Real-time-PCR-Real-time-PCR-原理及其原理及其定量方法定量方法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理和定量方法原理和定量方法一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR的原理的原理 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧荧光基团光基团，利用荧光信号累积，利用荧光信号累积实现了实现了实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，进程，对对起始模板起始模板进行定量分析的进行定量分析的方法。方法。三个关键词：三个关键词：实时，定量，荧光实时，定量，荧光1 1、定量与常规、定量与常规PCRPCR的差别的差别常规常规PCRPCR技术：技术：对对PCRPCR扩扩增增反反应应的的终终产产物物进进行行定定量量及及定性分析定性分析定量定量PCRPCR技术：技术：通过对通过对PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一每一个循环产物个循环产物荧光荧光信号的信号的实实时时检测检测从而实现对从而实现对起始模起始模板板定量及定性的分析定量及定性的分析2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念 扩增曲线、阈值、扩增曲线、阈值、CTCT值值C CycleycleNormalised reporter Normalised reporter Fluorescence Fluorescence （Rn)Rn)BaselineBaselineExponentialExponential phase phaseplateau phaseplateau phaseThreshold lineThreshold lineCt ValueCt ValueLiner phaseLiner phase（1 1）扩增曲线）扩增曲线(Amplification)(Amplification)反映反映反映反映PCRPCRPCRPCR循环次数和荧光强度变化的曲线。循环次数和荧光强度变化的曲线。循环次数和荧光强度变化的曲线。循环次数和荧光强度变化的曲线。随着随着PCRPCR反应的反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强进行，每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。纵坐标：纵坐标：RnRn（荧光值）（荧光值） 横坐标：横坐标：cycle numbercycle number（循环数）（循环数）线线性图性图对数图对数图荧光信号变化与荧光信号变化与PCRPCR循环数的变化循环数的变化直观！直观！荧光信号变化的对数与荧光信号变化的对数与PCRPCR循环数的变化循环数的变化确定阈值线！确定阈值线！（2 2）阈值）阈值(Threshold)(Threshold) 在荧光扩增曲线上人为设定的一个值在荧光扩增曲线上人为设定的一个值。它可以设定在荧它可以设定在荧光信号光信号指数期指数期任意位置上，一般荧光域值设置是基线荧光信任意位置上，一般荧光域值设置是基线荧光信号号( (一般是一般是PCR PCR 315个循环个循环荧光信号）的标准偏差的荧光信号）的标准偏差的10倍。倍。Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phaseThreshold平台期平台期1 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）1 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过阈值（3 3）CtCt值值(Cycle threshold)(Cycle threshold) PCRPCR过过程程中中，每每个个反反应应管管内内扩扩增增产产物物的的荧荧光光信信号号达达到到设设定定的的阈阈值值时时，所所经经过过的的扩扩增增循循环环数数。相相同同模模板板进进行行多多次次扩扩增，终点处产物量不恒定，但增，终点处产物量不恒定，但CtCt值极具重现性值极具重现性。3 3 3 3、荧光定量、荧光定量、荧光定量、荧光定量PCRPCRPCRPCR的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理理想的理想的PCR反应反应: :XnX0 2nX X0 0：起始模板数量起始模板数量n n：扩增循环数扩增循环数Xn n：第第n n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量非理想的非理想的PCR反应：反应：XnX0 （1Ex）n Xn n：第第n n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X X0 0：起始模板数量起始模板数量n n：扩增循环数扩增循环数 Ex Ex：PCRPCR扩增效率扩增效率 在扩增产物达到荧光阈值时所经历的循环数为在扩增产物达到荧光阈值时所经历的循环数为Ct个循环，此个循环，此时：时： XCt X0 （1Ex）Ct M XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，设为定以后，它是一个常数，设为M上式两边同取对数得：上式两边同取对数得：LogMLog X0 （1Ex）Ct 整理得：整理得：LogX0 Ct Log（1Ex）+ Log MCycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration0 模板模板DNA量越多，荧光达量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即到阈值的循环数越少，即Ct值值越小。越小。0 Log模板起始浓度与模板起始浓度与Ct值值呈线性关系。呈线性关系。 另一种思路另一种思路 由于由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与反应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成产物的量成正比，所以可以用荧光强度来代替正比，所以可以用荧光强度来代替PCR产物的量，同时考虑产物的量，同时考虑荧光本底值，则：荧光本底值，则： Rn= RB+ X0(1+ Ex) Rs总荧光信号强度总荧光信号强度总荧光信号强度总荧光信号强度= = = =本底信号本底信号本底信号本底信号+ + + +分子数量分子数量分子数量分子数量单位信号强度单位信号强度单位信号强度单位信号强度Rn：第：第n个循环时的总信号个循环时的总信号RB：本底：本底RS：单位信号强度：单位信号强度X0：起始：起始DNA数目数目Ex：PCR扩增效率扩增效率 类似的，当循环数类似的，当循环数n n等于等于C Ct t值时，可推出：值时，可推出： Ct lg (1+Ex) = -lg X0 + lg (RT-RB) lg Rs 变形得变形得: 此此时时，PCRPCR反反应应处处于于指指数数期期阶阶段段，所所有有样样品品的的反反应应效效率率E Ex x稳稳定定且且近近似似相相等等；lg(Rlg(RT T -R-RB B) )、RsRs也也都都相相同同，只只有有C Ct t值值和和-lgX-lgX0 0为为变变量量，且且这这两两个个变变量量之之间间成成线线性性关关系系。也也就就是是说说，根根据据样样品品扩扩增增达达到到域域值值的的循循环环数数即即CtCt值值就就可可计计算算出出样样品品中中所含的模板量。所含的模板量。线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认标准曲线斜率标准曲线斜率: -3 到到 -3.5相关系数（相关系数（R2）：大于）：大于0.98PCR扩增效率（扩增效率（Ex）: 0.9到到1.2荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210扩增效率扩增效率扩增效率理论值为扩增效率理论值为1，即每增加一个循环，即每增加一个循环PCR产物加倍。产物加倍。那么，那么，根据扩增效率根据扩增效率ExEx与标准曲线斜率的关系与标准曲线斜率的关系，优化的标准，优化的标准曲线斜率应该为曲线斜率应该为-3.32。4 4 4 4、荧光定量、荧光定量、荧光定量、荧光定量PCRPCRPCRPCR的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理处于基态的分子经某种波长的入射光照射，吸收电磁辐射后被激处于基态的分子经某种波长的入射光照射，吸收电磁辐射后被激发至激发态，然后通过发光的形式释放出能量，重新跃迁回基态。发至激发态，然后通过发光的形式释放出能量，重新跃迁回基态。所发射的光即为所发射的光即为荧光荧光。荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR反应体系反应体系反应体系反应体系非特异性荧光标记非特异性荧光标记 DNA结合染料结合染料 （SYBR Green）特异性荧光标记特异性荧光标记 探针探针（Taqman、Beacon、FRET、Amplifluor）引物引物（Scorption primerScorption primer、LUX primer）（1 1）SYBR GreenSYBR Green法法 SYBR SYBR Green Green 染染染染料料料料可可可可以以以以与与与与dsDNAdsDNA小小小小沟沟沟沟区区区区结结结结合合合合并并并并发发发发出出出出绿绿绿绿色色色色荧荧荧荧光光光光。游游游游离离离离状状状状态态态态下下下下SYBR SYBR GreenGreen仅仅仅仅发发发发出出出出微微微微弱弱弱弱荧荧荧荧光光光光，与与与与dsDNAdsDNA结结结结合合合合后后后后荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度激激激激增增增增，其荧光信号强度与其荧光信号强度与其荧光信号强度与其荧光信号强度与dsDNAdsDNA数量成正比。数量成正比。数量成正比。数量成正比。热热热热 变变变变 性性性性引物退火引物退火引物退火引物退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应融解曲线（融解曲线（melt curve)在在在在PCRPCR反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线温度与荧光值的关系曲线温度与荧光值的关系曲线温度与荧光值的关系曲线。融解温度（融解温度（融解温度（融解温度（melting temperature, melting temperature, TmTm值值值值）双双双双链链链链DNADNA解解解解链链链链50%50%的的的的温温温温度度度度。一一一一般般般般而而而而言言言言，退退退退火火火火（annealing annealing temperaturetemperature）温度等于）温度等于）温度等于）温度等于TmTm值减值减值减值减5 5。温温度度荧光强荧光强度度Tm融解曲线原始图融解曲线原始图融解曲线原始图融解曲线原始图-dIdTTm-dIdTTm融解曲线单峰图融解曲线单峰图融解曲线单峰图融解曲线单峰图融解曲线的设置是在融解曲线的设置是在融解曲线的设置是在融解曲线的设置是在PCRPCR反应完成后进行的。一般从反应完成后进行的。一般从反应完成后进行的。一般从反应完成后进行的。一般从6060升升升升到到到到9090，得到的融解曲线随着温度的升高，双链，得到的融解曲线随着温度的升高，双链，得到的融解曲线随着温度的升高，双链，得到的融解曲线随着温度的升高，双链DNADNA的解链，的解链，的解链，的解链，荧光信号不断降低，且在荧光信号不断降低，且在荧光信号不断降低，且在荧光信号不断降低，且在TmTm值下降速度最快。值下降速度最快。值下降速度最快。值下降速度最快。用荧光信号强用荧光信号强用荧光信号强用荧光信号强度改变的负的一次导数与温度做图，即得到单峰的融解曲线。度改变的负的一次导数与温度做图，即得到单峰的融解曲线。度改变的负的一次导数与温度做图，即得到单峰的融解曲线。度改变的负的一次导数与温度做图，即得到单峰的融解曲线。峰值代表斜率改变最大值，即为峰值代表斜率改变最大值，即为峰值代表斜率改变最大值，即为峰值代表斜率改变最大值，即为TmTm值。值。值。值。融解曲线分析，单一峰融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光无非特异性荧光定量准确定量准确融解曲线分析，出现杂融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准性荧光，因此定量不准确确融解曲线分析可以优化融解曲线分析可以优化融解曲线分析可以优化融解曲线分析可以优化PCRPCRPCRPCR反应条件，可区分单一引物、引物反应条件，可区分单一引物、引物反应条件，可区分单一引物、引物反应条件，可区分单一引物、引物二聚体、变异产物等。二聚体、变异产物等。二聚体、变异产物等。二聚体、变异产物等。SYBR Green法优缺点法优缺点（2）TaqMan探针法探针法水解型杂交探针水解型杂交探针水解型杂交探针水解型杂交探针Taqman Taqman 荧荧荧荧光光光光探探探探针针针针为为为为一一一一寡寡寡寡聚聚聚聚核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列，其其其其两两两两端端端端分分分分别别别别标标标标记记记记一一一一个个个个报报报报告告告告基基基基团团团团（荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射基基基基团团团团）和和和和一一一一个个个个猝猝猝猝灭灭灭灭基基基基团团团团。探探探探针针针针完完完完整整整整时时时时，发发发发射射射射基基基基团团团团发发发发射射射射的的的的荧荧荧荧光光光光信信信信号号号号被被被被荧荧荧荧光光光光猝猝猝猝灭灭灭灭基基基基团团团团所所所所吸吸吸吸收收收收，无无无无荧荧荧荧光光光光信信信信号号号号被被被被检检检检测测测测。当当当当PCRPCR扩扩扩扩增增增增时时时时，TaqTaq酶酶酶酶有有有有 5353外外外外切切切切核核核核酸酸酸酸酶酶酶酶活活活活性性性性，可可可可酶酶酶酶切切切切水水水水解解解解探探探探针针针针，使使使使荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射基基基基团团团团和和和和淬淬淬淬灭灭灭灭基基基基团团团团分分分分离离离离，荧荧荧荧光光光光共共共共振振振振转转转转移移移移（FRETFRET）效效效效应应应应消消消消失失失失，系系系系统统统统可可可可检检检检测测测测到到到到荧荧荧荧光光光光信信信信号号号号。荧荧荧荧光光光光信信信信号号号号强强强强度度度度与与与与结结结结合合合合探探探探针针针针的的的的DNADNA量量量量成成成成正正正正比比比比。常常常常用用用用的的的的荧荧荧荧光光光光基基基基团团团团主主主主要要要要有有有有FAMFAM、TETTET、HEXHEX等。等。等。等。TaqMan作用机理作用机理 在退火过程中，探针与靶序列结合在退火过程中，探针与靶序列结合探针被探针被Taq酶的酶的5- 3 外切酶活性剪切成片外切酶活性剪切成片断断游离报告基团发出荧光游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离在延伸过程中，探针部分与靶序列分离TaqMan法优缺点法优缺点% 高度特异性高度特异性% 重复性好重复性好% 灵敏度高灵敏度高% 可进行多重可进行多重PCR定量定量优优 点点% 只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标% 委托公司标记，价格较高委托公司标记，价格较高% 背景高，不易找到本底低的探针背景高，不易找到本底低的探针% 不能进行融解曲线分析不能进行融解曲线分析缺缺 点点（3）分子信标）分子信标 Beacon法法发夹型杂交探针发夹型杂交探针v分子信标是呈发夹结构的茎环分子信标是呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针双标记寡核苷酸探针v环与目标序列互补，环与目标序列互补，茎由互补茎由互补配对序列组成配对序列组成v发夹结构的两端分别连接荧光发夹结构的两端分别连接荧光基团和淬灭基团基团和淬灭基团v利用分子构象的改变使得荧光利用分子构象的改变使得荧光基团和淬灭基团分开基团和淬灭基团分开v常用的荧光基团有常用的荧光基团有FAM、Texas Red环茎荧光素 淬灭剂（4）FRET法法Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransferFRETFRET探探探探针针针针又又又又称称称称双双双双杂杂杂杂交交交交探探探探针针针针，由由由由两两两两条条条条相相相相邻邻邻邻探探探探针针针针组组组组成成成成，在在在在一一一一条条条条探探探探针针针针的的的的55端端端端标标标标记记记记FAMFAM荧荧荧荧光光光光基基基基团团团团，另另另另一一一一探探探探针针针针的的的的33端端端端标标标标记记记记Red Red 640640荧荧荧荧光光光光基基基基团团团团。复复复复性性性性时时时时，探探探探针针针针结结结结合合合合在在在在模模模模板板板板上上上上，FAMFAM基基基基团团团团和和和和Red640Red640基基基基团团团团相相相相邻邻邻邻，激激激激发发发发FAMFAM产产产产生生生生的的的的荧荧荧荧光光光光作作作作为为为为Red640Red640基基基基团团团团的的的的激激激激发发发发光光光光被被被被吸吸吸吸收收收收，使使使使Red640Red640发发发发出出出出640nm640nm的的的的荧荧荧荧光光光光；变变变变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生性时，探针游离，两基团距离远，不能产生性时，探针游离，两基团距离远，不能产生性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640nm640nm的荧光。的荧光。的荧光。的荧光。二、荧光定量二、荧光定量PCR的定量方法的定量方法绝对定量和相对定量绝对定量和相对定量绝对定量绝对定量0 LogLog（起始浓度）与循环数呈线性关系，（起始浓度）与循环数呈线性关系，（起始浓度）与循环数呈线性关系，（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知浓度的通过已知浓度的通过已知浓度的通过已知浓度的标准品标准品标准品标准品 作出标准曲线作出标准曲线作出标准曲线作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系，即得到该扩增反应存在的线性关系，即得到该扩增反应存在的线性关系，即得到该扩增反应存在的线性关系00 根据根据根据根据样品样品样品样品CtCt值值值值，就可以计算出初始样品中所含的模板量，就可以计算出初始样品中所含的模板量，就可以计算出初始样品中所含的模板量，就可以计算出初始样品中所含的模板量00标准品可以是标准品可以是标准品可以是标准品可以是纯化的质粒纯化的质粒纯化的质粒纯化的质粒DNADNA、体外转录的、体外转录的、体外转录的、体外转录的RNARNA或者体外或者体外或者体外或者体外合成的合成的合成的合成的ssDNAssDNASample25拷贝数计算拷贝数计算对标准品进行梯度浓度稀释对标准品进行梯度浓度稀释荧光定量荧光定量PCR反应反应建立标准品建立标准品未知样品未知样品CtCt代入标准曲线确定拷贝数代入标准曲线确定拷贝数质粒提取质粒提取ODOD值测定值测定计算待测样本浓度计算待测样本浓度/ /样本分子量样本分子量/ /待测样本拷贝数待测样本拷贝数标准品进行标准品进行5-65-6个个梯度稀释梯度稀释标准品稀释倍数标准品稀释倍数为为1010绝对定量实验构建流程绝对定量实验构建流程绝对定量分析要素绝对定量分析要素一个一个一个一个目的基因目的基因目的基因目的基因 即需要确定其量值的核酸序列。即需要确定其量值的核酸序列。即需要确定其量值的核酸序列。即需要确定其量值的核酸序列。一组一组一组一组标准样本标准样本标准样本标准样本 用来生成标准曲线。可以是含有用来生成标准曲线。可以是含有用来生成标准曲线。可以是含有用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、目的基因的质粒、目的基因的质粒、目的基因的质粒、PCRPCR产物、基因组产物、基因组产物、基因组产物、基因组DNADNA等。等。等。等。重复反应孔重复反应孔重复反应孔重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复建议每个样本使用三个或更多重复建议每个样本使用三个或更多重复建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。反应，以确保统计显著性。反应，以确保统计显著性。反应，以确保统计显著性。标记方法标记方法标记方法标记方法的选择的选择的选择的选择SYBR GreenSYBR Green法或探针法均可。法或探针法均可。法或探针法均可。法或探针法均可。实验结果显示实验结果显示实验结果显示实验结果显示扩增曲线；标准曲线；融解曲线扩增曲线；标准曲线；融解曲线扩增曲线；标准曲线；融解曲线扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。（探针法不需要）。（探针法不需要）。（探针法不需要）。引物设计引物设计DNAPCR扩增扩增扩增产物扩增产物纯化纯化与克隆载与克隆载体连接体连接转化转化培养培养重组克隆重组克隆筛选筛选感受态感受态质粒提取质粒提取PCR或或酶切鉴定酶切鉴定计算拷贝计算拷贝倍比稀释倍比稀释备用备用质粒标准品的制备质粒标准品的制备目的基因目的基因目的基因目的基因质粒质粒目的基因目的基因目的基因克隆目的基因克隆质粒提取，质粒提取，OD值定量值定量拷贝数计算拷贝数计算 待测待测待测待测DNADNA样本浓度（样本浓度（样本浓度（样本浓度（ng/ulng/ul）ODOD2602605050稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数 1dolton 1dolton 即表示即表示即表示即表示 1g/mol 1g/mol，1 1 摩尔摩尔摩尔摩尔=6.0210=6.02102323摩尔分子摩尔分子摩尔分子摩尔分子( (拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数) ) 待测样本拷贝数（待测样本拷贝数（待测样本拷贝数（待测样本拷贝数（copies/ulcopies/ul）=DNA=DNA样本浓度样本浓度样本浓度样本浓度/ /样本分子量样本分子量样本分子量样本分子量66101023231010-9-9 =DNA=DNA浓度浓度浓度浓度(ng/ul)/(660*bases)610(ng/ul)/(660*bases)61023231010-9-9 绝对定量实验举例绝对定量实验举例绝对定量实验举例绝对定量实验举例乙肝病人血液中乙肝病人血液中乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBVHBVHBV的绝对定量的绝对定量的绝对定量的绝对定量qq 方方方方 法：从血液中提取病毒法：从血液中提取病毒法：从血液中提取病毒法：从血液中提取病毒DNADNA，以，以，以，以TaqManTaqMan探针法进行荧光定量检测探针法进行荧光定量检测探针法进行荧光定量检测探针法进行荧光定量检测qq 试试试试 剂：剂：剂：剂：TIANGENTIANGEN公司探针法试剂公司探针法试剂公司探针法试剂公司探针法试剂RealMasterMix ProbeRealMasterMix Probeqq 标准品：标准品：标准品：标准品：质粒标准品浓度为质粒标准品浓度为质粒标准品浓度为质粒标准品浓度为10106 6、10105 5 、10104 4 、 10103 3 ；2 2个重复个重复个重复个重复；设阴性空白对照设阴性空白对照设阴性空白对照设阴性空白对照qq 实验步骤：提取实验步骤：提取实验步骤：提取实验步骤：提取HBV DNAHBV DNA；设计引物；设计引物；设计引物；设计引物；设计设计设计设计TaqManTaqMan探针并标记探针；荧光定探针并标记探针；荧光定探针并标记探针；荧光定探针并标记探针；荧光定量扩增；量扩增；量扩增；量扩增；qq 结果分析：获取血液样品中结果分析：获取血液样品中结果分析：获取血液样品中结果分析：获取血液样品中HBV DNAHBV DNA的精确的精确的精确的精确copycopy数。数。数。数。 9696孔板设置举例孔板设置举例SampleSamplecopies/mlcopies/mlCt1Ct1Ct2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD标准品510330.5830.6430.610.03标准品510428.1828.6428.410.16标准品510525.2525.1425.190.04标准品510622.1122.4622.280.12标准品510718.6318.9218.770.10未知样品? ?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据实验数据实验数据实验数据扩增效率扩增效率扩增效率扩增效率E E的计算的计算的计算的计算 E = 10-1/斜率斜率 1 = 10-1/-3.29 1 = 2.011 = 1.01 标准曲线拟合：标准曲线拟合：标准曲线拟合：标准曲线拟合：利用利用Mean Ct 作图可得到标准曲线作图可得到标准曲线y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978未知样品拷贝数计算：未知样品拷贝数计算：将将将将CtCt值带入线性方程值带入线性方程值带入线性方程值带入线性方程20.5 = -3.29 X + 40.33Quantity Sample = 10 6.03 = 1071519 copies X =20.5-40.33-3.29= 6.03因为因为这里算出的这里算出的X其实是其实是logX0, X0起始起始DNA模板数模板数相对定量法相对定量法必要性必要性理论上目的基因表达量分析条件理论上目的基因表达量分析条件理论上目的基因表达量分析条件理论上目的基因表达量分析条件目的基因扩增效率相同目的基因扩增效率相同目的基因扩增效率相同目的基因扩增效率相同RNARNARNARNA提取效率相同提取效率相同提取效率相同提取效率相同细胞起始数相同细胞起始数相同细胞起始数相同细胞起始数相同Sample BSample BSample ASample A关注点：关注点：关注点：关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析相对定量分析要素相对定量分析要素一个一个一个一个参照样本参照样本参照样本参照样本一个或一个以上的一个或一个以上的一个或一个以上的一个或一个以上的未知样本未知样本未知样本未知样本一个一个一个一个目的基因目的基因目的基因目的基因管家基因管家基因管家基因管家基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔重复反应孔重复反应孔重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以建议每个样本使用三个或更多重复反应，以建议每个样本使用三个或更多重复反应，以建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。确保统计显著性。确保统计显著性。确保统计显著性。标记方法标记方法标记方法标记方法的选择的选择的选择的选择SYBR GreenSYBR GreenSYBR GreenSYBR Green法或探针法均可。法或探针法均可。法或探针法均可。法或探针法均可。实验结果显示实验结果显示实验结果显示实验结果显示扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）。要）；融解曲线（探针法不需要）。要）；融解曲线（探针法不需要）。要）；融解曲线（探针法不需要）。一组一组一组一组标准样本标准样本标准样本标准样本（有些分析方法不需要）（有些分析方法不需要）（有些分析方法不需要）（有些分析方法不需要） 特点特点选择内参基选择内参基因因内参基因内参基因beta-actin、GAPDH、18S rRNA等看家等看家基因基因(house-keeping gene)在各组织和细胞中在各组织和细胞中的表达量或在基因的表达量或在基因组中的拷贝数相对组中的拷贝数相对恒定，受环境因素恒定，受环境因素影响较小影响较小- - 文献检索文献检索- - 实验筛选实验筛选对样本初始浓度差异进行均一化校正。对样本初始浓度差异进行均一化校正。内参基因内参基因内参基因内参基因 校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。的准确性。理想的内参基因应该满足以下条件：理想的内参基因应该满足以下条件：理想的内参基因应该满足以下条件：理想的内参基因应该满足以下条件：n n不存在假基因不存在假基因不存在假基因不存在假基因(Pseudogene)(Pseudogene)n n高度表达高度表达高度表达高度表达n n稳定表达于不同类型的细胞和组织，且其表达量稳定表达于不同类型的细胞和组织，且其表达量稳定表达于不同类型的细胞和组织，且其表达量稳定表达于不同类型的细胞和组织，且其表达量近似，无显着性差别近似，无显着性差别近似，无显着性差别近似，无显着性差别 n n表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关n n其稳定的表达水平与目标基因相似其稳定的表达水平与目标基因相似其稳定的表达水平与目标基因相似其稳定的表达水平与目标基因相似n n不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响何实验处理措施的影响何实验处理措施的影响何实验处理措施的影响. .2Ct法法双标准曲线法双标准曲线法 相对定量方法相对定量方法相对定量实验构建流程相对定量实验构建流程双标准曲线法双标准曲线法公式：公式： 待测样品目的基因浓度待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度待测样品内参基因浓度 F=F= 对照样品目的基因浓度对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度对照样品内参基因浓度由于所测的待测基因浓度和内参基因浓度都是由于所测的待测基因浓度和内参基因浓度都是由于所测的待测基因浓度和内参基因浓度都是由于所测的待测基因浓度和内参基因浓度都是根据目的基因根据目的基因根据目的基因根据目的基因和内参基因的标准曲线来确定的和内参基因的标准曲线来确定的和内参基因的标准曲线来确定的和内参基因的标准曲线来确定的，故称为双标准曲线法。，故称为双标准曲线法。，故称为双标准曲线法。，故称为双标准曲线法。优点：优点：分析简单，实验优化相对简单分析简单，实验优化相对简单缺点：缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线适用条件：适用条件：内参基因和目标基因扩增效率不同内参基因和目标基因扩增效率不同 扩增效率较低扩增效率较低这里，这里，这里，这里，检测样品检测样品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量结果定量结果定量结果定量结果校正值校正值相对值相对值对照样品对照样品6391.56391.5343.4343.40.05370.0537待测样品待测样品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待测样品待测样品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874数据处理举例数据处理举例校正值校正值校正值校正值= = = =目的基因定量结果目的基因定量结果目的基因定量结果目的基因定量结果管家基因定量结果管家基因定量结果管家基因定量结果管家基因定量结果相对值相对值相对值相对值= = = =待测样品的校正值待测样品的校正值待测样品的校正值待测样品的校正值对照样品的校正值对照样品的校正值对照样品的校正值对照样品的校正值假设检测假设检测A A基因在某因子干预下的表达，得到一组数据结果基因在某因子干预下的表达，得到一组数据结果如下：如下：2 2CtCt法法优点：优点：无需作标准曲线无需作标准曲线缺点：缺点：实验条件优化较为复杂实验条件优化较为复杂适用条件：适用条件：内参基因和目标基因扩增效率接近，均接内参基因和目标基因扩增效率接近，均接近近100% 标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致公式：公式：F =2 待测样品目的基因平均Ct值待测样品内参基因平均Ct值对照样品目的基因平均Ct值对照样品内参基因平均Ct值-验证试验验证试验 目的基因和内参基因扩增效率一致性检测目的基因和内参基因扩增效率一致性检测 检检测测目目标标基基因因与与内内参参基基因因在在不不同同稀稀释释浓浓度度下下的的Ct，以以稀稀释释倍倍数数与与Ct作作图图，当当直直线线的的斜斜率率近近似似于于0（绝绝对对值值应应小小于于0.1）时时，说明目标基因与内说明目标基因与内参参基因扩增效率一致。基因扩增效率一致。2 2CtCt法公式推导法公式推导X X X XT T T T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数是目标分子达到设定的阈值时的分子数是目标分子达到设定的阈值时的分子数是目标分子达到设定的阈值时的分子数R R R RT T T T是内参分子达到设定的阈值时的分子数是内参分子达到设定的阈值时的分子数是内参分子达到设定的阈值时的分子数是内参分子达到设定的阈值时的分子数 假设目标序列与内参序列扩增效率相同：假设目标序列与内参序列扩增效率相同：假设目标序列与内参序列扩增效率相同：假设目标序列与内参序列扩增效率相同： 或或最后用任一样本最后用任一样本最后用任一样本最后用任一样本 q q 的的的的 X X NN 除以参照因子（除以参照因子（除以参照因子（除以参照因子（ calibratorcalibrator，cb cb ）的）的）的）的 X X NN 得到：得到：得到：得到： 对于一个少于对于一个少于对于一个少于对于一个少于 150bp 150bp 的扩增片断而言，如果的扩增片断而言，如果的扩增片断而言，如果的扩增片断而言，如果 Mg 2+ Mg 2+ 浓度、引物都进行了浓度、引物都进行了浓度、引物都进行了浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于适当的优化，扩增效率接近于适当的优化，扩增效率接近于适当的优化，扩增效率接近于 1 1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之。因此目标序列的量通过内均一化处理之。因此目标序列的量通过内均一化处理之。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：后相对于参照因子而言就是：后相对于参照因子而言就是：后相对于参照因子而言就是： 修修正正方方法法：如如果果知知道道目目标标基基因因和和参参照照基基因因有有相相同同的的扩扩增增效效率率，但但扩扩增增效效率率不不等等于于2，那么，那么2Ct可以修正为用实际扩增效率值代替可以修正为用实际扩增效率值代替2，即，即ECt。例如扩增效率为例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为，那么计算公式可修正为1.95CtSample Jun(Mean Ct)GAPDH(Mean Ct)CtCtCt2 2CtCt1181710121617.4-1.4-2.4数据处理举例数据处理举例以以1 1号样本为对照样品，号样本为对照样品，2 2号样本为待测样品号样本为待测样品第一步：应用内参基因对对照样本和待测样本进行校正第一步：应用内参基因对对照样本和待测样本进行校正 Ct(Ct(对照样本对照样本) )Jun(Mean Ct)1GAPDH(Mean Ct)1181817171 1 Ct( Ct(待测样本待测样本) )Jun(Mean Ct)2GAPDH(Mean Ct)2161617.4=17.4=1.41.4第二步：对照样本和待测样本的第二步：对照样本和待测样本的CtCt进行归一化进行归一化 Ct=Ct(Ct=Ct(待测样本待测样本) )Ct(Ct(对照样本对照样本) )1.41.41 12.42.4第三步：基因表达差异计算第三步：基因表达差异计算 2 2CtCt2 2（2.42.4） = 5.3 = 5.3 所以所以2 2号样本的号样本的JunJun基因表达水平是基因表达水平是1 1号样本的号样本的5.35.3倍倍www.themegallery.comThank you!结束！结束！