1-1 DNADNA重组技术的重组技术的基本工基本工具具和和基本操作程序基本操作程序专题1 基因工程一 基因工程的基本内容主要内容（一）基因工程的概念（二）基因工程的基本工具（三）基因工程的基本操作程序（四）基因工程的应用 基因工程的概念基因工程的概念 基因工程又叫基因工程又叫基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术。该技术是在。该技术是在生物体外生物体外，通过对，通过对DNADNA分子进行人工分子进行人工“ “剪切剪切” ”和和“ “拼接拼接” ”，对生物的基因进行，对生物的基因进行改造改造和和重新组合重新组合，然后，然后导入受体细胞导入受体细胞内进行无性繁殖，使重内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内组基因在受体细胞内表达表达，产生出人类所需要的，产生出人类所需要的基因产物基因产物。复习 基因工程基因工程培育抗虫棉的培育抗虫棉的简要过程简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因与运载体与运载体DNADNA拼接拼接导入导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)复习 基因工程的关键步骤：基因工程的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体DNADNA连接连接关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体( (棉花棉花) )细胞细胞复习 解决基因工程关键步骤需要的工具解决基因工程关键步骤需要的工具关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：限制性内切酶限制性内切酶DNADNA连接酶连接酶运载体运载体复习 基因的剪刀基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）限制性内切酶（简称限制酶） 限制酶是在生物体限制酶是在生物体( (主要是主要是微生物微生物) )内的一种酶，能将外来的内的一种酶，能将外来的DNADNA切断切断，由于这种切割作用是在，由于这种切割作用是在DNADNA分子内部进行的，分子内部进行的，故名限制性内切酶。故名限制性内切酶。 特点：特异性。特点：特异性。 即即一种一种限制酶限制酶只能识别一种只能识别一种特定的特定的核苷酸序列核苷酸序列，并且能在，并且能在特定的切点特定的切点上切割上切割DNADNA分子。分子。复习识别序列大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。也有少数限制酶识别序列由4、5、或8个核苷酸组成。迄今为止，有迄今为止，有300300多种微生物多种微生物中分离出中分离出40004000种限制酶种限制酶 大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)(E.coli)的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别GAATTCGAATTC序列序列，并在，并在G G和和A A之间切开。之间切开。限制酶限制酶限制酶限制酶 被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，带有几个两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正好，他们之间正好互补配对互补配对，这样的，这样的切口叫切口叫黏性末端黏性末端。平末端平末端 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？提问要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。 如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生会产生相同的黏性末端相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合黏合起来，就似乎可以合成重组的起来，就似乎可以合成重组的DNADNA分子了。分子了。2、基因的针线DNA连接酶 DNADNA连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙“ “缝合缝合” ”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的一个重组的DNADNA分子就形成了。分子就形成了。E.coliDNA连接酶从大肠杆菌中分离得到的。只能用于粘性末端的连接T4DNA连接酶从T4噬菌体中分离得到的。既能用于粘性末端的连接，又能用于平末端的连接，但是平末端的连接效率低。为什么要用运载体？1 1、直接将目的基因连接到受体细胞的、直接将目的基因连接到受体细胞的DNADNA上不能表达。上不能表达。2 2、只有利用某种能够侵染受体细胞，并且在受体细胞中能够复制和表达的载体来用于表达。、只有利用某种能够侵染受体细胞，并且在受体细胞中能够复制和表达的载体来用于表达。作为运载体必须具备哪些条件1 1）能够在宿主细胞中）能够在宿主细胞中复制复制并稳定地并稳定地保存保存。2 2）具多个）具多个限制酶切点限制酶切点，以，以便与外源基因连接便与外源基因连接。3 3）具有某些）具有某些标记基因标记基因，便于进行，便于进行筛选筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。常用的运载体主要有两类：1 1）细菌细胞质的）细菌细胞质的质粒质粒2 2）噬菌体噬菌体或某些或某些动植物病毒动植物病毒 质粒：质粒： 质粒是染色体外能够进行质粒是染色体外能够进行自主复制自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNADNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的核以外的DNADNA分子分子。 质粒质粒是基因工程是基因工程最常用最常用的的运载体运载体。 绝大多数细菌质粒都是绝大多数细菌质粒都是闭合环状闭合环状DNADNA分子分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。 大肠杆菌的质粒：大肠杆菌的质粒： 最常用的质粒最常用的质粒是是大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒，其中常含有，其中常含有抗药抗药基因基因，如四环素的标记基因。质粒的，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用胞生存没有决定性作用，但，但复制只能在宿主细胞内成复制只能在宿主细胞内成。原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子不编码蛋白质。：编码蛋白质 ,连续不间断编码区非编码区原核细胞的 基因结构调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的和具有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码 四个基本步骤：四个基本步骤：三、基因工程的基本操作程序1 1）提取提取目的基因目的基因2 2）目的基因）目的基因与运载体结合与运载体结合3 3）将目的基因）将目的基因导入导入受体细胞受体细胞4 4）目的基因的）目的基因的检测检测和和表达表达 目的基因目的基因 目的基因是人们所目的基因是人们所需要转移需要转移或或改造改造的基因。的基因。 如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因，还有植物的，还有植物的抗病抗病（抗病抗病毒毒、抗细菌抗细菌）基因基因、种子、种子贮藏蛋白的基因贮藏蛋白的基因，以及人的，以及人的胰岛素胰岛素基因基因、干扰素基因干扰素基因等。等。供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶1、目的基因的获取1目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子2获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成概念：基因文库 （gene library）基因组文库部分基因文库（如cDNA文库） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.基因组文库与部分基因文库的关系cDNA文库的构建mRNA 反转录cDNA(互补DNA） DNA聚合酶双链DNA反转录法：基因重组反转录酶mRNAcDNA基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。利用PCR技术扩增目的基因PCR聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。DNADNA序列自动测序仪：序列自动测序仪：PCRPCR技术技术： 对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。增。v 人工合成根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成3、基因表达载体（重组质粒）的构建（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同1过程:2基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞条件条件 步骤二：目的基因与运载体重组步骤二：目的基因与运载体重组 1 1）用一定的）用一定的限制酶切割质粒限制酶切割质粒，使其出现，使其出现一个切口一个切口，露出，露出黏性末端黏性末端。 2 2）用）用同一种同一种限制酶限制酶切断目的基因切断目的基因，使其产生，使其产生相同相同的的黏性末端黏性末端。 3 3）将切下的目的基因片段）将切下的目的基因片段插入质粒插入质粒的切口处，再加入适量的切口处，再加入适量DNADNA连接酶连接酶，形成了一个，形成了一个重组重组DNADNA分子分子（重组质粒）（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程基因重组的过程。质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同一种过程:2、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。 步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞 1 1）将细菌用）将细菌用CaClCaCl2 2处理处理，以，以增大增大细菌细菌细胞壁的通透性细胞壁的通透性。 2 2）使含有目的基因的）使含有目的基因的重组质粒进入重组质粒进入受体细胞。受体细胞。 3 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制复制，由于细菌，由于细菌繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获非常快，在很短的时间内就能获得得大量大量的目的基因。的目的基因。1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌（2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA 步骤四：目的基因的检测和表达步骤四：目的基因的检测和表达四环素四环素抗性基因抗性基因氨苄青霉氨苄青霉素抗性基因素抗性基因(四)目的基因的检测与鉴定检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法DNA分子杂交表达检测转录检测分子杂交翻译检测抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达表达。 受体细胞摄入受体细胞摄入DNADNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？分子后就说明目的基因完成了表达吗？若不能表达，要对抗虫基因再进行若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰修饰。知识延伸DNA分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。返返 回回DNA附着在膜上硝化纤维素加探针报告基因（含荧光素分子）变性DNA杂交（如检测SARS病毒等）abcd复习题1）将目的基因导入受体细胞有哪些方法?(试举例说明)2）简述农杆菌转化法非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核1 1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习练习2 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A A、能复制、能复制 （ ） B B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C C、具有标记基因、具有标记基因 D D、它是环状、它是环状DNADNAD练习3 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A练习4 4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D练习5 5）基基因因工工程程是是在在DNADNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基基互互补补配配对对的的步步骤是骤是 （ ） A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C练习