会计学1发酵发酵(f jio)工程课程设计酵母菌高密发工程课程设计酵母菌高密发酵酵(f jio)第一页，共24页。组员组员(zyun)(zyun)第1页/共23页第二页，共24页。高细胞密度高细胞密度(md)(md)发酵发酵（highcelldensityhighcelldensityfermentation,HCDFfermentation,HCDF）高细胞密度发酵是一个相对的概念，一般指发酵液中细胞浓度在30g/L以上。但是(dnsh)对于一些极端微生物或自养微生物，细胞浓度如果达到1g/L也算比较高的细胞密度。影响因素：培养基、接种量、生长(shngzhng)抑制性物质、溶解氧浓度、温度、pH等过程控制途径：培养基设计、反应器的设计和选择、发酵控制策略等第2页/共23页第三页，共24页。酵母的高密度发酵是一个相对的概念，一般指发酵液中的酵母细胞(xbo)浓度在100g/L以上。酵母属大约包括40种，每个种都能通过出芽产生球状或椭圆状的细胞(xbo)。酵母菌是一种兼性厌氧菌，当酵母在低浓度的葡萄糖中进行好氧生长时，它能把葡萄糖分解成二氧化碳和水。当酵母在厌氧条件下生长时，葡萄糖主要生成乙醇和二氧化碳。酵母菌的高细胞密度(md)发酵第3页/共23页第四页，共24页。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是发酵(f jio)工业最常用的菌种之一在发酵中如果单方面提高发酵在发酵中如果单方面提高发酵液中的碳源含量，酵母菌就会液中的碳源含量，酵母菌就会生成乙醇或乙酸，但其生物量生成乙醇或乙酸，但其生物量则有所下降；如果将碳源保持则有所下降；如果将碳源保持在最低水平，就会限制酵母的在最低水平，就会限制酵母的生长。而利用分批补料发酵的生长。而利用分批补料发酵的方式方式(fngsh)，既可以满足，既可以满足高密度高密度 发酵时酵母细胞对营养发酵时酵母细胞对营养源的大量需求，又能减少生长源的大量需求，又能减少生长抑制物质的产生。抑制物质的产生。第4页/共23页第五页，共24页。影响影响(yngxing)(yngxing)酵母高细胞密酵母高细胞密度发酵的因素度发酵的因素n n培养基的营养物质n n溶解氧（DO）n n压力(yl)n nCO2n n温度n npH值n n发酵液的流变学n n接种量n n生长抑制性物质第5页/共23页第六页，共24页。培养基的营养物质的影培养基的营养物质的影响响(yngxing)(yngxing)培养基中的基质培养基中的基质(j zh)的种类和浓度直接影响到细胞的的种类和浓度直接影响到细胞的代谢变化和产物的合成。在发酵前期，碳源和氮源的浓度代谢变化和产物的合成。在发酵前期，碳源和氮源的浓度迅速下降，在中后期主要用于合成产物，其浓度下降趋于迅速下降，在中后期主要用于合成产物，其浓度下降趋于平稳。碳源和氮源的比例偏小，会导致细胞生长旺盛，提平稳。碳源和氮源的比例偏小，会导致细胞生长旺盛，提前衰老自溶；而其比例偏大，则细胞繁殖数量少，代谢不前衰老自溶；而其比例偏大，则细胞繁殖数量少，代谢不平衡，不利于产物积累。平衡，不利于产物积累。所需营养物质：水分所需营养物质：水分(shufn)、碳、碳源物质、氮源物质、无机元素、生长源物质、氮源物质、无机元素、生长因子因子第6页/共23页第七页，共24页。在高细胞密度发酵过程中，如果(rgu)葡萄糖浓度超过其一阈值，碳源供给量高于酵母所能同化的速率，即使是在供氧充足的条件下也会发生克拉布特里（Crabtree）效应而产生乙醇，而糖的有氧氧化受到抑制，这是对发酵不利的。所以要对营养物的配比进行优化解决途径：在实际发酵中，基质浓解决途径：在实际发酵中，基质浓度和碳源氮源比例主要依靠度和碳源氮源比例主要依靠(yko)流加补料来实现和维持。（碳氮比、流加补料来实现和维持。（碳氮比、流加量、流加频率）流加量、流加频率）第7页/共23页第八页，共24页。种子培养基：蔗糖种子培养基：蔗糖(zhtng)25g/L，尿素，尿素3g/L，KH2PO4 10g/L,MgSO4 2.5g/L,微量元素微量元素10 ml/L，维生素液，维生素液15ml/L，pH 5.0（供发酵前菌体大量生长繁殖）（供发酵前菌体大量生长繁殖）发酵发酵(f jio)培养基：（培养基：（NH4）2SO4 15g/L，KH2PO4 8.0g/L，MgSO4 3.0g/L,微量元素液微量元素液 10 ml/L，消泡剂，消泡剂 0.3ml/L，ZnSO4 流加培养基：流加培养基：KH2PO4 9.0g/L,MgSO4 2.5g/L,K2SO4 3.5g/L,NaSO4 0.28g/L,蔗糖蔗糖500g/L（流加补料，用于维持（流加补料，用于维持高比生长速率高比生长速率(sl)或者高产物生产速率或者高产物生产速率(sl)）我们用的培养基类型我们用的培养基类型第8页/共23页第九页，共24页。微量元素配方微量元素配方(pifng)(pifng)和维生和维生素配方素配方(pifng)(pifng)n n微量元素:在1L溶液中含有EDTA15g，znso45.75g,Mncl20.32g,Cuso40.50g,Cocl20.47g,Na2MoO40.48g,Cacl22.9g,Feso42.8g,121湿热灭菌20min待用。n n维生素：在1L溶液中含有维生素H0.05g，泛酸钙1.0g，烟酸(ynsun)1.0g，肌醇25.0g,对氨基苯甲酸0.2g，硫胺素1.0g，吡哆醇1.0g。第9页/共23页第十页，共24页。碳源与氮源分开灭菌，防止碳源与氮源分开灭菌，防止(fngzh)“美拉德反应美拉德反应”产生有毒产生有毒物质抑制菌体生长；物质抑制菌体生长；蔗糖要单独灭菌后加入，尿素和维蔗糖要单独灭菌后加入，尿素和维生素液通过微孔滤膜过滤除菌后加生素液通过微孔滤膜过滤除菌后加入；入；培养基配制(pizh)注意事项第10页/共23页第十一页，共24页。溶解氧（溶解氧（DODO）的影响）的影响(yngxing)(yngxing)DO是发酵工程中的一个关键限制因素，是高是发酵工程中的一个关键限制因素，是高细胞密度发酵过程中影响酵母细胞密度发酵过程中影响酵母(jiom)生长的生长的重要因素之一。在高密度发酵的后期由于细胞重要因素之一。在高密度发酵的后期由于细胞密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数不能满足对氧的供给，造成参数不能满足对氧的供给，造成DO下降，细下降，细胞生长减慢。胞生长减慢。溶解氧（DO）范围(fnwi)：40%DO60%.第11页/共23页第十二页，共24页。适当提高搅拌转速，增加气液接触面积，有利于氧的传递，但搅拌速率过大会使发酵泡沫过多，反而(fn r)会导致DO降低。2. 增大空气流量空气流量的增大减小了氧传质工程中的气膜阻力，有利于氧的传递吸收。但过大的流量会形成“过载”现象，使大量发酵液蒸发，引起浓缩和粘度上升。增加增加(zngji)发酵液中发酵液中DO的方法的方法第12页/共23页第十三页，共24页。第13页/共23页第十四页，共24页。压力压力(yl)(yl)的影响的影响在发酵工程中必须保持罐压为正压，如果罐压在发酵工程中必须保持罐压为正压，如果罐压为为0或者负压，则会造成细胞的染菌，甚至造成或者负压，则会造成细胞的染菌，甚至造成整罐发酵液的废气。罐压增高能适度增加氧在整罐发酵液的废气。罐压增高能适度增加氧在发酵液中的溶解发酵液中的溶解(rngji)度，但二氧化碳在水度，但二氧化碳在水中的溶解中的溶解(rngji)度要比氧大度要比氧大30倍，溶解倍，溶解(rngji)过多的二氧化碳会造成细胞染菌，所过多的二氧化碳会造成细胞染菌，所以罐压也不能太高。以罐压也不能太高。我们(w men)选取的罐压为.第14页/共23页第十五页，共24页。CO2CO2的影响的影响(yngxing)(yngxing)酵母生长过程酵母生长过程(guchng)中产生大量的中产生大量的CO2对细胞具有直接的毒害作用，而且对细胞具有直接的毒害作用，而且溶解于发酵液中会导致溶解于发酵液中会导致pH值的下降。值的下降。发酵液中的发酵液中的CO2的溶解度达到的溶解度达到7.04%就就可抑制酵母细胞的生长，高于可抑制酵母细胞的生长，高于4%则生则生长下降，一般发酵液中的长下降，一般发酵液中的CO2的溶解度的溶解度应控制在应控制在1%3%之间。之间。第15页/共23页第十六页，共24页。pHpH值的影响值的影响(yngxing)(yngxing)在发酵过程中，在发酵过程中，pH值的变化取决于所用的菌种、培养基值的变化取决于所用的菌种、培养基和培养条件。如果和培养条件。如果(rgu)pH值的波动导致其偏理了细胞值的波动导致其偏理了细胞所需的最适范围，将会引起各种酶活力的改变，影响细所需的最适范围，将会引起各种酶活力的改变，影响细胞代谢。酵母细胞利用酵母细胞利用葡萄糖产酸产气，胞代谢。酵母细胞利用酵母细胞利用葡萄糖产酸产气，发酵时产生的有机酸（主要是乙酸）可导致发酵液的发酵时产生的有机酸（主要是乙酸）可导致发酵液的pH值降低。另外细胞释放的值降低。另外细胞释放的CO2也会导致也会导致pH的降低。的降低。啤酒酵母的最适.我们发酵用PH=5.0调节PH用氨水或者硫酸铵，可以视情况随同(sutng)补料一块添加第16页/共23页第十七页，共24页。接种接种(jizhng)(jizhng)量的影响量的影响n n接种量是指移入的种子液和培养液体积接种量是指移入的种子液和培养液体积接种量是指移入的种子液和培养液体积接种量是指移入的种子液和培养液体积的比例，它的大小决定了菌种在发酵罐的比例，它的大小决定了菌种在发酵罐的比例，它的大小决定了菌种在发酵罐的比例，它的大小决定了菌种在发酵罐中的生长速度。过多过少都不好，在一中的生长速度。过多过少都不好，在一中的生长速度。过多过少都不好，在一中的生长速度。过多过少都不好，在一定范围内增加接种量有利于菌体的生长。定范围内增加接种量有利于菌体的生长。定范围内增加接种量有利于菌体的生长。定范围内增加接种量有利于菌体的生长。因此，接种应根据实际情况因此，接种应根据实际情况因此，接种应根据实际情况因此，接种应根据实际情况(qngkung)(qngkung)(qngkung)(qngkung)确定接种量。确定接种量。确定接种量。确定接种量。在常见的小型发酵罐中接种量范围(fnwi)在5%10%。我们取最大接种量10%第17页/共23页第十八页，共24页。后期补料量后期补料量(liolin)(liolin)及参数及参数n n发酵发酵发酵发酵(f jio)(f jio)开始开始开始开始是为分批发酵是为分批发酵是为分批发酵是为分批发酵(f (f jio)jio)，当作为碳源，当作为碳源，当作为碳源，当作为碳源的蔗糖耗尽后，表的蔗糖耗尽后，表的蔗糖耗尽后，表的蔗糖耗尽后，表现为现为现为现为DODO的突然升的突然升的突然升的突然升高和高和高和高和CO2CO2产生量、产生量、产生量、产生量、O2O2消耗量的突然上消耗量的突然上消耗量的突然上消耗量的突然上升，这时开始流加升，这时开始流加升，这时开始流加升，这时开始流加培养。培养。培养。培养。第18页/共23页第十九页，共24页。生产条件生产条件(tiojin)(tiojin)总汇总汇n n接种量：接种量：10%10%n n温度：温度：3030n nDODO溶解度：溶解度：40%60%40%60%n nCO2CO2溶解度：溶解度：1%3%1%3%n n转速：转速：300rpm600rpm300rpm600rpmn n调节调节PHPH：氨水或者：氨水或者(huzh)(huzh)硫酸铵硫酸铵n n补料时间：有待观察（补料时间：有待观察（24h24h左右）左右）n n通气量：通气量：50100L/h50100L/h第19页/共23页第二十页，共24页。种子培养基：蔗糖种子培养基：蔗糖(zhtng)25g/L，尿素，尿素3g/L，KH2PO4 10g/L,MgSO4 2.5g/L,微量元素微量元素10 ml/L，维生，维生素液素液15ml/L发酵发酵(f jio)培养基：（培养基：（NH4）2SO4 15g/L，KH2PO4 8.0g/L，MgSO4 3.0g/L,微量元素液微量元素液 10 ml/L，消泡剂，消泡剂 0.3ml/L，ZnSO4 流加培养基：流加培养基：KH2PO4 9.0g/L,MgSO4 2.5g/L,K2SO4 3.5g/L,NaSO4 0.28g/L,蔗糖蔗糖(zhtng)500g/L培养基汇总培养基汇总第20页/共23页第二十一页，共24页。n n微量元素：在1L溶液中含有(hnyu)EDTA15g，znso45.75g，Mncl20.32g,Cuso40.50g,Cocl20.47g,Na2MoO40.48g,Cacl22.9g,Feso42.8g,121湿热灭菌20min待用。n n维生素：在1L溶液中含有(hnyu)维生素H0.05g，泛酸钙1.0g，烟酸1.0g，肌醇25.0g,对氨基苯甲酸0.2g，硫胺素1.0g，吡哆醇1.0g。第21页/共23页第二十二页，共24页。The End谢谢谢谢(xi xie)(xi xie)观赏观赏10-10-生技生技 第第6 6组组第22页/共23页第二十三页，共24页。内容(nirng)总结会计学。高细胞密度发酵是一个相对的概念，一般指发酵液中细胞浓度在30g/L以上。但是对于一些极端微生物或自养微生物，细胞浓度如果达到1g/L也算比较高的细胞密度。解决途径：在实际发酵中，基质浓度和碳源氮源比例主要依靠流加补料来实现和维持。蔗糖要单独灭菌后加入，尿素和维生素液通过微孔滤膜过滤(gul)除菌后加入。溶解氧（DO）范围：40%DO60%.。在常见的小型发酵罐中接种量范围在5%10%。10-生技 第6组第二十四页，共24页。