居于一端的内细胞团（inner inner cell mass ICMcell mass ICM）。只有）。只有ICMICM将来发育成将来发育成胚胎本身，把胚胎本身，把ICMICM从胚胎中分离出来在一从胚胎中分离出来在一定条件下培养，可形成具有无限增殖能定条件下培养，可形成具有无限增殖能力的细胞群，称为胚胎干细胞力的细胞群，称为胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESembryonic stem cells,ES细胞）细胞） 当当ESES细胞经过细胞经过2 2天悬滴培养、天悬滴培养、2 2天悬浮天悬浮培养后，可形成简单拟胚体（培养后，可形成简单拟胚体（3 3D D），），拟胚体内包含着来源于三个胚层的不同拟胚体内包含着来源于三个胚层的不同细胞细胞 组织细胞的三维培养微囊化肿瘤细胞用于药筛微囊化肿瘤细胞用于药筛组织细胞的三维培养1 1、抗肿瘤药物筛选的研究现状、抗肿瘤药物筛选的研究现状 多采用体外单层培养的肿瘤细胞：简单、多采用体外单层培养的肿瘤细胞：简单、易操作、费用低、可大量应用、生长方易操作、费用低、可大量应用、生长方式及环境与在体肿瘤差距较大式及环境与在体肿瘤差距较大 动物实验：费用高、生存条件苛刻、生动物实验：费用高、生存条件苛刻、生长方式及环境与在体相似长方式及环境与在体相似 手术切除标本：回顾性研究、不能动态手术切除标本：回顾性研究、不能动态观察观察 体外三维培养：模拟肿瘤生长方式及环体外三维培养：模拟肿瘤生长方式及环境、可大量应用、费用较低，如境、可大量应用、费用较低，如MCTSMCTS组织细胞的三维培养肿瘤细胞在体与体外三维生长示意图肿瘤细胞在体与体外三维生长示意图组织细胞的三维培养2、微囊化细胞三维共培养特点、微囊化细胞三维共培养特点微胶囊为半透膜微胶囊为半透膜细胞呈三维立体生长细胞呈三维立体生长生长空间可控生长空间可控空间相对封闭空间相对封闭“被动被动”共培养共培养实质与间质细胞共培养实质与间质细胞共培养- -模拟体内模拟体内组织细胞的三维培养3 3、微囊化肿瘤细胞的三维培养、微囊化肿瘤细胞的三维培养材料：海藻酸钠，聚赖氨酸，人乳腺癌材料：海藻酸钠，聚赖氨酸，人乳腺癌 细胞系细胞系MCF-7方法：静电液滴法方法：静电液滴法组织细胞的三维培养Day 7Day 0Day 5Day 2Day 2组织细胞的三维培养4 4、药物对三维生长细胞的抑制、药物对三维生长细胞的抑制药物：丝裂霉素（药物：丝裂霉素（MCMC）、阿霉素（）、阿霉素（ADMADM）、）、5 5氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5 5FUFU）浓度和作用时间：浓度和作用时间：0.1ppc,1ppc0.1ppc,1ppc及及10ppc10ppcPeak plasma concentration (ppc), the highest level of drug that can Peak plasma concentration (ppc), the highest level of drug that can be obtained in the blood usually following multiple doses, of ADM, be obtained in the blood usually following multiple doses, of ADM, MC and 5-FU was 0.4 MC and 5-FU was 0.4 g/mL, 3.0 g/mL, 3.0 g/mL and 10 g/mL and 10 g/mL,g/mL, respectively respectively. .分别作用分别作用24h, 48h, 72h24h, 48h, 72h组织细胞的三维培养bgafhc组织细胞的三维培养ejid组织细胞的三维培养*组织细胞的三维培养a*b*组织细胞的三维培养a*b*组织细胞的三维培养七、展望七、展望 胚胎干细胞的应用研究及胚胎发育胚胎干细胞的应用研究及胚胎发育 致癌机制的研究致癌机制的研究组织细胞的三维培养reference1.DarlingEM,AthanasiouKA.RetainingZonalChondrocytePhenotypebyMeansofNovelGrowthEnvironments.1.DarlingEM,AthanasiouKA.RetainingZonalChondrocytePhenotypebyMeansofNovelGrowthEnvironments.TissueEng.2005March/April;11(3-4):395-403.TissueEng.2005March/April;11(3-4):395-403.2.XieY,YangST,KnissDA.Three-dimensionalcell-scaffoldconstructspromoteefficientgenetransfection:implications2.XieY,YangST,KnissDA.Three-dimensionalcell-scaffoldconstructspromoteefficientgenetransfection:implicationsforcell-basedgenetherapy.TissueEng.2001Oct;7(5):585-98.forcell-basedgenetherapy.TissueEng.2001Oct;7(5):585-98.3.BiancoF,BasiniG,GrasselliF.Angiogenicactivityofswinegranulosacells:effectsofhypoxiaandvascularendothelial3.BiancoF,BasiniG,GrasselliF.Angiogenicactivityofswinegranulosacells:effectsofhypoxiaandvascularendothelialgrowthfactorTrapR1R2,aVEGFblocker.growthfactorTrapR1R2,aVEGFblocker.DomestAnimEndocrinol.2005Apr;28(3):308-19.Epub2005Jan26.DomestAnimEndocrinol.2005Apr;28(3):308-19.Epub2005Jan26.4.FreyriaAM,CortialD,RonziereMC,GuerretS,HerbageD.Influenceofmediumcomposition,staticandstirred4.FreyriaAM,CortialD,RonziereMC,GuerretS,HerbageD.Influenceofmediumcomposition,staticandstirredconditionsontheproliferationofandmatrixproteinexpressionofbovinearticularchondrocytesculturedina3-Dconditionsontheproliferationofandmatrixproteinexpressionofbovinearticularchondrocytesculturedina3-Dcollagenscaffold.collagenscaffold.Biomaterials.2004Feb;25(4):687-97.Biomaterials.2004Feb;25(4):687-97.5.5.朱如里，高学纯，王明丽等。朱如里，高学纯，王明丽等。 胶原海绵与兔软骨细胞体外三维培养的实验研究。中国骨伤胶原海绵与兔软骨细胞体外三维培养的实验研究。中国骨伤20022002，1515：757576766.K.J.Dabos,L.J.Nelson,J.N.Plevris,M.M.Dollinger,C.Hewage,I.H.SadlerandP.C.Hayes.Microgravity6.K.J.Dabos,L.J.Nelson,J.N.Plevris,M.M.Dollinger,C.Hewage,I.H.SadlerandP.C.Hayes.Microgravityenvironmentinarotarycellculturesystem(RCCS)promotescellaggregationandmaintainsdifferentiationandenvironmentinarotarycellculturesystem(RCCS)promotescellaggregationandmaintainsdifferentiationandproliferationofprimaryporcinehepatocytesproliferationofprimaryporcinehepatocytes. . JournalofHepatology,1998,28(Supplement1):62.JournalofHepatology,1998,28(Supplement1):62.7.H.Z.Kupchik,R.S.Langer,C.Haberern,S.ElDerinyandM.OBrien.Anewmethodforthethree-dimensionalinvitro7.H.Z.Kupchik,R.S.Langer,C.Haberern,S.ElDerinyandM.OBrien.Anewmethodforthethree-dimensionalinvitrogrowthofhumancancercells.growthofhumancancercells. ExperimentalCellResearch.(1983)147:454-460.ExperimentalCellResearch.(1983)147:454-460.8.E.Curcio,L.DeBartolo,G.Barbieri,M.Rende,L.Giorno,S.MorelliandE.Drioli.Diffusiveandconvectivetransport8.E.Curcio,L.DeBartolo,G.Barbieri,M.Rende,L.Giorno,S.MorelliandE.Drioli.DiffusiveandconvectivetransportthroughhollowfibermembranesforlivercellculturethroughhollowfibermembranesforlivercellcultureJournalofBiotechnology.(2005)117:309-321.JournalofBiotechnology.(2005)117:309-321.9.KangX,XieY,KnissDA.AdiposeTissueModelUsingThree-DimensionalCultivationofPreadipocytesSeededonto9.KangX,XieY,KnissDA.AdiposeTissueModelUsingThree-DimensionalCultivationofPreadipocytesSeededontoFibrousPolymerScaffolds.FibrousPolymerScaffolds.TissueEng.2005Mar-Apr;11(3-4):458-68.TissueEng.2005Mar-Apr;11(3-4):458-68.10.Wan-JuLi,RichardTuli,XiaoxueHuang,PatriceLaquerriereandRockyS.TuanMultilineagedifferentiationof10.Wan-JuLi,RichardTuli,XiaoxueHuang,PatriceLaquerriereandRockyS.TuanMultilineagedifferentiationofhumanmesenchymalstemcellsinathree-dimensionalnanofibrousscaffold.Biomaterials,2005,26(25):5158-5166.humanmesenchymalstemcellsinathree-dimensionalnanofibrousscaffold.Biomaterials,2005,26(25):5158-5166.组织细胞的三维培养11.MelvinSchindler,IjazAhmed,JabeenKamal,AlamNur-E-Kamal,TimothyH.Grafe,H.YoungChungandSally11.MelvinSchindler,IjazAhmed,JabeenKamal,AlamNur-E-Kamal,TimothyH.Grafe,H.YoungChungandSallyMeiners.Asyntheticnanofibrillarmatrixpromotesinvivo-likeorganizationandmorphogenesisforcellsinculture.Meiners.Asyntheticnanofibrillarmatrixpromotesinvivo-likeorganizationandmorphogenesisforcellsinculture.Biomaterials,2005,26(28):5624-5631.Biomaterials,2005,26(28):5624-5631. 12.Stuschke,M.,V.Budach,G.Stuben,C.Streffer,andH.Sack.Heterogeneityinthefractionationsensitivitiesofhuman12.Stuschke,M.,V.Budach,G.Stuben,C.Streffer,andH.Sack.Heterogeneityinthefractionationsensitivitiesofhumantumorcelllines:studiesinathree-dimensionalmodelsystem.Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.1995(32):395408.tumorcelllines:studiesinathree-dimensionalmodelsystem.Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.1995(32):395408.13.Graham,C.H.,H.Kobayashi,K.S.Stankiewicz,S.Man,S.J.Kapitain,andR.S.Kerbel.Rapidacquisitionof13.Graham,C.H.,H.Kobayashi,K.S.Stankiewicz,S.Man,S.J.Kapitain,andR.S.Kerbel.Rapidacquisitionofmulticellulardrugresistanceafterasingleexposureofmammarytumorcellstoantitumoralkylatingagents.J.Natl.multicellulardrugresistanceafterasingleexposureofmammarytumorcellstoantitumoralkylatingagents.J.Natl.CancerInst.(1994)86:975982.CancerInst.(1994)86:975982.14.Jaaskelainen,J.,E.Lehtonen,P.Heikkila,P.Kalliomaki,andT.Timonen.DamagetomulticellularhumanH-2glioma14.Jaaskelainen,J.,E.Lehtonen,P.Heikkila,P.Kalliomaki,andT.Timonen.DamagetomulticellularhumanH-2gliomaspheroidsincubatedwithLAKcells:anultrastructuralstudy.J.Natl.CancerInst.(1990)82:497501.spheroidsincubatedwithLAKcells:anultrastructuralstudy.J.Natl.CancerInst.(1990)82:497501.15.Lord,E.M.,L.Harwell,andC.J.Koch.Detectionofhypoxiccellsbymonoclonalantibodyrecognizing2-15.Lord,E.M.,L.Harwell,andC.J.Koch.Detectionofhypoxiccellsbymonoclonalantibodyrecognizing2-nitroimidazoleadducts.CancerRes.(1993)53:57215726nitroimidazoleadducts.CancerRes.(1993)53:5721572616.Bracke,M.E.,B.M.Vyncke,E.A.Bruyneel,S.J.Vermeulen,G.K.DeBruyne,N.A.VanLarebeke,K.Vleminckx,F.16.Bracke,M.E.,B.M.Vyncke,E.A.Bruyneel,S.J.Vermeulen,G.K.DeBruyne,N.A.VanLarebeke,K.Vleminckx,F.M.VanRoy,andM.M.Mareel.Insulin-likegrowthfactorIactivatestheinvasionsuppressorfunctionofEcadherininM.VanRoy,andM.M.Mareel.Insulin-likegrowthfactorIactivatestheinvasionsuppressorfunctionofEcadherininMCF-7humanmammarycarcinomacellsinvitro.Br.J.Cancer(1993)68:282289.MCF-7humanmammarycarcinomacellsinvitro.Br.J.Cancer(1993)68:282289.17.BradyKalnay,S.M.,E.R.Boghaert,S.Zimmer,D.R.Soll,andR.Brackenbury.InvasionbyWC5ratcerebellarcells17.BradyKalnay,S.M.,E.R.Boghaert,S.Zimmer,D.R.Soll,andR.Brackenbury.InvasionbyWC5ratcerebellarcellsisindependentofRSV-inducedchangesingrowthandadhesion.Int.J.Cancer(49):239245.isindependentofRSV-inducedchangesingrowthandadhesion.Int.J.Cancer(49):239245.18.Kitsuki,H.,M.Katano,T.Morisaki,andM.Torisu.CEAmediatedhomotypicaggregationofhumancolorectal18.Kitsuki,H.,M.Katano,T.Morisaki,andM.Torisu.CEAmediatedhomotypicaggregationofhumancolorectalcarcinomacellsinamalignanteffusion.CancerLett.(1995)88:713.carcinomacellsinamalignanteffusion.CancerLett.(1995)88:713.19.Abramovitch,R.,G.Meir,andM.Neeman.NeovascularizationinducedgrowthofimplantedC6gliomamulticellular19.Abramovitch,R.,G.Meir,andM.Neeman.NeovascularizationinducedgrowthofimplantedC6gliomamulticellularspheroids:magneticresonancemicroimaging.CancerRes.(1995)55:19561962.spheroids:magneticresonancemicroimaging.CancerRes.(1995)55:19561962.20.Lin,K.H.,S.Maeda,andT.Saito.Long-termmaintenanceofliver-specificfunctionsinthree-dimensionalcultureof20.Lin,K.H.,S.Maeda,andT.Saito.Long-termmaintenanceofliver-specificfunctionsinthree-dimensionalcultureofadultrathepatocyteswithaporousgelatinspongesupport.Biotechnol.Appl.Biochem.(1995)21:1927.adultrathepatocyteswithaporousgelatinspongesupport.Biotechnol.Appl.Biochem.(1995)21:1927.21.Shiraha,H.,N.Koide,H.Hada,K.Ujike,M.Nakamura,T.Shinji,S.Gotoh,andT.Tsuji.Improvementofserumamino21.Shiraha,H.,N.Koide,H.Hada,K.Ujike,M.Nakamura,T.Shinji,S.Gotoh,andT.Tsuji.Improvementofserumaminoacidprohepaticfailurewiththebioartificialliverusingmulticellularhepatocytespheroids.Biotechnol.Bioeng.acidprohepaticfailurewiththebioartificialliverusingmulticellularhepatocytespheroids.Biotechnol.Bioeng.(1996)50:416421.(1996)50:416421.22.Nishikawa,Y.,Y.Tokusashi,T.Kadohama,H.Nishimori,andK.Ogawa.Hepatocyticcellsformbileduct-like22.Nishikawa,Y.,Y.Tokusashi,T.Kadohama,H.Nishimori,andK.Ogawa.Hepatocyticcellsformbileduct-likestructureswithinathree-dimensionalcollagengelmatrix.Exp.CellRes.(1996)223:357371.structureswithinathree-dimensionalcollagengelmatrix.Exp.CellRes.(1996)223:357371. . 组织细胞的三维培养谢谢组织细胞的三维培养1998BlackwellScienceLtd.InternationalJournalofExperimentalPathology79,1-23组织细胞的三维培养