高效液相色谱 （high performance liquid chromatography,HPLChigh performance liquid chromatography,HPLC）中南大学湘雅医学院医学检验系中南大学湘雅医学院医学检验系 徐克前徐克前高效液相色谱HL一基本原理（一）定义HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同，进行连续的、无数次的交换和分配而达到分离的过程。 组成：组成： 固定相柱内填料 流动相洗脱剂（二）固定相（stationary phase)stationary phase)和 流动相（mobile phasemobile phase）(1)化学键合相硅胶化学官能团键合到硅胶表面化学官能团键合到硅胶表面 OH OHOH OH | | |硅胶（硅胶（SiOSiO2 2 nH nH2 2O O） Si O Si Si O Si | | |键合相反应 RR1 1 | | | | | | | | Si OH + XSiR Si OH + XSiR Si OSiR + HXSi OSiR + HX | | | | | | | | R R2 2 硅胶硅胶 有机硅烷有机硅烷 键合相键合相X: X: ClCl、CHCH3 3O O、C C2 2H H5 5O O等等R: R: 烷烷C C8 8(C(C8 8H H1717) ) 、C C1010(C(C1010H H2121) ) 、C C1818(C(C1818H H3737) )等等RR1 1 RR2 2: : Z Z、CHCH3 3等等(2)十八烷基硅烷键合硅胶填充料（octadecylsilyl, ODS）万能柱 即C18柱或ODS柱 主要用于反相主要用于反相HPLCHPLC中，适用于各种类型的生物中，适用于各种类型的生物分子分子 (3) 短链烷基键合物 短链烷基（短链烷基（c c3 3、 c c4 4等）等）大孔硅胶大孔硅胶大孔硅胶大孔硅胶 键合物键合物 适用于氨基酸、小肽等生物小分子适用于氨基酸、小肽等生物小分子(4)键合到基质上的官能团性质反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，填料是非极性的，官能团为烷烃，如 CC18 18 、CC8 8 、CC4 4等正相柱：填料是极性的，官能团为填料是极性的，官能团为CNCN、NHNH2 2等离子交换键合相：阳离子官能团阳离子官能团：SOSO3 3HH、COOHCOOH等阴离子官能团阴离子官能团NHNH2 2、 R R4 4NN+ +等2、流动相 （mobilephase）流动相选择原则：1.样品易污，且溶解度尽可能大2.化学性质稳定，不损坏柱3.不妨碍检测器检测分析4.粘度低，流动性好5.易于从中回收样品6.无毒或低毒，易于操作7.易于制成高纯度，即色谱纯8.废液易处理，不污染环境反相色谱常用流动相及冲洗强度H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃最常用组成：甲醇/H2O、乙腈/H2O洗脱顺序：极性物先洗脱下来正相色谱常用流动相及冲洗强度正乙烷乙醚乙酸乙酯异丙醇二、分离模式正相HPLC反相HPLC离子交换HPLC凝胶HPLC亲和HPLC（一）正相HPLC（normal phase HPLC ,NP- HPLC normal phase HPLC ,NP- HPLC ）固定相：极性吸附剂（或极性键合相），如硅胶、Al3O2 流动相：非极性或弱极性溶剂，如己烷、庚烷等洗脱顺序：非极性、弱极性、极性 应用：石油化工产品、染料、农药、医药、有机酸、有机碱等（二）反相HPLC（reverse phase HPLC ,RP- HPLC reverse phase HPLC ,RP- HPLC ）固定相：非极性物质，如C18(ODS)、 C10、C8 、C6 、C4 、C2 流动相：极性溶剂，如甲醇甲醇/ /HH2 2OO、乙腈乙腈/ /HH2 2OO等洗脱顺序：极性、弱极性、非极性 应用：蛋白质、多肽等（三）离子交换HPLC（ion-exchange HPLC ,IE- HPLC ion-exchange HPLC ,IE- HPLC ）原理：用离子交换剂作固定相，根据不同组分在一定pH下，组分电荷性质和数量不同而分离的技术分类：阳离子交换树脂：含酸性基团：含酸性基团： 阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：磺酸基、磷酸基等合碱性基团：季胺基、叔胺基等应用：核酸、蛋白质、氨基酸等（四）凝胶HPLC（gel HPLC ,G- HPLC gel HPLC ,G- HPLC ）原理：基于分子大小和形状的差异进行分析的技术固定相：交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶流动相：水、乙醇、丙酮等应用：核酸、蛋白质、酶、多糖等（五）亲和HPLC（affinity HPLC ,AF- HPLC affinity HPLC ,AF- HPLC ）原理：利用生物大分子间专一的亲和力进行分离的技术固定相：基质（琼脂糖凝胶等）交联配基（亲和性）应用：酶、抗体、抗原、受体等三、 HPLC仪器 HPLC仪 一般由输液系统、进样系统、色谱柱、检测器、记录和数据处理系统及计算机等几部分组成（一）输液系统：贮液及脱气装置梯度洗脱装置高压输液泵梯度洗脱装置高压输液泵（二）进样系统：（三）柱系统：（四）检测器：与泵、柱组成HPLC的三大关键部件1.紫外吸收检测器2.荧光检测器4.示差折光检测器表.HLPC常用检测器检测器 原理 检测下限（g/mlg/ml） 检测范围 紫外检测器紫外检测器 具有紫外吸收性质具有紫外吸收性质 10 10-7-7荧光检测器荧光检测器 具有荧光物质具有荧光物质 10 10-14-14电化学检测器电化学检测器 具有电解活性物质具有电解活性物质 10 10-12-12示差折光检测器示差折光检测器 与流动相折光率不同与流动相折光率不同 10 10-7 -7 糖类等糖类等蛋白质、核酸、蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、氨基酸、多肽、激素等激素等多环芳烃、氨多环芳烃、氨基酸、维生素基酸、维生素等等食品、环境、食品、环境、生化、医学等生化、医学等（五）不同HPLC产品介绍：高效液相色谱仪器（）高效液相色谱仪器（）高效液相色谱仪器（）高效液相色谱仪器（）高效液相色谱仪器（高效液相色谱仪器（2）高效液相色谱仪器（高效液相色谱仪器（3）高效液相色谱仪器（高效液相色谱仪器（4）四、定性和定量定性分析保留值定性：比较未知峰与标准物的保留值收集未知峰洗脱液定性：物理分析，化学分析，生物学分析联机定性：液质联用（）液红联用（）定量分析分析检测物质的量（或浓度）与检测器的响应值（峰面积或峰高）呈正比1.1.标准曲线法：标准曲线法：也称外标法或直接比较法。用标准品等体积也称外标法或直接比较法。用标准品等体积直接进样，得标准曲线，再用待测样品的峰面积（或峰高）直接进样，得标准曲线，再用待测样品的峰面积（或峰高）与其对照与其对照2.2.内标法：内标法：选择适宜的物质作为欲测组分的内标物加入到样选择适宜的物质作为欲测组分的内标物加入到样品中，内标物的选择是关键品中，内标物的选择是关键3.3.标准加入法：标准加入法：以欲测组分的纯物质作内标物加入到待测样以欲测组分的纯物质作内标物加入到待测样品中品中五、临床应用氨基酸的分析蛋白质、酶及多肽糖类核酸类药物及毒物