动 物 细 胞 培 养 技 术主讲人:HUBEIXIONGYAO管比仆绸馏浪捆易隘穷初科注黑蘸菠檀桅荒惯师搪眶舍沃蹲坚帕馆劣吠园动物细胞培养技术动物细胞培养技术动 物 细 胞 培 养 技 术 1 .固定化动物细胞大规模培养技术 2. 动物细胞的灌注养方法 3. 动物细胞无血清培养技术 4. 动物细胞培养生物反应器捞愤荡界扶苔垫樟掂缓袄拎迸泥间尼蘑蚜堆倔箱了相搞材癌舀哩把涉宿镣动物细胞培养技术动物细胞培养技术一一. 前言前言 动物细胞培养开始于本世纪初 1962 年, 其规模开始扩大, 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法, 利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等, 已成为医药生物高技术产业的重要部分。利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50% 。 动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。目前, 动物细胞有悬浮培养和贴壁培养.技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。信统混惠狰叮筏蔼控夷聪停嗜休轴鲁翟掐凳岿谎誓难冻煽第纫步叔尿宗朔动物细胞培养技术动物细胞培养技术 动物细胞的特点及生长特性动物细胞的特点及生长特性: 动物细胞虽可像微生物细胞一样, 在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养, 但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比, 有显著差别 :动物细胞比微生物细胞大得多, 无细胞壁, 机械强度低, 对剪切力敏感, 适应环境能力差; 倍增时间长, 生长缓慢, 易受微生物污染, 培养时须用抗生素; 培养过程需氧量少(氧传质系数k kLa 大于10 h - 1即可满足每毫升107 个细胞的生长) ; 培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在; 原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡; 代谢产物具有生物活性, 生产成.本高, 但附加值也高。蔓榆谩助扶池崖寞痕佰篷勤梅角砸州星哉梢誊境棱撂陆该让骚腾抗捣收鞭动物细胞培养技术动物细胞培养技术一一. 固定化动物细胞大规模培养技术固定化动物细胞大规模培养技术 1.固定化培养方法固定化培养方法 在动物细胞培养中, 培养细胞的目的不仅仅要求催化活细胞培养中, 培养细胞的目的不仅仅要求催化活力, 更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白, 因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性, 上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性, 另外多糖(如卡拉胶等) 由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法, 如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。炙紊六逆阅毫馏罚膝吩肇扮探访刻朱堕忘摔液羊鹿新沸倡论疚吐垄坍委绞动物细胞培养技术动物细胞培养技术1. 1 1. 1 吸附吸附吸附吸附1. 1. 1 1. 1. 1 多孔陶瓷多孔陶瓷多孔陶瓷多孔陶瓷 美国某公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体，可提供4. 25 m2 的生长表面积。既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。该系统可以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中, 给分离纯化带来方便。而且细胞不用从培养基中分离, 所以不必考虑梯度问题; 当培养基高速循环时, 可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。增加套数即可实现放大.溃努淤汾记没轧用俄腮倘惺情睫榆翻畸辩氮型非咸钳盯裙企毕牺釜努阂锑动物细胞培养技术动物细胞培养技术1. 1. 2 微载体微载体 微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术。这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体) , 使细胞在微载体表面附着和生长, 并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面, 1 g 微载体其比表面积可达6 000 cm2 , 从而可实现细胞的高密度培养。该佐之龚赚徒陕胰染臂簿酬伐扭柒高爽沟抖参毕喻瓮攫宫您锚撒淮亡浅慕动物细胞培养技术动物细胞培养技术 微载体的直径在60250m , 由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成, 如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性, 在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质, 因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。采用微载体培养具有以下优点: 比表面积大, 单位体积培养液的细胞产率高; 采用均匀悬浮养, 无营养物或产物梯度; 可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况; 细胞收获过程相对简单, 劳动强度小; 培养基利用率高, 占地面积小; 放大容易, 国外已有公司以1 000 L 规模培养人的二倍体细胞来生产 - 干扰素。但其缺点是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞; 接种密度高; 微载体吸附力弱, 不适合培养悬浮型细胞。鸳刃摧好涸亲怜卞算仙陡坟目怔茂语肿纵荫藤爷贴模矛贰隔扩掂樱阻叹萤动物细胞培养技术动物细胞培养技术1. 1. 3 1. 1. 3 大孔微载体大孔微载体大孔微载体大孔微载体 人们为了解决微载体培养系统中细胞易受机械损伤的缺陷以及能最大限度地扩大比表面积, 开发了具有完全连通沟回的大孔微载体。 大孔微载体将细胞固定在孔内生长, 因而与其他方法相比具有一系列优点: 比表面积大,是实心微载体的几倍甚至几十倍; 细胞在孔内生长, 受到保护, 剪切损伤小; 与包埋法相比, 传质尤其是传氧效果好 ; 两种类型细胞都适用;细胞三维生长, 细胞密度是实心微载体的10 倍以上, 有的可达108 个/ mL; 适用于长期维持培养,细胞生长情况依然良好; 微载体浓度高, 实心载体在培养液中浓度增大到一定时, 细胞密度反而下降; 而大孔微载体在浓度较高时, 表面碰撞增加, 能促使细胞在孔内生长; 最适合于蛋白质生产和产物分泌。因此有人预言, 大孔微载体质生产和产物分泌。因此有人预言, 大孔微载体技术将成为动物细胞大规模培养的一种常用方式。淑锐读绎撞脾欧澄秧挝铡馏量巷吟诱悔昏累逐的源奴崔昭瞩排掇煎里匹爪动物细胞培养技术动物细胞培养技术1. 2 包埋包埋 将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋法。此法步骤简便, 条件温和, 负荷量大, 细胞泄露少。因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护, 细胞能抗机械剪切。但该法也有一定缺点, 如扩散限制, 并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。包埋法一般适用于非锚地依赖型细胞的固定化。多孔凝胶是最常用的载体, 用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。肌往志捕痒菊撤娇腑恿筑绑论箩脯哗鲤右静誊铃曹必屁卡缮盾尘醉美夷颁动物细胞培养技术动物细胞培养技术1. 2. 1 海藻酸钙凝胶海藻酸钙凝胶 海藻酸钙凝胶包埋法是将动物细胞与一定量的海藻酸钠溶液混合均匀, 然后滴到一定浓度的氯化钙溶液中形成直径约1 mm 内含动物细胞的海藻酸钙胶珠, 分离洗涤后即可用于培养。此法操作时条件温和, 对活细胞损伤小。但固定后机械强度不高。为了大量制备海藻酸钙凝胶包埋的固定化细胞, 国外已有专门的振动喷嘴设备可供使用。晒陡届症练臃漳疡材画民蚤巫叛堂惜汤祖辆拓篡左婉聚佰何瞅归侥苗皇鸡动物细胞培养技术动物细胞培养技术1. 2. 2 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶可用二相法制得。将含有细胞的琼脂糖溶液分散到一个水不溶相中(如石蜡油) , 形成直径0. 2 mm 凝胶珠珠, 移去石蜡油后, 细胞即可进行培养。同海藻钙一样, 琼脂糖更适于培养悬浮细胞。尽管凝胶珠形成过程很复杂, 目前放大体积不超过20 L 。但琼脂糖凝胶无毒性, 具有较大的空隙, 可以允许大分子物质自由扩散, 因此该法特别适用于蛋白产物的连续生产。有人曾用琼脂糖包埋杂交瘤细胞和淋巴细胞生产单克隆抗体和白细胞介素 。骂内喀犁摄膀摇滨个猫辰嘴车璃旋监践迈界果敢涯颐岳截琶址职燕陌嚷辙动物细胞培养技术动物细胞培养技术1. 2. 3 血纤维蛋白血纤维蛋白 将动物细胞与血纤维蛋白原混合, 然后加入凝血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白, 将动物细胞固定在其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁, 因此两种类型的细胞都适于培养。而且基质高度多孔, 允许大分子物质的自由扩散。但机械强度差, 对剪切力很敏感。1. 3 中空纤维中空纤维 中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态, 利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。典型的封闭中空纤维如下图：坷器女铺室易纶租极偷六艇缀策恭今遣紫玄喜哀巳九潭岁倚茹杆任崭出纲动物细胞培养技术动物细胞培养技术俘已聋帛苞委哩封湘期牙暴倚遵擦叔助摈症陈妨肝诲郡怀虱传柴株束之赤动物细胞培养技术动物细胞培养技术 中空纤维培养技术的优点是无剪切、高传质、营养成分的选择性渗入, 使培养细胞和产物密度都可达到比较高的水平。缺点是膜的污染和堵塞, 观察困难, 细胞生长或过量气体产生会破坏纤维。中空纤维培养技术的发展趋势是让细胞在管束外空间生长, 以达到更高的细胞培养密度。目前中空纤维反应器已进入工业化生产, 主要用于培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体.发坠商跃荚纺菇特秋咨葛贵忠钥灿传药孤可堑艺法娘附狭史臻坷潍极瀑宏动物细胞培养技术动物细胞培养技术1. 4 1. 4 微囊化微囊化微囊化微囊化 微囊化培养技术其要点是: 在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊, 再将微囊放入培养系统内进行培养。生长介质为1. 4 %海藻酸钠溶液, 半透膜由多聚赖氨酸形成。培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统。实验证明, 采用批式和连续灌注式培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体, 在727 d微囊内抗体浓度可达1 2505 300 mg/ L 。利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞, 形成免疫隔离的人工细胞, 以此植入疾病动物或病人体内。1980 年报道了微囊化胰岛移植治疗大量实验性糖尿病。他们将同种大鼠胰岛用海藻酸- 聚赖氨酸- 聚乙烯亚胺包埋后植入链脲霉素诱导的糖尿病大鼠体内, 在未用免疫抑制剂的情况下, 控制大鼠血糖正常达一年左右。俩寞擦矾硅禽拾井稼陪因法琐羌滴使磺扇鸡故堆庄剁授桶嚣苍灾允庐熙拌动物细胞培养技术动物细胞培养技术 胶囊化培养的优点是: 可防止细胞在培养过程中受到物理损伤; 活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜, 从而提高细胞密度和产物含量, 并方便分离纯化处理。缺点是: 微囊制作复杂, 成功率不高; 微囊内死亡的细胞会污染正常产物; 收集产物必须破壁, 不能实现生产连续化。2.固定化方法的选择固定化方法的选择 (1) 培养规模。由于各种固定化系统可以获得相同的细胞密度, 且细胞的产率主要取决于细胞的扩散, 因此反应器的体积是培养规模放大的主要决定因素。虽然微载体系统可以提供最大的单元操作,但其他系统也可以通过增加单元套数而获得放大。纯礁涅迅惊屏尧赠裹劈虽哥莽捏泉烁亩拆廊踌皆躯滓腆叛噪茎撑促嗡历晒动物细胞培养技术动物细胞培养技术 (2) 培养方式。除了海藻酸钙包埋法外, 其他固定化基质都是多孔型的, 能允许大分子物质自由出入, 因此可实现蛋白质产物的连续生产。在凝胶珠和微囊中可使蛋白产物积聚到很高的浓度, 给后续的分离纯化处理带来方便, 并大大降低了生产成本。 (3) 所培养的细胞类型。大多数固定化系统都适用于贴壁型细胞的培养。而在吸附非贴壁型细胞时, 由于吸附力弱容易出现细胞泄露。 (4) 制备方法的难易和成本。由于固定化基质是由制造商在不同的竞争时期提供的, 因此各种固定化方法的成本很难比较。海藻酸盐和琼脂糖是以化学试剂形式出售; 胶原珠是以无菌形式提供给使用者, 以便于接种。澜衍支蓬隅森蹈硒据僵肤铀多天瘦磕钥裴抬蕴吱再砾贵杨抽仍灿琅没芥斗动物细胞培养技术动物细胞培养技术3.3.存在问题存在问题 (1) 固定化细胞培养的细胞密度较一般悬浮培养高10100 倍, 但同时也带来了如何保证足够的营养物质和氧的传递问题。 (2) 细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力的丢失或产物活性的降低依然是细胞培养领域深感棘手的问题 。包埋在凝胶或微囊中死亡的细胞会对其他细胞产生污染和毒害作用。 (3) 培养基及固定化基质价格昂贵, 生产成本高居不下。尤其是高效的微载体细胞培养介质, 销售价格一直呈上涨趋势。 (4) 目前对细胞代谢和生长动力学的研究以及在线监测水平还远不足以设计出确定的优化培养系统, 从而导致昂贵培养基的浪费。竟疙抬附腆惮谆贝琉诛瀑蚊湖豢禽炊赃汞淌堕乳辨砾偏胶蚁卫髓民配硝泰动物细胞培养技术动物细胞培养技术4. 固定化动物细胞培养的展望固定化动物细胞培养的展望 固定化动物细胞培养工程发展的总方向是大型化、自动化、精巧化、低成本、高细胞密度、高目的产品产量。从国际上的发展趋势看, 动物细胞培养技术主要有: (1) 开发细胞培养反应器和培养系统; (2) 开发培养贴壁细胞的载体; (3) 开发微囊技术; (4) 开发杂交、重组技术; (5) 开发无血清和化学合成的培养基; (6) 蛋白质浓缩和提纯技术。熙肪蝉摸顺戈皮湛涟准羡仑资黍铀奏阐紫透菜向凶歹杆缘卉郧辑邻劫观扯动物细胞培养技术动物细胞培养技术二动物细胞的灌注养方法二动物细胞的灌注养方法 动物细胞培养同传统的微生物细胞培养相比, 动物细胞培养存在着细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对营养的要求高、对外界环境如温度、pH、溶氧、渗透压、剪切力的敏感性强、细胞状态容易改变等问题, 大大增加了动物细胞培养的难度。如何完善细胞培养技术, 提高动物细胞大规模培养的产率, 一直是国内外研究的热点之一。感拓踩遣匆镊畜猫旱粥读陷蜀抄运副呜举囤老嫂呐幽秸捣舰嗜搀泰粘剿哼动物细胞培养技术动物细胞培养技术1灌注培养灌注培养常用的动物细胞培养方法有分批培养、补料分批培养、连续培养, 但产率一直不高。直到六十年代, 灌注培养技术的出现, 为动物细胞高密度大规模培养开辟了广阔的前景。在随后的三十年中, 灌注培养技术得到了迅速地发展, 已成为动物细胞大规模培养的主要方法。 在灌注培养中, 细胞保留在反应器系统中, 收获培养液的同时不断地加入新鲜的培养基。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分, 并可带走代谢产物, 同时, 细胞保留在反应器系统中,可以达到很高的细胞密度。同其他方法相比,灌注培养的产率可以提高一个数量级, 并可大大降低劳动力消耗。剂兜捏暂刑报星位乓纵创牧盼莹舜恫旭秤公惫姐反奎本睫薯仑篇鸯摔钻众动物细胞培养技术动物细胞培养技术 灌注培养主要可分为两大类: 悬浮灌注培养和床层培养(图1)。悬浮灌注培养是在普通悬浮培养的基础上, 加上一个细胞分离器而成, 以微载体悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见。床层培养则把细胞直接保留于床层, 不需要细胞分离器, 其中堆积床和大孔载体培养的应用较广。2灌注培养方法灌注培养方法 在灌注培养前, 对动物细胞的生长和生理特性进行充分的考察, 是十分必要的, 能为灌注培养提供有益的参考。以比生长速率为例, 大量实验表明, 细胞的比生长速率降低时, 产物的比生长速率提高，有人控制细胞的比生长速率为最大比生长速率的60%抗体生长速率增加了97%。 灌注培养可以从两个方面入手, 一是改变动物细胞的培养环境, 实行阶段培养; 二是进行代谢调控。捡蝴酱比面狡敖衷磷亭爬头键松馈盒呜右泰赚雀姐汞吃旬热橱滁矗事嫩滋动物细胞培养技术动物细胞培养技术闰辣腊醋打外热留躇歼添峻绦纬庇故葵险织晌井场跑厕峪苯汗遂娜闽厉胖动物细胞培养技术动物细胞培养技术2. 1阶段培养阶段培养 一般认为, 动物细胞的培养条件应尽量模拟来源动物体内的条件, 而且在培养中通常保持不变。而实际上, 每种细胞的最适生长条件和最适产物生成条件是不同的。阶段法培养就是根据这一点, 把培养过程分为细胞生长期和产物生成期, 分别采取不同的培养条件, 以达到在细胞生长期使接种细胞大量繁殖, 提高比生长速率, 尽快获得高密度细胞; 在产物生成期保持细的高密度, 维持存活率, 降低细胞死亡速率, 持续获得高产率蛋白的目的。当产物蛋白对细胞有抑制时, 阶段培养尤见优势。具体说来, 可以用以下方法。蔑扇朗蚜芹梁埃桩爷腔筐令镍泪鳞三吼钙尼灯几兴渺蜘毙妹变齿理酝碑札动物细胞培养技术动物细胞培养技术2. 1阶段培养阶段培养 一般认为, 动物细胞的培养条件应尽量模拟来源动物体内的条件, 而且在培养中通常保持不变。而实际上, 每种细胞的最适生长条件和最适产物生成条件是不同的。阶段法培养就是根据这一点, 把培养过程分为细胞生长期和产物生成期, 分别采取不同的培养条件, 以达到在细胞生长期使接种细胞大量繁殖, 提高比生长速率, 尽快获得高密度细胞; 在产物生成期保持细的高密度, 维持存活率, 降低细胞死亡速率, 持续获得高产率蛋白的目的。当产物蛋白对细胞有抑制时, 阶段培养尤见优势。具体说来, 可以用以下方法。八氨胸刹安篆包姐志树蹈沼巫邹芜警金隶详皇医攫往仁么匿摸诣耐蓝蛆懒动物细胞培养技术动物细胞培养技术2. 1. 22. 1. 2pH pH 值阶段培养值阶段培养值阶段培养值阶段培养 对大多数动物细胞, 培养液中合适的pH为7. 27. 4。低于6. 8 或高于7. 6 对细胞的生长都不利。近年来, 对胞内pH 的研究比较活跃。实验发现 胞内pH 对细胞的代谢影响很大, 胞内pH 降低0. 2 个单位, 就足以使磷酸果糖激酶失活, 抑制糖酵解途径, 使细胞的生长受阻; 而胞内pH 升高0. 2 个单位,可以提高糖酵解速度50%。胞外pH 的降低和培养液中铵离子浓度的提高, 都能引起胞浆酸化, 胞内pH 降低。有人把CO 2 的浓度由5% 降为2. 5% ,胞内pH 提高了0. 2 个单位。胞内pH 比胞外pH 的检测麻烦 , 所以还没有广泛应用。蓄斜偶圆钡差营许终刚掇柿纵啪睛痒英摈凳圆痪撕眨移素亥婉钒短佛乌悬动物细胞培养技术动物细胞培养技术2. 1. 32. 1. 3溶氧阶段培养溶氧阶段培养溶氧阶段培养溶氧阶段培养 不同细胞和同一细胞在不同生长时期对氧的需求均不相同.有人 发现细胞生长的最适溶氧值为60% , 但有人发现杂交瘤的最适溶氧为100%。一般说来, 溶氧主要影响细胞的繁殖, 而对产物的生成无直接影响, 通过影响细胞生长间接起作用。通常在细胞生长初期控制溶氧的较低的水平, 在对数生长期, 当细胞达到较高的浓度时, 提高溶氧水平; 在产物生成期, 应控制溶氧的适当水平。溶氧过高, 细胞就会加速消耗营养物质, 产生许多代谢产物。这些代谢产物对细胞有抑制作用, 会大大降低细胞的存活率, 降低产物的比生成速率。溶氧过低, 细胞过氧的需求得不到满足, 依然会降低产物蛋白的产率。凯蒸搀搜桑吼制利协申想罚疡芜害玲你禹滁诫枣裤强哥驳壁证敦征驳储贺动物细胞培养技术动物细胞培养技术2. 1. 4化学试剂诱导阶段培养化学试剂诱导阶段培养 如果构建的细胞上有可诱导基因, 进入产物生成期后, 就可以添加化学试剂对基因进行诱导, 以实现目的基因的高表达, 比如,将表达尿激酶原和二氢叶酸还原酶基因的两个转录单位置于同一载体, 分别受金属硫(M T ) 和SV 40 早期启动子控制, 具有用氨甲喋呤(M TX) 使基因扩增和利用金属Zn2+ 诱导的双重功能, 有利于尿激酶的高表达。亲焦呢语酗姚课列盛趣表烫偶野斋唆庙础柞雇讲协东诽迷譬赖脐音痰豌遭动物细胞培养技术动物细胞培养技术 细胞在细胞周期的不同时期, 不仅蛋白的分泌速率不同, 而且所分泌蛋白的类型和糖基化程度也可能不同。因此, 研究并控制细胞的生理状态很重要。然而, 在细胞培养中, 细胞生理状态的检测很麻烦。有人发现,细胞大小随各时期变化很明显, 因此可以作电子细胞计数器就行了。分段培养应结合具体的培养条件进行。有些细胞的最适生长温度和产物生成温度相同, 就不能进行温度阶段培养, 而应寻找别的差异条件。在细胞生长期有的细胞可能会因比生长速率过大而产生非生产性细胞, 这时就应控制比生长速率在一个适当的范围。饵秦咳陪檄损爸蝗辞四曝酶嚎旦耿蛙韩撞刨厂榜蓟陪辖羌纯庇嫡每溅簧瞄动物细胞培养技术动物细胞培养技术3 3代谢调控培养代谢调控培养代谢调控培养代谢调控培养 乳酸和氨是在培养过程中动物细胞产生的主要代谢产物 , 对细胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。在分批培养和补料分批培养中的这一问题尤为突出。尽管灌注培养可以通过提高灌注速度来去除抑制产物。但是, 一方面由于灌注培养细胞浓度很高, 提高灌注速率, 营养成分的供给十分充分, 氨和乳酸的产生速率也增加了。另一方面, 过高的灌注速率提高了细胞的比生长速率, 降低产物的比产率, 加上细胞对营养的利用并不彻底, 培养液中会残留大量的蛋白, 造成提取纯化的不便和培养基的浪费。所以, 在培养中调控动物细胞的代谢途径一直较受重视。通过代谢调控, 可以减少副产物的产生, 降低细胞的死亡速率, 还可以控制灌注速率和培养液成分, 控制细胞的状态和比生长速率, 以提高目标蛋白的产率。具体有以下方法。咖启仟有节锯徊驼棚镍由擎秩舜海县恳蕴掉滔磊灼肥唤情乃赵愈嘛员酷菇动物细胞培养技术动物细胞培养技术3. 13. 1控制葡萄糖浓度法控制葡萄糖浓度法控制葡萄糖浓度法控制葡萄糖浓度法 乳酸浓度升高,会导致比生长速率降低, 比死亡速率升高。乳酸的降低可更换葡萄糖为己糖如果糖或半乳糖 , 还可限制葡萄糖减少乳酸的生成, 使初始葡萄糖浓度较低, 在培养过程中再添加。在控制葡萄糖浓度法培养中, 生长期可以使葡萄糖浓度稍高, 以促进细胞生长; 在产物合成期降低葡萄糖的浓度, 降低乳酸的产生速率, 避免乳酸的积累, 减少毒害, 降低死亡速率, 维护持活细胞数在较高水平。同时还可以降低比生长速率, 增加目标蛋白的产生速率。 灌注葡萄糖的同时, 要间歇或连续地加入其他组分, 以避免营养缺乏, 其中谷氨酰胺要保持在较低水平, 因为细胞的生长不依赖糖酵解 , 即使没有葡萄糖, 细胞仍可以通过降解谷氨酰胺获得能量。假如谷氨酰胺的浓度过高, 细胞就会偏向谷氨酰胺酵解, 从而削弱这种方法的效果。由于葡萄糖的价格相对低廉, 这种方法很有前途。验艰缓肋怠偶帘埔蹬刃睦曙竖谆钟充锯乔笛袄攫鉴白募号薄冲闲聪戳含素动物细胞培养技术动物细胞培养技术3. 2控制谷氨酰胺法控制谷氨酰胺法 上面提到, 没有葡萄糖, 细胞可以利用谷氨酰胺作能量物质。因此, 控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些, 应用这一方法的报道也较多。控制谷氨酰胺浓度的目的, 主要是减少氨的产生。氨对细胞的毒性比乳酸大得多, 表现为降低比生长速率, 增加死亡速率。有人详细地研究了动物细胞的代谢过程, 采用底物限制补料分批工艺对动物细胞进行代谢控制。他采用这一方法, 使氨的浓度降低了一半。控制谷氨酰胺法与控制葡萄糖法一样, 要维持葡萄糖在较低水平。灶枣钳累竞掂版效棱弊末奢渊架类捕跺俺赎太啄伸谦妹剩灾倡稠泛研诣羔动物细胞培养技术动物细胞培养技术3. 3控制葡萄糖和谷氨酰胺法控制葡萄糖和谷氨酰胺法 在细胞中, 葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切相关。葡萄糖消耗上升, 则谷氨酰胺消耗下降, 反之亦然。在相当大的一个范围内, 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率与其浓度成正比。控制葡萄糖和谷氨酰胺法可降低乳酸和氨的产生, 还能有效控制比生长速率。在细胞生长期, 提供充分的营养, 供细胞的需要; 在产物合成期, 降低葡萄糖和谷氨酰胺的浓度或流量, 降低比生长速率, 增加目标蛋白的产率。各募疼垒左谦令察区峙挝单纱芭殖憾氟沁浅圣然钳狞韭福憎蓄斟翁裳娶遂动物细胞培养技术动物细胞培养技术3. 4代谢产物的去除代谢产物的去除 通常使用透析膜, 超滤腊或吸附剂选择性去除乳酸、氨或铵离子。有人建议加化学试剂比如钾盐来消除氨的影响 , 也有人建议可使用有谷氨酰胺合成酶的细胞。 灌注培养发展到现在, 还有许多急待解决的问题。其最大的缺点是培养基的利用不充分, 造成一定的浪费。随着细胞培养技术和产品分离技术的进一步发展, 建立细胞培养与产物分离的耦合系统(图2) , 能充分利用培养液, 降低生产成本, 一直是人们追求的目标, 这里就不赘述。嗣韵蛊概祸挝轧胚艳拂豢烂榜迎飘邻顷卯豺错蜒婶彩虚拯他谚牧赵门魔循动物细胞培养技术动物细胞培养技术茂迎呐塞琶抽擞甲爆纷峦物涵感垮肩搜丽漆涸俱镣淑是辊侥庸省骏夷藩庆动物细胞培养技术动物细胞培养技术三三 . 动物细胞无血清培养技术动物细胞无血清培养技术 动物细胞无血清培养是生物科学领域中的重要研究课题之一。由于无血清培养基可以是完全采用已知分子结构和构型组分的低蛋白或无蛋白培养基。因而它不仅为研究和阐明细胞生长、增殖和分化的调节机制提供了有力的工具，而且为现代生物技术，尤其是细胞工程的应用准备了更好的条件。下面就动物细胞无血清培养基及其应用现状做一概述。 1 1 动物细胞培养基的发展过程：动物细胞培养基的发展过程：动物细胞培养基的发展过程：动物细胞培养基的发展过程： （1）天然培养基阶段 （2）合成培养基阶段 （3）无血清培养阶段怖嘲蹬傲逸歌奔堆蚂何亏尤移判畜亢弟揽氏获印姆蝉蜘恿阅雪拉逻煎倚狞动物细胞培养技术动物细胞培养技术2 动物细胞培养中血清的作用和可能引发的问题动物细胞培养中血清的作用和可能引发的问题作用作用： （1）提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。（2）提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白，并通过与上述物质的结合而起到稳定和调节上述物质的作用。此外结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。（3）提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子。（4）提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。（5）提供 PH 缓冲物质，调节培养基PH。（6）影响培养系统中的某些物理特性如：剪切力、黏度、渗透压和气体传递速度等。葫善羽尹钠扰儡菌潦韧筑隶富隐吩澳迷肢恢袱鸣沂茫皖幻蝗鹰昂淖汾最宵动物细胞培养技术动物细胞培养技术可能引发的问题可能引发的问题：（1）在一些基础研究中，往往影响实验结果。（2）血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制 物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用。（3）血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等细胞产品的分离纯化带来很大困难。3 无血清培养基的组成及其主要补充成分无血清培养基的组成及其主要补充成分（1）激素和生长因子（2）结合蛋白（3）贴壁因子和扩展因子（4）低分子量营养因子康择矢蜀棺驻叠瞥扭隧鹤檬陪肉抠糙掉惫刁顶耸方秉囱剥铲俘添吞见牲螺动物细胞培养技术动物细胞培养技术4 .4 .无血清培养基的优缺点及其应用无血清培养基的优缺点及其应用无血清培养基的优缺点及其应用无血清培养基的优缺点及其应用优点：优点：优点：优点：（1）可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。（2）避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。（3）避免血清组分对实验研究的影响。（4）有利于体外培养细胞的分化。（5）可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。已应用的领域有：已应用的领域有：已应用的领域有：已应用的领域有：（1）研究细胞的分化条件（2）用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究（3）用于从多种细胞混杂的培养基中选择目的细胞（4）肿瘤病理学和病因学的研究（5）用于生产疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品缺点缺点缺点缺点：组要表现为细胞的适用范围窄，细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。拍庸旨侧愚错莱恐签似奴涟兜胚瞥夸钟梧瞅棋张惨姻烙茬空花辞斟虫纹瘁动物细胞培养技术动物细胞培养技术四四. 动物细胞培养生物反应器动物细胞培养生物反应器 细胞培养生物反应器是整个过程的关键设备,它要为细胞提供适宜的生长环境并决定着细胞培养的质量和产量。按照动物细胞的生长要求, 具备低的剪切效应、较好的传递效果和流体力学性质是这类反应器设计或改进所必须遵循的原则。号羊冷娩批庐摈桓小庆酗栗谅土晤忠慌和苍绰亨绷塞荆琉早芯尤柱力篆浙动物细胞培养技术动物细胞培养技术1 搅拌式生物反应器搅拌式生物反应器 搅拌式反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力,它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性, 因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护, 因此对剪切作用十分敏感,直接的机械搅拌很容易对其造成损害, 传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以, 动物细胞培养中的搅拌式反应器都是经过改进的, 包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在反应器内加装辅件等。佐肄身泛臃怒楔惶奏憎拥帖鸟沫处粳叹具翠口兽抑捂若庶埠梗虚铬惦讥额动物细胞培养技术动物细胞培养技术1. 1 供氧方式的改进供氧方式的改进 一般情况下, 搅拌式反应器还常伴有鼓泡, 为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感, 所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。 笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种, 即气泡用丝网隔开, 不与细胞直接接触。反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力, 以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞反应器, 整体呈梨形, 搅拌置于反应器底部, 在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡, 丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。胰老疼竞浇悍蒋烽观颅转逾馁脸谱稼盲搪将罚褥狰沃困棠裴牵宴配撰矾嚏动物细胞培养技术动物细胞培养技术1. 2 搅拌桨的改进搅拌桨的改进 搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大, 这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进, 并在反应器内加装了辅件, 实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨, 顶部的法兰盖上安装了3 块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30, 垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力, 实验中用于昆虫细胞的培养, 最终的培养密度达到6 106 个/ mL , 成活率在98 %以上。宗途溜镰潦牟符狰赌贸臂蓖氟汹处阉潮宅勋润涨巩霓浦夕侦市堂群聪邦芭动物细胞培养技术动物细胞培养技术2 非搅拌式生物反应器非搅拌式生物反应器 搅拌式生物反应器用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大, 容易损伤细胞, 虽然经过各种改进, 这个问题仍很难避免。相比之下, 非搅拌式反应器产生的剪切力较小, 在动物细胞培养中表现出了较强的优势 .铅场办处乌很眶衷抗笑搐县轮恼赚耀狂攀浦毗煮钵憨奏贾寸胞涸恍潘挥槽动物细胞培养技术动物细胞培养技术2. 1 填充床反应器填充床反应器 填充是在反应器中填充一定材质的填充物, 供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供, 并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带, 因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小, 适合细胞高密度生长。 Park 等人在由填充床反应器和外循环装置构成的连续流动的培养系统中培养动物细胞。反应器中的填料是带有微孔的陶瓷珠粒, 细胞在微孔内生长, 同时培养液也可以在孔内扩散。实验证明该反应器适于动物细胞的高密度培养, 细胞终期密度应器适于动物细胞的高密度培养, 细胞终期密度达到了5 108 个/ mL 。彤挂窖组田撤揍侥请荷矮瓷渠顶暴倘惺将烟娟墙卑遥普栋蚁卉芹表章均羡动物细胞培养技术动物细胞培养技术2. 2 2. 2 中空纤维反应器中空纤维反应器中空纤维反应器中空纤维反应器 中空纤维反应器 由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类反应器由中空纤维管组成, 每根中空纤维管的内径约为200m , 壁厚为5070m。管壁是多孔膜, O2和CO2 等小分子可以自由透过膜扩散, 动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长, 可以很方便地获取氧分 。 John 等报道了一个用于大规模培养动物细胞的径向流中空纤维反应器。该反应器内有一个垂直的中央分配管, 外面由中空纤维管与分配管呈平行组成一个环状床层。培养液由中央分配管径向流过中空纤维床, 细胞在中空纤维外壁贴附并生长。空气和CO2 的混合气体在中空纤维间与培养液成错流流过床层, 向细胞提供氧分并维持一定的pH值环境, 细胞的代射物随气流带出。在这个反应器中细胞生长的表面密度可达7. 3 106 个/ cm2 。 掂涝慷努劳忆躇普邻玉傅挡雁菠蘑淋娜背娶儿社察误农耗枣缠况哦题断瞧动物细胞培养技术动物细胞培养技术2. 3 气升式生物反应器气升式生物反应器 气升式生物反应器(airlift bioreactor) 也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一, 其特点是结构简单, 操作方便。 有人在气升式反应器中利用微载体培养技术, 研究了Vero 细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero 细胞, 在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下,细胞可以正常生长至长满微载体表面, 终密度可达1. 13 106 个/ mL 。钡皋勇智六竿道利洱席翅秦杯誓纪袭颠卧唆孵佬猾眺纬墟疟趟悸哨砷俗待动物细胞培养技术动物细胞培养技术4 4 结语结语结语结语 动物细胞培养的关键设备是细胞培养反应器,主要解决的共性问题都是要按照动物细胞的生长要求, 使反应器具备低的剪切效应、良好的传递效果和流体力学性质。但在实际过程中, 这些原则总有一些相互制约的因素, 为了强化传递效果需要有一个充分的混合环境(包括气体鼓泡) , 但动物细胞的脆弱性制约了这个环境的形成;为提高培养介质中的溶氧度需要有较高的氧分压,不过, 高的氧分压也影响了代谢物的移出。同时,过高的氧分压也影响细胞的正常生长。如何优化这些制约, 是这类反应器开发中要解决的问题。在动物细胞培养中, 反应器的改进大多针对搅拌式反应器。虽然这类反应器剪切力大, 但由于它混合均匀、结构简单、操作方便以及良好的传递效果和操作弹性, 在大规模细胞培养中仍占有重要的位置 。锭轿球缓象拓客荧就浦遮菱酒鸳荷革谰州腔鳃潞筐啼职桃赖坝痹绍当盏奥动物细胞培养技术动物细胞培养技术 目前, 研究工作要致力于开发高密度细胞培养反应器, 提高细胞生产率或生物产物的浓度。尤其组织工程的迅速发展, 对动物细胞生物反应器有了不同要求。要保持细胞离体培养时能具有同体内一样的三维异性结构、维持分化细胞的功能并支持细胞的高密度生长 , 培养过程要考虑种植有细胞的三维基质支架和生物反应器所组成的培养系统。事实上, 一种反应器的开发不可能满足动物细胞生长的所有要求, 同时也不可能适合所有的细胞培养方式。所以, 根据某种细胞的培养过程或细胞的某种培养方式, 开发专用反应器也许会比通用反应器有更好的效果。属珐姆抹亿催缸宗羚芥褒旭呵做妒胺氦奉尿晌翱厩聊溅晌统液洁部蝎怪涨动物细胞培养技术动物细胞培养技术五其它方法：改变细胞特性五其它方法：改变细胞特性 在大规模动物细胞培养的初期, 细胞数量不断增加, 表达重组蛋白的能力也在逐步提高L细胞表达随细胞数量达到顶峰之后, 细胞数量和表达水平将下降L 因为用于生产具有重要医用作用的生物活性蛋白的工程细胞, 其基因组普遍整合了病毒载体, 这就从根本上决定了细胞最终命运是细胞凋亡L 目前已知参与细胞凋亡调控基因包括c2m yc、c2jun、bcl22、c2fo s、ras、p 53、bcl2x、bax 等,有些促进细胞凋亡, 有些抑制细胞凋亡L将抑制细胞凋亡的bcl22 基因导入细胞, bcl22 基因的过量表达可抑制Gln 或缺氧引起的细胞凋亡, 减少细胞特定营养成分的消耗, 提高细胞密度和目的蛋白产量L已证实bcl22 基因的过度表达可以提高灌流培养中杂交瘤细胞的活性和抗体的生产率.冉歼闰曾活贾搪搂俩猾涅樊湖苍舒彩妊慷狡保蔼吧脂钞智戮扇册窗扣心赫动物细胞培养技术动物细胞培养技术六结语六结语 一项新的细胞培养技术的发展成熟需要较长的时间。大规模培养动物细胞是一项复杂而且经验性很强的工作L严格控制细胞培养的环境, 防止污染, 是进行大规模培养的前提L通过减少培养基中各种不利因素, 配置细胞生长的专一性无血清培养基, 以及选择条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器和最适合细胞生长的微载体,可提高细胞的活性和表达水平 务执侄庭补雌甄矾增枪昏胁菱幢扒杠宜湿厄锋饲郝监蚊锥条晓箕标魏凑鞭动物细胞培养技术动物细胞培养技术蓖盼畅抓宛球锰诣甄疯司疡粪材傣痊沮拣岛霍惯儿狼米浴济净皱舍记臂疹动物细胞培养技术动物细胞培养技术感谢:各位的光临!词迫席咆圭隆归采搭卯壹缉趴惑依仆靛将窥杏库叶燥庞几梅沥宇赐铀愚亡动物细胞培养技术动物细胞培养技术