项目一动物组织中核酸的提取与鉴定 一、实验目的一、实验目的 学习和掌握用学习和掌握用盐溶法盐溶法从动物组织提从动物组织提取核酸的原理和操作技术。取核酸的原理和操作技术。 了解定性鉴定核酸的原理和方法。了解定性鉴定核酸的原理和方法。 二、实验原理二、实验原理 根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。将核酸析出，达到分离提纯的目的。 三、实验材料三、实验材料 试剂试剂 地衣酚（地衣酚（orcinol）试剂：）试剂：称取称取100mg地衣酚溶于地衣酚溶于100ml 浓盐酸中，再浓盐酸中，再加入加入100mgFeCl36H2O，该溶液应在使用，该溶液应在使用前新鲜配制。前新鲜配制。 二苯胺试剂：二苯胺试剂：称取称取1g二苯胺（经重结晶）溶入二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋冰醋酸中，再加入酸中，再加入2.75ml浓浓H2SO4摇匀，冰箱内摇匀，冰箱内保存备用。保存备用。 三、实验材料三、实验材料 试剂试剂 0.14mol/L氯化钠溶液氯化钠溶液 （内含（内含0.01mol/L柠檬酸），柠檬酸），250ml； 1mol/L氯化钠溶液，氯化钠溶液，250ml； 95%乙醇（冷）；乙醇（冷）； 氯仿；氯仿； 异戊醇。异戊醇。 三、实验材料三、实验材料 实验器材实验器材 冷冻离心机（冷冻离心机（3000rpm）；）； 组织捣碎机或组织匀浆器；组织捣碎机或组织匀浆器； 不锈钢剪刀；不锈钢剪刀； 冰浴；冰浴； 试管、试管夹；试管、试管夹； 量筒、吸管；量筒、吸管； 带塞比色管、带塞离心管。带塞比色管、带塞离心管。 玻棒、烧杯；玻棒、烧杯； 电炉等。电炉等。 四、实验方法四、实验方法 1. 制匀浆制匀浆 将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L氯化钠溶液（内含氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠柠檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成碎块，放入组织捣碎机中加入碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的倍体积的0.14mol/LNaCl溶液（内含溶液（内含0.01mol/L柠檬柠檬酸）制备匀浆。酸）制备匀浆。 将匀浆置离心机中离心将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。）。上层液倾出留待抽提上层液倾出留待抽提RNA ，下层用二倍体积，下层用二倍体积冷的冷的1mol/LNaCl溶液抽提溶液抽提1h，待分离，待分离DNA核蛋白。核蛋白。 四、实验方法四、实验方法 2. 核酸的抽提核酸的抽提 RNA的提取的提取0.14mol/L的的NaCl抽提液（内含抽提液（内含RNA核蛋白）核蛋白）加入等体积的氯仿和加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带体积的异戊醇，置带塞离心管中，振摇塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白，此时提取液为乳白色混悬液，以色混悬液，以3000rpm离心离心15min，离心物呈，离心物呈三层。三层。 用滴管吸出上层清液，在低温下加入用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.52倍倍的冷的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。低温放置乙醇，并轻轻搅拌。低温放置15min，3000rpm离心离心10min，弃去上清液，即得，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉淀，待定性。颗粒状沉淀，待定性。 四、实验方法四、实验方法 2. 核酸的抽提核酸的抽提 DNA的抽提的抽提将抽提将抽提1h的的1mol/LNaCl匀浆悬液以匀浆悬液以3000rpm离心离心20min，弃去沉淀，将其上清，弃去沉淀，将其上清液倒入带塞的离心管中，加入等体积的氯仿液倒入带塞的离心管中，加入等体积的氯仿及及1/40体积的异戊醇振摇体积的异戊醇振摇30min，离心，离心20min。将其上清液加入。将其上清液加入2倍体积的冷倍体积的冷95%乙乙醇，边加边摇，抽出玻棒，纤维状醇，边加边摇，抽出玻棒，纤维状DNA就缠就缠绕在玻棒上待定性。绕在玻棒上待定性。 每次都需采用冷冻离心。每次都需采用冷冻离心。 四、实验方法四、实验方法 3. 定性试验定性试验RNA的呈色反应的呈色反应 取取2支干净试管，一管加入支干净试管，一管加入1.5ml RNA溶液，溶液，另一管加入蒸馏水另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入，向两管中加入3ml地地衣酚试剂，于沸水中加热衣酚试剂，于沸水中加热10min，由黄色变为，由黄色变为绿色为阳性反应。绿色为阳性反应。 DNA的呈色反应的呈色反应取取2支干净试管，一管加入支干净试管，一管加入1.5mlDNA溶液，溶液，另一管加入蒸馏水另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入，向两管中加入3ml二二苯胺试剂，于沸水中加热苯胺试剂，于沸水中加热10min，由乳白色变，由乳白色变为蓝色为阳性反应。为蓝色为阳性反应。 五、注意事项五、注意事项在提取分离纯化核酸时，为了保持核酸的在提取分离纯化核酸时，为了保持核酸的完整性，防止核酸变性降解，操作时必须完整性，防止核酸变性降解，操作时必须防止过酸或过碱。全部过程应在低温下防止过酸或过碱。全部过程应在低温下(0左右左右)进行，必要时还需加入抑制剂，进行，必要时还需加入抑制剂，以抑制核酸酶的作用。以抑制核酸酶的作用。加氯仿、异戊醇后振摇要充分，但又不能加氯仿、异戊醇后振摇要充分，但又不能太剧烈，以防太剧烈，以防DNA断裂。断裂。 要学会正确使用离心机，离心后，注意上要学会正确使用离心机，离心后，注意上清液和沉淀的取舍。清液和沉淀的取舍。 六、项目总结及练习六、项目总结及练习1. 从动物组织（猪肝）中提取核酸，从动物组织（猪肝）中提取核酸，第一步是破碎肝脏组织细胞，请问第一步是破碎肝脏组织细胞，请问破碎破碎动物细胞的物理方法主要有哪动物细胞的物理方法主要有哪些？（列举些？（列举5种）种）研磨法；研磨法；组织匀浆法；组织匀浆法； 渗透压变动法；渗透压变动法；超声波处理法；超声波处理法； 反复冻融法等。反复冻融法等。六、项目总结及练习六、项目总结及练习2. 为什么在为什么在0.14mol/LNaCl溶液中要加溶液中要加0.01mol/L的柠檬酸，或者说，柠檬酸的柠檬酸，或者说，柠檬酸或柠檬酸钠的作用是什么？与柠檬酸作或柠檬酸钠的作用是什么？与柠檬酸作用相同的物质还有哪些？（最少用相同的物质还有哪些？（最少1种）种）在核酸提取过程中要防止核酸降解。在核酸提取过程中要防止核酸降解。 DNA酶酶可可降降解解DNA，但但DNA酶酶的的活活性性需需要要Mg2+、Ca2+等等金金属属二二价价离离子子的的激激活活，柠柠檬檬酸酸或或柠柠檬檬酸酸钠钠能能螯螯合合这这些些金金属属二二价价离离子子，从从而而抑抑制制DNA酶酶的的活活性。性。与与柠柠檬檬酸酸作作用用相相同同的的物物质质还还有有EDTA、TA等等，它它们都是金属螯合剂。们都是金属螯合剂。六、项目总结及练习六、项目总结及练习3. 猪肝经组织捣碎机破碎细胞，制得的猪肝经组织捣碎机破碎细胞，制得的匀浆于匀浆于3000rpm 离心离心2030min，所得沉淀用二倍体积所得沉淀用二倍体积1mol/LNaCl溶液溶液抽提抽提1h。请问什么叫抽提？。请问什么叫抽提？抽抽提提是是指指在在一一定定条条件件下下，用用适适当当的的溶溶剂剂处处理理，使使细细胞胞破破碎碎后后的的目目的的成成分分充充分分地地溶解到提取液中的过程。溶解到提取液中的过程。六、项目总结及练习六、项目总结及练习4. RNP和和DNP经经0.14mol/LNaCl溶液处溶液处理并离心分离后，可分别用蛋白质变理并离心分离后，可分别用蛋白质变性沉淀剂来去除其中的性沉淀剂来去除其中的Protein。请列。请列举举4种常用的蛋白质变性沉淀剂。种常用的蛋白质变性沉淀剂。 氯仿；氯仿； 苯酚；苯酚； 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS）；）； 三氯醋酸等。三氯醋酸等。六、项目总结及练习六、项目总结及练习5. 为有效去除为有效去除RNP和和DNP中的中的Protein，本项目采用等体积的氯仿及，本项目采用等体积的氯仿及1/40体体积的异戊醇振摇积的异戊醇振摇30min。请问异戊醇。请问异戊醇的作用是什么？的作用是什么？异戊醇的作用是消泡和有助于分相。异戊醇的作用是消泡和有助于分相。六、项目总结及练习六、项目总结及练习6. 在经氯仿去除蛋白质并离心后的上在经氯仿去除蛋白质并离心后的上清液中，加入清液中，加入2倍体积的冷倍体积的冷95%乙醇，乙醇，低温放置低温放置15min，3000rpm离心离心20min，所得沉淀即为，所得沉淀即为RNA或或DNA沉沉淀。请问淀。请问95%乙醇的作用是什么？乙醇的作用是什么？核核酸酸不不溶溶于于乙乙醇醇，乙乙醇醇主主要要起起沉沉淀淀和和除除盐作用。盐作用。 六、项目总结及练习六、项目总结及练习7. 地衣酚又叫什么？在临床上有何用途？地衣酚又叫什么？在临床上有何用途？ 用其鉴定用其鉴定RNA的条件和原理是什么？的条件和原理是什么？地地衣衣酚酚又又称称苔苔黑黑酚酚、地地衣衣二二酚酚、3,5-二二羟羟基基甲苯、苔黑素等。甲苯、苔黑素等。临临床床上上，已已广广泛泛用用于于治治疗疗浅浅层层霉霉菌菌病病和和霉霉菌菌性阴道炎。性阴道炎。 RNA水水解解后后得得到到核核糖糖，在在浓浓酸酸中中脱脱水水环环化化生生成成糠糠醛醛，后后者者与与地地衣衣酚酚，形形成成蓝蓝绿绿色色复复合合物物，在在670nm处处有有一一最最大大吸吸收收峰峰。在在一一定定浓浓度度下下，RNA浓度与吸光度成线性关系。浓度与吸光度成线性关系。 8、金属螯合剂金属螯合剂（metal chelating agent） 金属螯合剂可以通过螯合剂分子与金属金属螯合剂可以通过螯合剂分子与金属离子的强结合作用，将金属离子包合到离子的强结合作用，将金属离子包合到螯合剂内部，变成稳定的，分子量更大螯合剂内部，变成稳定的，分子量更大的化合物，从而阻止金属离子起作用，的化合物，从而阻止金属离子起作用，可以用于解毒，印染，阻垢等方面。可以用于解毒，印染，阻垢等方面。 四、蛋白质的变性四、蛋白质的变性影响因素：影响因素：温度温度 紫外线、超声波紫外线、超声波剧烈震荡、搅拌剧烈震荡、搅拌强酸、强碱强酸、强碱 有机溶剂、表面活性剂有机溶剂、表面活性剂 重金属盐重金属盐胍、尿素等胍、尿素等 第五节第五节 蛋白质的性质蛋白质的性质4、SOD活力测定（邻苯三酚自氧化法）活力测定（邻苯三酚自氧化法） 分别检测提取液、粗酶液、酶液分别检测提取液、粗酶液、酶液1、酶液、酶液2中中SOD活力。活力。试剂试剂/ml空白空白管管OD1OD2对照管对照管提取液提取液粗酶液粗酶液酶液酶液1 酶液酶液2pH8.3缓冲液缓冲液33333 3SOD提取液提取液000.10.10.1 0.1蒸馏水蒸馏水21.81.71.71.7 1.7室温放置室温放置20min邻苯三酚邻苯三酚00.20.20.20.2 0.2加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。测吸光值。 分别从分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各备用的提取液、粗酶液、酶液各取取0.3ml按以下倍数稀释按以下倍数稀释,260nm/280nm测测定吸光值定吸光值,按公式计算蛋白质浓度按公式计算蛋白质浓度. 提取液稀释提取液稀释:50 粗酶液稀释粗酶液稀释:20 酶液稀释酶液稀释:10 蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 0.74A260) 稀释倍数稀释倍数5、溶液中可溶性蛋白含量测定、溶液中可溶性蛋白含量测定6、计算：、计算：酶活力单位酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）5/0.1(1ml反应液中反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到达到50%时的酶量时的酶量)总活力总活力U=U=活力单位活力单位总体积总体积比活力比活力U/mg=U/mg=活力单位活力单位/ /蛋白质浓度蛋白质浓度纯化倍数纯化倍数= =粗酶液粗酶液( (酶液酶液) )比活力比活力/ /提取液比活力提取液比活力回收率回收率= =粗酶液粗酶液( (酶液酶液) )总活力总活力/ /提取液总活力提取液总活力酶活力单位酶活力单位酶活力的高低以酶活力单位（酶活力的高低以酶活力单位（U U）表示。）表示。酶活力单位的含义是指酶在最适条件下，酶活力单位的含义是指酶在最适条件下，单位时间内，酶催化底物的减少量或产物单位时间内，酶催化底物的减少量或产物的生产量。的生产量。1961年国际酶学会议规定：年国际酶学会议规定：1个酶活力个酶活力国际单位（国际单位（IU）是指在特定条件下，）是指在特定条件下，1分分钟内生成钟内生成1微摩尔产物的酶量（或转化微摩尔产物的酶量（或转化1微摩尔底物的酶量）。微摩尔底物的酶量）。 酶的比活力酶的比活力酶的比活力（酶的比活力（specific activity）代表）代表酶制剂的纯度。酶制剂的纯度。 国际酶学委员会规定比活力用每毫克蛋国际酶学委员会规定比活力用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示。白所含的酶活力单位数表示。 对于同一种酶来说，比活力愈大，表示对于同一种酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。酶的纯度愈高。