第三章第三章 培养基及其制备培养基及其制备培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的的多种营养物质的混合物。所需要的、按一定比例配制的的多种营养物质的混合物。培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制、产品的质量和产量都有重要的影响。研究微生物的营养，主要是了解微生物的营养特性和培养条件，以便进一步控制和利用它们，更好地为工业生产服务。微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的酶，将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助于细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现的。第一节第一节 培养基的选择与制备培养基的选择与制备 一、培养基的类型和用途一、培养基的类型和用途 根据来源可分为根据来源可分为: 天然培养基天然培养基(complex /undefined medium): 合成培养基合成培养基(defined medium): 半合成培养基半合成培养基(semi-defined medium)：根据使用目的可分为根据使用目的可分为: （生物生物）鉴别培养基鉴别培养基(differential medium) 选择培养基选择培养基(selected medium)：根据形状可分为根据形状可分为: 固体培养基（固体培养基（solid medium）：）： 半固体培养基（半固体培养基（semi-solid medium）：）： 液体培养基（液体培养基（ liquid medium）：根据生产工艺的要求可分为根据生产工艺的要求可分为: 孢子培养基（孢子培养基（ spore medium ）： 制备孢子用的培养基。要求菌种在这种培养基上能形成大量的优质孢子优质孢子，但不能引起菌种的变异。该培养基的基质浓度（有机氮）基质浓度（有机氮）要低些要低些，否则影响孢子的的形成。无机盐要适量无机盐要适量，否则影响孢子的数量和质量。 常用的有麸皮、大（小）米，由葡萄糖、无机盐、蛋白胨等配制的琼脂 斜面培养基。 种子培养基（种子培养基（ seed medium ）：）： 供孢子发芽和菌体生长用的培养基。营养成分应是易于被菌体吸收利用，且完全丰富。其中N源和维生素的含量应高些，但总浓源和维生素的含量应高些，但总浓度以略稀薄为宜，以便菌体生长繁殖度以略稀薄为宜，以便菌体生长繁殖。为使培养的种子能较快适应发酵罐内的环境，在设计种子培养基时要考虑与发酵培养基组成的在设计种子培养基时要考虑与发酵培养基组成的内在联系内在联系。发酵培养基（发酵培养基（fermentation medium）： 供菌体生长和合成大量代谢产物用的培养基。要求此种培养基的组成丰富完整，营养成分浓度和粘度适中，即利于菌体生长，又利于合成大量的代谢产物利于菌体生长，又利于合成大量的代谢产物。 发酵培养基的组成要考虑菌体在发酵过程中的各种生化代谢的协调，在产物合成期，使发酵液pH值不出现大的波动。不同的菌体，不同的产品，对培养基的要求是不同的。不同的发酵产品，培养基的状态、粘度、各成分的含量也是不同的。但是，基本的营养需求是一致。因此，应根据不同的情况选择发酵培养基。二、培养基选择的依据1.根据不同菌种或细胞的特点2.根据不同的用途3.根据不同的目的4.根据经济效益分析选择培养基 三、发酵培养基选择的原则：三、发酵培养基选择的原则： 1必须提供必须提供合成细胞和发酵产物合成细胞和发酵产物的基本成分。的基本成分。 2有利于有利于提高培养基中产物的浓度提高培养基中产物的浓度，以提高单位容积发酵罐，以提高单位容积发酵罐的生产能力。的生产能力。 3有利于有利于提高产物的合成速度，提高产物的合成速度，缩短发酵周期。缩短发酵周期。 4尽量尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化减少副产物的形成，便于产物的分离纯化 5有利于有利于减少培养基原料的单耗。减少培养基原料的单耗。(合成单位数量的产物所消耗的合成单位数量的产物所消耗的营营养物质的量）养物质的量）,以提高转化率。以提高转化率。 6原料价格低廉，质量稳定，取材容易。原料价格低廉，质量稳定，取材容易。 7所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率降低能耗，并尽可能减少产生提高氧的利用率降低能耗，并尽可能减少产生“三废三废”的物质。的物质。 实际生产中需根据具体情况，抓主要环节。使其即实际生产中需根据具体情况，抓主要环节。使其即满足满足细胞的营养要求，又能获得优质高产的的产品，同时也符合细胞的营养要求，又能获得优质高产的的产品，同时也符合增产节约，因地制宜的原则增产节约，因地制宜的原则。 发酵培养基的主要作用是为了发酵培养基的主要作用是为了获得预期的产物，获得预期的产物，应根据应根据产物特点来设计培养基。产物特点来设计培养基。 发酵培养基必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。 对于大规模发酵生产，除考虑上述细胞的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。 Q：能作为发酵培养基碳源、氮源的物质有哪些？能作为发酵培养基碳源、氮源的物质有哪些？ 培养基成分配比的选择培养基成分配比的选择培养基： 组分（包括这些组分的来源和加工方法） 配比 缓冲能力 粘度 消毒后营养破坏的程度 原料的杂质含量 对菌体生长和产物形成有影响。目前只能在生物化学、细胞生物学等基本理论指导下，参照前人所使用的较合适于某一类细胞的经验配方经验配方，再结合所用菌种和产品的特征，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，对C、N、无机盐和前体等进行逐个单因子试验单因子试验，观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响。最后再综合各因素的影响，采用正交试验或均匀设计正交试验或均匀设计得到一个适合该菌种的生产配方，以获得高产。四、配制培养基应注意的问题配制培养基应注意的问题 考虑碳源、氮源时，要注意快速利用碳氮源和考虑碳源、氮源时，要注意快速利用碳氮源和慢速利用碳氮源的相互配合，发挥各自优势，避其所慢速利用碳氮源的相互配合，发挥各自优势，避其所短短。 选用适当的碳氮比。选用适当的碳氮比。C源源 做为做为C架又做能源，碳源较氮源多。架又做能源，碳源较氮源多。 过多，容易形成较低pH。 不足，菌体衰老和自溶。 N源源 作营养和氨基的来源作营养和氨基的来源 过多，菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利 于代谢产物 的积累。 不足，菌体繁殖量少，从而影响产量。 碳氮比不当，还会影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响菌体生长和产物的形成，菌体在不同生长阶段，对其碳氮比的最适要求是不一样的。 根据元素组成：酵母菌的碳氮比约为10020；霉菌的碳氮比约为10010。 一般发酵工业的碳氮比约为一般发酵工业的碳氮比约为100 0.22.0，但在氨基酸发酵中，但在氨基酸发酵中，碳氮比就高。如谷氨酸发酵碳氮比就高。如谷氨酸发酵C:N=100:1521，若碳氮比为若碳氮比为100:0.22.0，则会出现只长菌体，而不产谷氨酸的现象。，则会出现只长菌体，而不产谷氨酸的现象。C/N随碳水化合物及氮源的种类以及通气搅拌等条件而异，很难确定统一的比值。 Q：谷氨酸发酵的碳氮比为什么与其它发酵工业不同？谷氨酸发酵的碳氮比为什么与其它发酵工业不同？ 3要注意生理酸性盐、生理碱性盐和要注意生理酸性盐、生理碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭缓冲剂的加入和搭配配。 生理酸性盐生理酸性盐：如(NH4)2SO4为氮源时，由于NH4+被吸收，而造成培养基p降低。生理碱性盐生理碱性盐：如以KNO3为氮源时，由于硝酸根被利用，会引起培养基p值的升高。在生产中，采用NH4NO3作为氮源，但NH4 +和NO3- 并不是等速被微生物吸收， NH4 +吸收较快， NO3- 随后才吸收。工业生产中常用无机氮源有氨水或尿素作为氮源。工业生产中常用无机氮源有氨水或尿素作为氮源。尿素被菌体的脲酶分解产生氨，提供菌体的氮素营养。 第二节第二节 工业发酵培养基工业发酵培养基碳源碳源：供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的基础。有糖类、脂肪、某些有机酸等等。氮源氮源：主要构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质、氨基酸等之类的含氮代谢物。可分为有机氮源和无机氮源。功能：构成菌体成分；作为酶的组成分或维持酶的活性；调节渗透压、PH值、氧化还原电位等。无机盐无机盐：铅、镁、硫、磷、钾、钠、氯、锌、钴、锰。特殊生长因子特殊生长因子：其功能是构成辅酶的组成分，促进生命活动的进行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是极少的。水水：体内各种生化作用必须在水溶液中进行。营养物质必须溶解于水中，才能透过细胞膜被微生物利用。诱导剂、前体和促进剂诱导剂、前体和促进剂：胞外酶合成需要诱导物、有些需要促进剂，抗生素需要前体。 不同的发酵产物，不同的菌种所选择的发酵培养基是不同的不同的发酵产物，不同的菌种所选择的发酵培养基是不同的。 白酒 (chinese spirit)发酵：固体发酵培养基； 果酒(fruit spirit)发酵：fruit juice or fruit sauce ； 啤酒(beer) 发酵：麦芽汁(wort)液体培养基； 酒精(alcohol)发酵：淀粉糖化醪(starch mash) ； 氨基酸(amino acid)发酵：水解糖液加其他营养成分； 柠檬酸(citric acid)发酵：淀粉液化醪(starch dextrinizate mash)； 乳酸(lactic acid)发酵：淀粉糖化醪(starch mash) ； 甲烷(methane)发酵：复杂的有机废物发酵； 抗生素(antibiotic)发酵：淀粉糖化醪(starch mash) +豆饼粉+麸皮粉；一、工业常用的碳源n葡萄糖：纯葡萄糖、淀粉水解液n乳糖： 纯乳糖、乳清粉n淀粉：大麦、大米、燕麦粉、黑麦 粉、玉米、野生植物、薯类等n蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、 精白糖 另外还有醋酸、乙醇、亚硫酸纸浆废液、食品工厂的下脚料等等。 糖蜜（molasses)是制糖厂生产糖时的结晶母液，是糖厂的副产品，含有丰富的糖、氮素化合物和无机盐、维生素等，它是微生物工业物美廉价的原料。在工业生产中，常将糖蜜进行处理，用于生产过程。 糖蜜中主要含有蔗糖，总糖含量可达50%70%。 糖蜜分为甘蔗糖蜜(cane molasses)和甜菜糖蜜 (beet molasses) ，二者在糖的含量和无机盐的含量都有所不同，使用时应注意。糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生产中，抗生素等微生物工业也常用它作为碳源。 酒精工业中若用糖蜜代甘薯粉，则可省去蒸煮、制曲、糖化等过程，简化了酒精生产工艺。二、工业常用的氮源工业生产中常用工业生产中常用有机氮源有机氮源豆饼粉豆饼粉(soybean cake powder)、花生花生饼粉饼粉(peanut powder)、麸皮或麸皮水解液麸皮或麸皮水解液(bran hydrolysis liquid)、玉米浆玉米浆(corn steep liquor)等。等。根据：现有的工艺条件根据：现有的工艺条件 菌种生长和合成产物时菌种生长和合成产物时pH的变化的变化 最适最适pH的控制范围的控制范围 综合考虑选用生理酸碱性物质及用量，从而保证在整个发酵综合考虑选用生理酸碱性物质及用量，从而保证在整个发酵过程中过程中pH都能维持在最佳状态。都能维持在最佳状态。 培养基成分用量的多少大部分根据经验而来。但对于培养基成分用量的多少大部分根据经验而来。但对于主产物代主产物代谢途径清楚的物质如酒精和谷氨酸，可通过物料平衡计算加以确定。谢途径清楚的物质如酒精和谷氨酸，可通过物料平衡计算加以确定。 eg Alcoholic fermentation （C6H10O）n水解水解n C6H12O6 C6H12O6 发酵发酵 2 C2H5OH+2 CO2 + Q 所以所以 100Kg 淀粉理论上可以产酒精量淀粉理论上可以产酒精量 X= 2 46 100/162=56.79 Kg eg Glutamate fermentation （C6H10O5）n水解水解n C6H12O6 C6H12O6 发酵发酵 C5H9O4N+ CO2 +H2O + Q 所以所以 100Kg 淀粉理论上可以产谷氨酸的量淀粉理论上可以产谷氨酸的量1 147 100/162=90.74 Kg 次级代谢产物次级代谢产物生物合成途径了解有限，化学计算比较困难,但有人根据物料平衡计算了碳源转化为青霉素的得率. Cooney(1979)根据化学反应计量关系和经验数据得出下式: 10 C6H12O6 +12NH3+3O2+6H2SO4+6C8H8O12（苯乙酸）CHON4S+12CO2+54H2O青霉素的理论得率为每克葡萄糖得每克葡萄糖得1.1克青霉素克青霉素G在确定培养基碳源数量时，还应考虑用于菌体生长所需的消耗及碳源的来源、加工方法和有效成分的含量。制备培养基，也应考虑水分。 培养基用量大，应就地就近选用廉价原料。 eg Lys 发酵培养基的碳源由发酵培养基的碳源由山芋淀粉改为山芋粉山芋淀粉改为山芋粉，成本，成本降低降低15。山芋粉中还有生物素、镁盐等。山芋粉中还有生物素、镁盐等。 三三. 生长因子（生长因子（growth factor） 生物素（生物素（biotin） 维生素（维生素（vitamin） 甘油（甘油（glycerol） 氨基酸（氨基酸（amino acid） 油酸（油酸（oleic acid） 嘌呤（嘌呤（purine） 吡啶吡啶 (pyridine) 麸皮水解液麸皮水解液(bran hydrolysis liquid)其他农副产品其他农副产品 玉米浆玉米浆(corn steep liquor) 糖蜜（糖蜜（ molasses ） 四四. 前体物质、促进剂、抑制剂前体物质、促进剂、抑制剂前体（前体（precursor）：）：指某些化合物加入到培养基中，能直接被指某些化合物加入到培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物中去，而其自身的结构并没有微生物在生物合成过程中结合到产物中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。e.g. 青霉素发酵中加玉米浆（corn steep liquor），发酵单位（fermentation titer unit）由20g/ml提高到100 g/ml 。玉米浆中含有苯乙胺苯乙胺，它被优先结合到青霉素分子中去，从而提高产量。有些前体物质，例如苯乙酸苯乙酸、丙酸丙酸等浓度过高时，对菌体会产生毒性。有些菌体还有将前体氧化分解的能力。在生产中常采用少量多次地加入前体。在生产中常采用少量多次地加入前体。 总的加入量可按一个产物分子，进入几个前体分子，按等摩尔计算前体加入量，在总的加入量中，还应考虑菌体氧化、分解的那部分前体。发酵生产中常用的前体发酵生产中常用的前体 产物产物 前体前体 产物产物 前体前体n青霉素苯乙酸及衍生物 n青霉素苯氧乙酸n金霉素氯化物n链霉素 肌醇、精氨酸n红霉素 丙酸、丙醇nVB12 钴化物n葫萝卜素 -紫罗兰酮nL-异亮氨酸 - 氨基酸nL-色氨酸 邻氨基苯甲酸nL-丝氨酸 甘氨酸抑制剂抑制剂（inhibitor）： 在发酵过程中能产生抑制作用的物质在发酵过程中能产生抑制作用的物质 在发酵过程中加入某些抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一个代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或使正常代谢的某一中间物积累起来。e.g. 微生物发酵法生产甘油。在发酵液中加入亚硫酸氢纳，它与代谢过程中产生的乙醛生成加成物，反应式如下： CH3CHO+NaHSO3 CH3 CH OH OSO3Na这就使乙醇代谢途径中的乙醛不能成受氢体，而使NADH在细胞中积累，从而激活 -磷酸甘油脱氢酶的活性，使磷酸二羟基丙酮取代乙醛作为NADH 的受氢体，而还原为 - 磷酸甘油，其水解后即形成甘油。 亚硫酸氢纳亚硫酸氢纳是乙醇代谢的抑制剂，促使甘油形成。 溴化剂溴化剂能抑制金霉素形成的代谢途径，促使四环素的生成。 促进剂促进剂(promoter)：既不是营养物，又不是前体，但却能既不是营养物，又不是前体，但却能提高产量的添加剂提高产量的添加剂。 巴比妥盐巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉素生产菌自溶推迟，延长产物的分泌期。 酵母甘露聚糖酵母甘露聚糖可诱导 -甘露糖酶的产生，促使甘露糖链霉素转化为链霉素(streptomycin)。 聚乙烯醇衍生物聚乙烯醇衍生物可防止菌丝结球，提高糖化酶(saccharifying enzyme)的产量。 表面活性剂表面活性剂(surface active agent) ：在底物和产物均不溶或微溶于水的发酵中，表面活性剂有增加渗透性(perviousness)、促使固体物分散从而强化传质和传氧的作用。 第三节第三节 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备 意义意义：很多微生物都不能直接利用淀粉(amylum) ，因为它们不含淀粉酶和糖化酶。因此，在发酵生产之前，必须将淀粉水解为葡萄糖，才能供发酵使用。 将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化（saccharification），制得的糖液叫淀粉水解糖。 葡萄糖（glucose） 淀粉水解糖液 麦芽糖(maltose) 复合糖类（二糖、低聚糖等） 其他分解产物（氨基酸、脂肪酸等） 在工业生产中，水解糖质量的高低，直接影响菌体的生长和产物的积累。 淀粉水解糖液必须具备的条件淀粉水解糖液必须具备的条件n 1、糖液葡萄糖含量：20%n 2、 糖液洁净，呈杏黄色或黄绿色n 3、 透光率：90%以上n 4、 糖液不含糊精(dextrin)n 5、 糖液不能变质n 6、转化率：90%左右n 转化率=n 水解糖液数量（升）含糖量（%） 100%n 投入淀粉量（公斤） 原料淀粉中含纯淀粉% 1.11一、淀粉水解糖制备的方法一、淀粉水解糖制备的方法 原料：原料： 薯类薯类(tuber)、玉米玉米(corn)、小麦小麦(wheat)、大大米米(rice)等含淀粉原料。等含淀粉原料。 根据原料淀粉的性质和水解使用的催化剂根据原料淀粉的性质和水解使用的催化剂(catalyst)的不同的不同 酸解法（酸解法（acid hydrolysis process) 水解的方法水解的方法 酶解法酶解法( enzymatic hydrolysis process) 酸酶结合法酸酶结合法(acid- enzymatic hydrolysis ) 酸解法：以酸酸解法：以酸(无机酸或有机酸无机酸或有机酸)为催化剂，在高温高为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。n优点：生产方便、设备简单、水解时间短，设备生产能力优点：生产方便、设备简单、水解时间短，设备生产能力大大n缺点：高温高压、酸性条件、过程复杂、副反应多、损失缺点：高温高压、酸性条件、过程复杂、副反应多、损失大大n要求：淀粉颗粒不宜过大、大小要均匀。淀粉乳浓度也不要求：淀粉颗粒不宜过大、大小要均匀。淀粉乳浓度也不宜过高。宜过高。 酶解法：利用专一性很强的淀粉酶和糖化酶将淀粉酶解法：利用专一性很强的淀粉酶和糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。水解为葡萄糖的工艺。n 淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下完成的，故酶解法淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下完成的，故酶解法又有双酶水解法又有双酶水解法(double-enzyme)之称。之称。n 优点：酶反应条件温和，不需要高温、高压和耐酸的设优点：酶反应条件温和，不需要高温、高压和耐酸的设备；酶备；酶 的作用专一性强，淀粉水解的副反应少，水解糖液纯；的作用专一性强，淀粉水解的副反应少，水解糖液纯； 可在较高的淀粉乳浓度下水解；可用粗原料；糖液颜色浅，可在较高的淀粉乳浓度下水解；可用粗原料；糖液颜色浅，较纯净、无苦味、质量高。较纯净、无苦味、质量高。n 缺点：酶解时间长、需要专门的设备，酶是蛋白质，易缺点：酶解时间长、需要专门的设备，酶是蛋白质，易引起糖液过滤困难。引起糖液过滤困难。n 利用利用 淀粉酶将淀粉转化为糊精及低聚糖的过程叫液化淀粉酶将淀粉转化为糊精及低聚糖的过程叫液化（liquefaction/dextrinization)。n 利用糖化酶将糊精及低聚糖进一步水解为葡萄糖，这个利用糖化酶将糊精及低聚糖进一步水解为葡萄糖，这个过程叫糖化过程叫糖化(saccharify)。 酸酶法：是先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，酸酶法：是先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺。然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺。 如玉米、小麦等谷物原料的淀粉，淀粉颗粒坚硬，如玉米、小麦等谷物原料的淀粉，淀粉颗粒坚硬，所以液化采用酸法。所以液化采用酸法。 淀粉淀粉 酸解至酸解至G值（值（DE值）值）10-15 降温中和降温中和 糖化酶糖化糖化酶糖化DE值：还原糖含量占干物质的百分含量。值：还原糖含量占干物质的百分含量。 优点：酸液化速度快，糖化时可采用较高的淀粉乳浓度。优点：酸液化速度快，糖化时可采用较高的淀粉乳浓度。 酶酸法：是将淀粉乳先用酶酸法：是将淀粉乳先用 淀粉酶液化到一定的程度，然淀粉酶液化到一定的程度，然后用酸水解成葡萄糖。后用酸水解成葡萄糖。 如碎米淀粉，颗粒大小不一，若用酸水解，往往如碎米淀粉，颗粒大小不一，若用酸水解，往往水解不均匀，出糖率低。水解不均匀，出糖率低。 优点：可采用粗原料淀粉，淀粉浓度（优点：可采用粗原料淀粉，淀粉浓度（13Be）较酸较酸法（法（10Be ）高，生产易控制。时间短，淀粉水解副高，生产易控制。时间短，淀粉水解副反应少。反应少。淀淀 粉粉直链淀粉直链淀粉(amylose)： - 1，4葡萄糖苷键缩合，聚合度小。葡萄糖苷键缩合，聚合度小。支链淀粉支链淀粉(amylopectin)： -1，4键、键、 - 1，6键，聚合度大。键，聚合度大。 糊精：糊精：若干种分子大于低聚糖的碳水化合物的总称。若干种分子大于低聚糖的碳水化合物的总称。具有还原性、旋光性、能溶于水，不溶于酒精，因分子大小具有还原性、旋光性、能溶于水，不溶于酒精，因分子大小的不同，糊精与碘可呈现不同的颜色。的不同，糊精与碘可呈现不同的颜色。淀粉淀粉 糊精（兰糊精（兰暗紫暗紫 紫紫 红褐红褐 暗红暗红 红红 浅红）浅红）二二 淀粉酸水解的原理淀粉酸水解的原理淀粉水解过程的变化：淀粉水解过程的变化：淀粉颗粒结构破坏，糖苷键断裂，其分子逐渐变小。先淀粉颗粒结构破坏，糖苷键断裂，其分子逐渐变小。先变成糊精、低聚糖、麦芽糖，最后才能生成变成糊精、低聚糖、麦芽糖，最后才能生成G。 A 淀粉的水解反应淀粉的水解反应 淀粉水解总的趋势是大分子向小分子转化，随着淀粉水解程度淀粉水解总的趋势是大分子向小分子转化，随着淀粉水解程度的增加，糖化液的还原性不断增加。的增加，糖化液的还原性不断增加。淀粉淀粉(amylum)糊精糊精(dextrin)低聚糖低聚糖(oligosaccharides )葡萄糖葡萄糖(glucose) 淀粉水解的化学反应可简单表示如下：淀粉水解的化学反应可简单表示如下： （C6H10O5)n+nH2O n (C6H12O6) 由于有水参与，反应结果有化学增重。由于有水参与，反应结果有化学增重。 理论上，淀粉转化为葡萄糖的转化率为理论上，淀粉转化为葡萄糖的转化率为 180.16/162.14 100%=111.1% 实际转化率只有实际转化率只有90%。 当葡萄糖值超过当葡萄糖值超过60时，由于时，由于G复合分解反应产生其他复合分解反应产生其他有味物质（龙胆二糖有苦味）及有色物质。有味物质（龙胆二糖有苦味）及有色物质。 B 淀粉水解的副反应淀粉水解的副反应 葡萄糖的复合反应葡萄糖的复合反应 水解水解 热、酸热、酸 -1，6 键聚合成异麦芽糖键聚合成异麦芽糖淀粉淀粉 葡萄糖葡萄糖糖苷键聚合糖苷键聚合 -1，6键聚合成龙胆二糖键聚合成龙胆二糖 葡萄糖的分解反应葡萄糖的分解反应 水解水解 热、酸热、酸 淀粉淀粉 葡萄糖葡萄糖 分解分解 5-羟甲基糠醛羟甲基糠醛 甲酸、乙甲酸、乙酰丙酸、有色物质。酰丙酸、有色物质。 在淀粉的酸水解过程中，葡萄糖因分解损失的量在在淀粉的酸水解过程中，葡萄糖因分解损失的量在1%，但，但5-羟羟甲甲 基基 糠糠 醛是醛是 产产 生生 色色 素素 的的 根根 源，增加精制的困难。源，增加精制的困难。 5-羟甲基糠醛羟甲基糠醛 的含量高，则色素的形成量增多。的含量高，则色素的形成量增多。反应中形成的氨基糖，也对发酵有影响。反应中形成的氨基糖，也对发酵有影响。 淀粉酸水解的反应淀粉酸水解的反应 淀粉（淀粉（amylum） 酸水解酸水解 葡萄糖（葡萄糖（glucose） 复合反应 分解反应（disaccharide）复合二糖 5-羟甲基糠醛( oligosaccharide )复合低聚糖 有机酸、有色物质 在淀粉的酸水解过程中，三种反应同时发生，在淀粉的酸水解过程中，三种反应同时发生，淀粉的水解反应淀粉的水解反应是主要的，是主要的，葡萄糖的复合和分解反应是次要的，复合反应和分解反葡萄糖的复合和分解反应是次要的，复合反应和分解反应对葡萄糖的生产来说是不利的，影响菌体的正常发酵及工厂的生应对葡萄糖的生产来说是不利的，影响菌体的正常发酵及工厂的生产成本。产成本。 Q：如何控制水解条件，降低复合分解反应的发生？如何控制水解条件，降低复合分解反应的发生？ D 淀粉酸水解的工艺流程淀粉酸水解的工艺流程 淀粉 水 盐酸调浆调浆原料原料酸水解酸水解冷却冷却中和脱色中和脱色糖液糖液过滤除杂过滤除杂 E 淀粉酸水解条件的选择淀粉酸水解条件的选择 1 淀粉的质量淀粉的质量 酸法水解的重要特点是非专一性。酸法水解的重要特点是非专一性。 表表 2-1 酸水解对淀粉质量的要求酸水解对淀粉质量的要求项目项目 指标指标水分水分1114总蛋白质总蛋白质 0.30.5水溶性蛋白质水溶性蛋白质 0.010.02脂肪脂肪 0.040.06 粗纤维粗纤维 0.010.022、 淀粉乳浓度的选择：n浓度低，浓度低，DE值高，色泽浅。浓度高，复合反应易发生，色泽值高，色泽浅。浓度高，复合反应易发生，色泽深。深。 淀粉乳浓度与水解糖液淀粉乳浓度与水解糖液DE值之间的关系值之间的关系 浓度（浓度（Bx） 26 24 22 20 19 18 17 16 DE值值 89.17 89.27 89.92 91.1 91.3 92.77 92.81 93.01 从表中可以看出，随着淀粉乳的浓度下降，从表中可以看出，随着淀粉乳的浓度下降，DE值上升，表值上升，表明糖液中杂质少，但淀粉乳的浓度过低，则设备利用率降低。明糖液中杂质少，但淀粉乳的浓度过低，则设备利用率降低。 故淀粉乳的浓度在故淀粉乳的浓度在1819 Bx(10.512 Be ) 3、酸的种类和用量： 盐酸盐酸(hydrochloric acid)：催化效能为 100 硫酸硫酸(sulphuric acid) ：催化效能为 50.35 草酸草酸(oxalic acid): 催化效能为 20.45一般用盐酸，其量占干淀粉的 0.60.7%，PH 调至 1.5左右。 糖化压力和时间糖化压力和时间一般压力为.-.公斤cm2 水解-注意：注意：保持正压 取样时，保证能代表釜内液体的浓度 及时放料（分钟放完） 糖化设备结构的影响糖化设备结构的影响 糖化锅的容积不宜过大 , 一般70-80m3, 锅体不能太高或太矮。 常采用的径高比（aspect ratio）1：1.5 糖化锅的附属管道也应保证进出料迅速，物料受热均匀，有利于升压，有利于消灭死角，尽量缩短辅助时间。排气排气蒸蒸汽汽 6、糖化终点的控制、糖化终点的控制 从糖化曲线可以看出从糖化曲线可以看出,DE值到达最高点后即不再值到达最高点后即不再上升，相反会随着糖化时上升，相反会随着糖化时间的延长而稍有下降。间的延长而稍有下降。(why?). 糖化终点的检验：糖化终点的检验： 用无水乙醇检验无用无水乙醇检验无 白色沉淀或碘液检验为白色沉淀或碘液检验为 20 30 时间时间(分分)无色，即为终点无色，即为终点 。 淀粉酸糖化的曲线淀粉酸糖化的曲线 100 90 80 70 60 A B C (纯度%) F F 水解糖液的中和、脱色除杂水解糖液的中和、脱色除杂 1 1、中和：目的是降低酸度；除去蛋白质、中和：目的是降低酸度；除去蛋白质 中和剂中和剂 纯碱：纯碱： 温和，糖液质量好，但产生的泡温和，糖液质量好，但产生的泡 沫多，难控制沫多，难控制 烧碱：烧碱： 易造成局部过碱，使糖焦化，产易造成局部过碱，使糖焦化，产 生焦糖生焦糖 中和时注意中和时注意 不要反中和，边中和边测定不要反中和，边中和边测定pHpH值值, , 温度在温度在80 80 C C以下以下, ,一般控制一般控制60-60- 70 70 C C pHpH值控制在值控制在4 46-56-50 0 2 2、脱色除杂、脱色除杂活性炭吸附法活性炭吸附法离子交换法离子交换法新型磺化煤新型磺化煤 用量：相当于干淀粉量的用量：相当于干淀粉量的0.60.8活性炭活性炭 脱色温度脱色温度: 65 C C p值值: 4.65.0 3、 过滤过滤 脱色后要进行过滤，其目的是除去中和、脱色糖化液中凝聚的脱色后要进行过滤，其目的是除去中和、脱色糖化液中凝聚的蛋白质及其他不溶性杂质和加入的脱色剂，以制得澄清的糖化液。蛋白质及其他不溶性杂质和加入的脱色剂，以制得澄清的糖化液。发酵工业中糖化液的过滤通常是用板框过滤机。过滤后再调节糖液发酵工业中糖化液的过滤通常是用板框过滤机。过滤后再调节糖液的的pH值至值至6.7 7.0。 酶法制糖工艺是以作用专一性专一性的酶制剂作为催化剂将淀粉转化为糖的工艺。工艺分为液化和糖化，液化是在淀粉酶的作用下完成的，糖化是在糖化酶的作用下完成的。1 液化液化 （1） 淀粉酶的水解作用淀粉 液化液 淀粉酶从淀粉分子内部水解 - 14糖苷键，不能水解 -16-糖苷键，但能越过 -16-糖苷键继续水解-14-糖苷键，而将-1.6糖苷键留在在水解产物中。直链淀粉分子水解产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖。支链淀粉最终产物除了前述几种外，还有异麦芽糖及含有 -16-糖苷键的低聚糖。 四、四、 酶法制糖的理论基础及工艺酶法制糖的理论基础及工艺 （2 ）淀粉酶液化的条件及液化程度的控制）淀粉酶液化的条件及液化程度的控制 淀粉的糊化与老化淀粉的糊化与老化淀粉的糊化是指淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，淀粉的糊化是指淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。象。 发生糊化现象时的温度称发生糊化现象时的温度称糊化温度。糊化温度。不同原料的糊化温度范不同原料的糊化温度范围不同。围不同。P67 淀粉的老化实际上是分子间淀粉的老化实际上是分子间氢键氢键已断裂的糊化淀粉又重新排已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶的过程。列形成新的氢键的过程，也就是复结晶的过程。在酶法糖化时，在酶法糖化时， 淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，使淀粉很难液化，因此，用，使淀粉很难液化，因此，必须采取相应的措施控制糊化淀粉必须采取相应的措施控制糊化淀粉的老化。的老化。淀粉糊的老化与淀粉的种类、酸碱度淀粉糊的老化与淀粉的种类、酸碱度、温度温度、加热方式及淀加热方式及淀粉糊的浓度有关。粉糊的浓度有关。淀粉的老化程度可通过冷却时形成的凝胶体强淀粉的老化程度可通过冷却时形成的凝胶体强度来表示。度来表示。淀粉液化的方法与选择淀粉液化的方法与选择 一次加酶液化法一次加酶液化法 加酶的方法二次加酶液化法加酶的方法二次加酶液化法 三次加酶液化法三次加酶液化法 中温酶法中温酶法酶耐温性酶耐温性高温酶法高温酶法高温高温- -中温酶法中温酶法 原料粗细原料粗细 淀粉质原料直接液化法淀粉质原料直接液化法精制淀粉液化法精制淀粉液化法 加热的方式加热的方式 蒸汽喷射液化法蒸汽喷射液化法 常温液化法常温液化法 蒸汽喷射液化工艺及条件蒸汽喷射液化工艺及条件 该工艺的特点是利用该工艺的特点是利用喷射器喷射器将蒸汽喷入淀粉乳将蒸汽喷入淀粉乳 的薄膜，在短时间内通过喷射器快速升温至的薄膜，在短时间内通过喷射器快速升温至145 C 完成糊化、液化，使形成完成糊化、液化，使形成的的“不溶性淀粉颗粒不溶性淀粉颗粒”在在 高温下分散，从而使所得的液化液既透明又易于过高温下分散，从而使所得的液化液既透明又易于过 滤，淀粉的出糖率也高，同时采用了滤，淀粉的出糖率也高，同时采用了真空闪急冷却，真空闪急冷却， 提高了液化液的浓度。提高了液化液的浓度。 工艺流程工艺流程 淀粉淀粉 水碱液水碱液 0.15%氯化钙氯化钙 耐高温耐高温 -淀粉酶淀粉酶 p 喷射液化器喷射液化器5.07.0 9597 C 保温保温 罐（罐（60分种）分种） 二次喷射器（二次喷射器（145 C ，维持罐，维持罐35分钟）分钟） 真空闪急冷却真空闪急冷却 二次液化罐（二次液化罐（9597 C ） 加入耐高加入耐高温淀粉酶温淀粉酶(30分钟分钟) 碘液检验后结束液化。碘液检验后结束液化。液化条件：液化条件：3040的淀粉乳浓度、的淀粉乳浓度、p值值5-7、温度为、温度为95 C - 97 C。 淀粉酶的加入量，随着酶活力的高低而定，但一般淀粉酶的加入量，随着酶活力的高低而定，但一般控制在控制在58单位克淀粉。单位克淀粉。液化程度控制液化程度控制在液化过程中，淀粉液化水解成较小的分子。液化程度在液化过程中，淀粉液化水解成较小的分子。液化程度不能太低，因为：不能太低，因为：液化程度低，液化液的黏度就大，难于操作；液化程度低，液化液的黏度就大，难于操作； B 液化程度低，淀粉易老化，不利于糖化，特别会使糖化液液化程度低，淀粉易老化，不利于糖化，特别会使糖化液的过滤性较差。的过滤性较差。 但是但是,液化程度也不能太高，因为：液化程度也不能太高，因为： 糖化酶糖化酶(葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶)属于外酶属于外酶，先与底物分子生成络先与底物分子生成络合结构，而后发生水解作用，合结构，而后发生水解作用，水解是由底物分子的非还原末水解是由底物分子的非还原末端开始，端开始，使葡萄糖单位逐个从糖苷键中裂解出来，要求底物使葡萄糖单位逐个从糖苷键中裂解出来，要求底物分子有一定的大小分子有一定的大小, 液化超过一定程度，液化超过一定程度，底物分子过小底物分子过小,不利不利于糖化酶生成络合结构，影响催化效率，使糖化液的最终于糖化酶生成络合结构，影响催化效率，使糖化液的最终 值偏低。值偏低。 正常液化条件下，控制值在正常液化条件下，控制值在1020之间为好。之间为好。2 糖化（糖化（ 糖化酶的水解作用）糖化酶的水解作用） 糖化酶对底物作用从非还原末端开始将糖化酶对底物作用从非还原末端开始将 -1.4和和 -1.6糖苷键水解糖苷键水解,也能水解麦芽糖。也能水解麦芽糖。 必须控制必须控制糖化酶的用量和底物的浓度糖化酶的用量和底物的浓度。 糖化的温度及糖化的温度及p值决定于所用的糖化剂的性质。值决定于所用的糖化剂的性质。 曲霉糖化酶：一般温度为曲霉糖化酶：一般温度为5064 C， pH4.34.5； 根酶糖化酶：一般温度为根酶糖化酶：一般温度为5458 C， pH4.35.0； UV-11糖化酶糖化酶:一般温度为一般温度为55 60 C， pH3.54.2； 大生产中，根据酶的特征，尽量采用较高的温度和较低大生产中，根据酶的特征，尽量采用较高的温度和较低的的pH值。值。这样糖化速度快，采用较低的这样糖化速度快，采用较低的pH值可使糖化液的值可使糖化液的颜色浅，便于脱色，也可减少杂菌污染的可能性。颜色浅，便于脱色，也可减少杂菌污染的可能性。国外在糖化生产中加入葡萄糖苷酶？国外在糖化生产中加入葡萄糖苷酶？P71糖化工艺条件及控制糖化工艺条件及控制 液化液灭酶液化液灭酶（100 ，10分钟分钟)用酸调用酸调pHpH值值4.2-4.5 4.2-4.5 ，同时降温冷却，同时降温冷却 60 60 C C 加糖化酶保温数小时加糖化酶保温数小时用无水用无水酒精检验无糊精存在时酒精检验无糊精存在时加热加热90 90 C ，保温，保温30分钟分钟-降温降温6070 C过滤糖液。过滤糖液。液化液的糖化速度与酶制剂的用量有关。用量与酶活力液化液的糖化速度与酶制剂的用量有关。用量与酶活力有关。酶活高，用量少；液化液浓度高，加酶量多。有关。酶活高，用量少；液化液浓度高，加酶量多。 生产上：淀粉时，酶量按单位克生产上：淀粉时，酶量按单位克淀粉。淀粉。 13324578910淀粉、碱液氯化钙、淀粉、碱液氯化钙、淀粉酶淀粉酶蒸蒸汽汽6糖化酶、酸糖化酶、酸双酶法制糖工艺流程图双酶法制糖工艺流程图1-调浆罐；2-缓冲器；3-液化罐；4-贮罐；5-灭酶罐；6-板式换热器；7-糖化罐；8-压滤机；9-糖化暂贮槽；10-贮糖槽第四节 糖蜜原料一 . 糖蜜原料的分类 P73 甘蔗糖蜜（beet molasses） 甜菜糖蜜（cane molasses） 高级糖蜜（high molasses）二 . 糖蜜原料的性质和组成三 . 糖蜜的预处理 一般处理：澄清处理，除去灰分和胶体物质 特殊处理：降低生物素，甘蔗糖蜜生物素高 第五节第五节 石油代粮发酵石油代粮发酵 石油在目前是地球上石油在目前是地球上蕴藏量十分丰富的藏量十分丰富的资源源。能利用石油能利用石油的微生物种的微生物种类很多，分布很广很多，分布很广，其，其最大特点是能使化学上很最大特点是能使化学上很稳定的正定的正烷烃、环烷烃、芳香、芳香烃等化合物在常等化合物在常压下化学下化学变化，所化，所以石油以石油发酵不需高温、高酵不需高温、高压、耐酸、耐腐、耐酸、耐腐蚀的的设备。 英国用石蜡英国用石蜡为原料，美国用原料，美国用烃、法国用柴油、法国用柴油为原料生原料生产石石油蛋白，石油蛋白的收率油蛋白，石油蛋白的收率为50%80%。国外石油蛋白已完成。国外石油蛋白已完成了了试产和毒性和毒性试验，已正式投，已正式投产。 日本以石油日本以石油馏分或石油化工分或石油化工产品品发酵和生酵和生产谷氨酸、谷氨酸、赖氨氨酸、酸、柠檬酸、檬酸、酮戊二酸、反丁戊二酸、反丁烯二酸等二酸等,收率已达到或超收率已达到或超过糖糖质原料原料发酵的水平。酵的水平。 某些氨基酸、某些氨基酸、氯霉素、灰黄霉素的霉素、灰黄霉素的发酵酵产率，也率，也接近了投接近了投产水平。水平。 利利用用石石油油产品品醋醋酸酸作作谷谷氨氨酸酸发酵酵原原料料，已已在在日日本本全面生全面生产。 在在我我国国除除进行行石石油油微微生生物物脱脱蜡蜡、石石蜡蜡制制造造酵酵母母蛋蛋白白外外，近近年年也也开开展展了了石石油油代代粮粮发酵酵，正正在在进行行谷谷氨氨酸酸、抗抗生生素素、酶酶制制剂、柠檬檬酸酸、反反丁丁烯二二酸酸的的石石油油发酵酵，还进行了行了维生素生素B2、甘露醇的石油甘露醇的石油发酵的研究。酵的研究。第六节 其他物质n农作物纤维下脚料；n 森林和木材工业下脚料；n 工厂纤维和半纤维素下脚料；n 城市生活纤维物质；n 亚硫酸盐废液；n 食品工业的下脚； 这些物质均可经过一定的处理用于 发酵产品的生产。