基基基 因因因 工工工 程程程基因工程5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概念基因工程的基本概念基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程的基本原理基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程所需的基本条件基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程酵母基因工程酵母基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程D D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策6 6 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程C C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略B B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理A A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征E E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素A A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征6 6 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有全基因组测序，共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国被美国FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物A A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征6 6 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素B B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理6 6 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程启动子启动子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子质粒拷贝数质粒拷贝数启动子启动子启动子最佳距离的探测启动子最佳距离的探测目的基因目的基因目的基因E E EE E EA A AE EEE EE启动子启动子A A 酶切开酶切开Bal31Bal31酶解酶解目的基因目的基因目的基因启动子启动子启动子的筛选启动子的筛选ApApApr rrorioriorigalKgalKgalKpKO1pKO1pKO1终止密码子终止密码子采用鸟枪法战略，将合适大小的采用鸟枪法战略，将合适大小的DNADNA片段片段克隆到启动子探针质粒克隆到启动子探针质粒pKO1pKO1上上受体细胞染色体受体细胞染色体DNADNA上的上的galEgalE、galTgalT与质与质粒上报告基因粒上报告基因galkgalk的表达产物联合作用，的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化转化galEgalE+、galTgalT+、galKgalK-的大肠杆菌受体菌株的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆启动子启动子启动子的构建启动子的构建-35 -35 -35 区序列区序列区序列-10 -10 -10 区序列区序列区序列P P Pl l l ll lL LLP P PrecArecArecAP P PtrptrptrpP P PlaclaclacP P PtraAtraAtraAP P Ptactactac启动子启动子T T G A C AT T G A C AT T G A C AG A T A C TG A T A C TG A T A C TT T G A T AT T G A T AT T G A T AT A T A A TT A T A A TT A T A A TT T G A C AT T G A C AT T G A C AT T A A C TT T A A C TT T A A C TT A G A C AT A G A C AT A G A C AT A A T G TT A A T G TT A A T G TT T T A C AT T T A C AT T T A C AT A T A A TT A T A A TT A T A A TT T G A C AT T G A C AT T G A C AT A T A A TT A T A A TT A T A A TP P Ptactactac = = = 3 3 3 P P Ptrptrptrp = = = 111111 P P Placlaclac启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性P PP乳糖启动子乳糖启动子P Placlac的可控性：的可控性：O OOP PPO OO高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白诱导诱导诱导乳糖乳糖 异丙基异丙基-bb-D-D-硫硫代半乳糖苷（代半乳糖苷（IPTGIPTG）野生型的野生型的野生型的P PPlaclaclac与其控制区与其控制区与其控制区O OOlaclaclac偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基基底水平转录基底水平转录底水平表达；诱导物可以使底水平表达；诱导物可以使启动子启动子PPlaclac介导的转录大幅介导的转录大幅提高提高提高启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性P PPlaclaclac乳糖启动子乳糖启动子P Placlac的可控性：的可控性：O OOP PPlaclaclacO OO高效转录高效转录葡萄糖代谢葡萄糖代谢野生型的野生型的PPlaclac上游附近拥有上游附近拥有代谢激活因子（代谢激活因子（CAPCAP）结合结合区，区，cAMPcAMP激活激活CAPCAP，CAPCAP基底水平转录基底水平转录结合启动子控制区，进而促结合启动子控制区，进而促进进PPlaclac介导的转录。葡萄糖介导的转录。葡萄糖代谢使代谢使cAMPcAMP减少，也能阻减少，也能阻遏遏PPlaclac介导的转录。因此，介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即突变型，即PPlac lac UV5UV5CAPCAPCAPcAMPcAMPcAMPcAMPcAMP浓度降低浓度降低P PPlac lac lac UV5UV5UV5O OO高效转录高效转录启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性P PPtrptrptrp色氨酸启动子色氨酸启动子P Ptrptrp的可控性：的可控性：O OOtrptrptrp除去除去色氨酸色氨酸色氨酸启动子色氨酸启动子PPtrptrp受色氨酸受色氨酸-阻阻遏遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸状态。在培养系统中去除色氨酸基底水平转录基底水平转录或者加入或者加入3-3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸（IAAIAA），），便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加中往往添加IAAIAA诱导诱导PPtrptrp介导的目介导的目基因的表达基因的表达色氨酸色氨酸或加或加3-3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白 （IAAIAAIAA）O OOtrptrptrpP PPtrptrptrp高效转录高效转录O OOtrptrptrpP PPtrptrptrp启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性l l噬菌体噬菌体启动子启动子P Pl ll lLL的可控性：的可控性：噬菌体启动子噬菌体启动子PPLL受受CICI阻遏蛋白阻阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基因遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的工程中常使用温度敏感型的工程中常使用温度敏感型的cI cIcI突突突变基因变基因cIcI857857控制控制PPLL。 cIcI857857阻遏蛋阻遏蛋在在4242时失活脱落，时失活脱落，PPLL便可介导便可介导目的基因的表达。但在大型细菌目的基因的表达。但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达用色氨酸间接控制目的基因表达P PPtrptrptrpA AAB BBcIcIcI857857857P PPL LL目的基因目的基因目的基因阻遏作用阻遏作用阻遏作用P PPtrptrptrpA AAB BBP PPL LL表达表达色氨酸色氨酸终止子终止子强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性 外外源源基基因因在在强强启启动动子子的的控控制制下下表表达达，容容易易发发生生转转录录过过头头现现象象，即即RNARNA聚聚合合酶酶滑滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNADNA序列，形成长短不一的序列，形成长短不一的mRNAmRNA混合物混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转转录录产产物物越越长长，RNARNA聚聚合合酶酶转转录录一一分分子子mRNAmRNA所所需需的的时时间间就就相相应应增增加加，外外源源基基因因本身的转录效率下降；本身的转录效率下降； 如如果果外外源源基基因因下下游游紧紧接接有有载载体体上上的的其其它它重重要要基基因因或或DNADNA功功能能区区域域，如如选选择择性性标标记记基基因因和和复复制制子子结结构构等等，则则RNARNA聚聚合合酶酶在在此此处处的的转转录录可可能能干干扰扰质质粒粒的的复复制制及及其其它它生生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的过长的mRNAmRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更更为为严严重重的的是是，过过长长的的转转录录物物往往往往不不能能形形成成理理想想的的二二级级结结构构，从从而而大大大大降降低低外外源源基因编码产物的翻译效率基因编码产物的翻译效率终止子终止子强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌止子是来自大肠杆菌rRNArRNA操纵子上的操纵子上的rrnTrrnT11T T22以及以及T7T7噬菌体噬菌体DNADNA上的上的T Tf f。对对于一些终止作用较弱的终止子，通常于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组组DNADNA中克隆筛选中克隆筛选pCP1pCP1pCP1ApApApr rroriorioriTcTcTcr rr筛选筛选ApAprr、TcTcss的转化子的转化子核糖体结合位点核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与频率，而且在很大程度上还与mRNAmRNA的翻译起始效率密切相关。大的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的肠杆菌细胞中结构不同的mRNAmRNA分子具有不同的翻译效率，它们之分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。间的差别有时可高达数百倍。mRNAmRNA翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其5 5 端端的结构序列所决定，称为的结构序列所决定，称为核糖体结合位点核糖体结合位点（RBSRBS） 核糖体结合位点核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位位于于翻翻译译起起始始密密码码子子上上游游的的6-86-8个个核核苷苷酸酸序序列列5 5 UAAGGAGG UAAGGAGG 33，即即Shine-DalgarnoShine-Dalgarno（SDSD）序序列列，它它通通过过识识别别大大肠肠杆杆菌菌核核糖糖体体小小亚亚基基中中的的 1616S S rRNA rRNA 33端端 区区 域域 3 3 AUUCCUCC AUUCCUCC 55并并 与与 之之 专专 一一 性性 结结 合合 ， 将将mRNAmRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；定位于核糖体上，从而启动翻译；翻翻译译起起始始密密码码子子，大大肠肠杆杆菌菌绝绝大大部部分分基基因因以以AUGAUG作作为为阅阅读读框框架架的的起起始位点，但有些基因也使用始位点，但有些基因也使用GUGGUG或或UUGUUG作为翻译起始密码子；作为翻译起始密码子；SDSD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；基因编码区基因编码区5 5 端若干密码子的碱基序列端若干密码子的碱基序列 核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列的影响序列的影响： 一般来说，一般来说，mRNAmRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于率就越高，而这种结合程度主要取决于SDSD序列与序列与1616S rRNAS rRNA的碱的碱基互补性，其中以基互补性，其中以GGAGGGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成言，上述四个碱基中任何一个换成CC或或T T，均会导致翻译效率大幅均会导致翻译效率大幅度降低度降低 核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响： SDSD序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为AAAAAAAA或或UUUUUUUU，翻译效率最高；而翻译效率最高；而CCCCCCCC或或GGGGGGGG的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的50%50%和和25%25%。紧邻。紧邻AUGAUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b b- -半半乳糖苷酶的乳糖苷酶的mRNAmRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAUUAU或或CUUCUU，如果用如果用UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG取代之，则酶的表达水平低取代之，则酶的表达水平低2020倍倍核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响： SDSD序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNAmRNA在核糖体在核糖体上定位后，翻译起始密码子上定位后，翻译起始密码子AUGAUG正好处于核糖体复合物结构中的正好处于核糖体复合物结构中的P P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SDSD序列位于序列位于AUGAUG之前大约之前大约七个碱基七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低会导致翻译起始效率不同程度的降低核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响起始密码子及其后续若干密码子的影响起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始大肠杆菌中的起始tRNAtRNA分子可以同时识别分子可以同时识别AUGAUG、GUGGUG和和UUGUUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUGGUG为为AUGAUG的的50%50%而而UUGUUG只及只及AUGAUG的的25%25%。除此之外，从。除此之外，从AUGAUG开始的前几个密码子碱开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNAmRNA的的5 5 端非编码区形端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰成茎环结构，否则便会严重干扰mRNAmRNA在核糖体上的准确定位在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的 密码子密码子生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是： 生物基因组中的碱基含量生物基因组中的碱基含量 在富含在富含ATAT的生物（如单链的生物（如单链DNADNA噬菌体噬菌体f fX174X174）基因组中，密码子第三位上的基因组中，密码子第三位上的UU和和A A出现的频率较高；而在出现的频率较高；而在GCGC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有GG或或CC的简并密码子的简并密码子占占90%90%以上的绝对优势以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律性中等强度规律 细胞细胞内内tRNAtRNA的含量的含量如如GGGGGG、CCCCCC、GCGGCG、GGCGGC、AAAAAA、UUUUUU、AUAAUA、UAUUAU等使用少；等使用少；如如GUGGUG、CACCAC、UCGUCG、AGCAGC、ACAACA、UGUUGU、AUCAUC、UUGUUG等使用多；等使用多；密码子密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高 效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源基因全合成外源基因全合成外源基因全合成同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因编码基因密码子密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法 外源基因全合成外源基因全合成外源基因全合成密码子密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响 对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNAtRNA编码基因同步克隆表达编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在的策略较为有利。例如，在人尿激酶原人尿激酶原cDNAcDNA的的412412个密码子中，共含个密码子中，共含有有2222个个精氨酸密码子精氨酸密码子，其中，其中7 7个个AGGAGG、2 2个个AGAAGA，而大肠杆菌受体细胞而大肠杆菌受体细胞中中tRNAtRNAAGGAGG和和tRNAtRNAAGAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNAcDNA在大肠在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNAtRNA编码基因克隆在另一个编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用细胞对外源基因高效表达的制约作用同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因编码基因质粒拷贝数质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道轨道质粒拷贝数质粒拷贝数质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制pCP3pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子拥有一个温度可诱导型的复制子pCP3pCP3pCP3P PPL LLMCSMCSMCSoriorioriApApApr rr在在2828时，每个细胞的质粒拷贝数为时，每个细胞的质粒拷贝数为6060在在4242时，拷贝数迅速增至时，拷贝数迅速增至300 - 600300 - 600在此温度下，受体细胞染色体上的在此温度下，受体细胞染色体上的CICI基基 因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一种手段同时控制质粒拷因此，用一种手段同时控制质粒拷 贝数和基因的表达贝数和基因的表达C C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略6 6 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为溶性的结构称为包涵体包涵体（Inclusion BodiesInclusion Bodies，IBIB）。）。富含蛋白质的包涵富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNADNA、RNARNA和和脂多糖等非蛋白分子脂多糖等非蛋白分子包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点能简化外源基因表达产物的分离操作能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体表达形式的优点：包涵体表达形式的优点：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来解物中分离出来能在一定程度上保持表达产物的结构稳定能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁蛋白的稳定性已构不成威胁包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的缺点：包涵体表达形式的缺点： 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的分子中的CysCys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过一般不超过30%30%包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的操作以包涵体形式表达目的蛋白的操作 如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%20%以上时，表达产以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在法的长处所在包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作C C 共价修饰的蛋白质共价修饰的蛋白质蛋白质变性复性的动力学原理：蛋白质变性复性的动力学原理：C CC1 11C CC2 22C CCn nnC CCU UUI I I 1 11I I I n nnN NNX XX1 11X XX2 22X XXn nnX XXAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgI I 有效变复性过程中的中间状态有效变复性过程中的中间状态X X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态N N 天然状态的蛋白质天然状态的蛋白质U U 变性状态的蛋白质变性状态的蛋白质A A 集聚状态的蛋白质集聚状态的蛋白质在细菌细胞内，在细菌细胞内，集聚状态集聚状态和和共价修饰共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性： 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键二硫键和和次级键次级键在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：包涵体溶解变性的试剂和条件包括： 清洗剂清洗剂 SDSSDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 促溶剂促溶剂 盐酸胍盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发 形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂混合溶剂 如如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强 极端极端pH pH 廉价，但许多蛋白质在极端廉价，但许多蛋白质在极端pHpH条件下发生修饰反应条件下发生修饰反应包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refoldingrefolding）：）： 包涵体的复性与重折叠的主要任务是：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：通过通过次级键次级键的形成使蛋白质复性的形成使蛋白质复性将多肽链中被拆开的将多肽链中被拆开的游离巯基游离巯基重新折叠重新折叠包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refoldingrefolding）：）：复性操作复性操作 包涵体复性操作的方法包括：包涵体复性操作的方法包括：分段稀释法，分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生一步稀释法，一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大试剂添加法，试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEGPEG、CaCa2+2+蛋白修饰法，蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法，产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法，分子伴侣法，GroELGroEL、GroESGroES、DnaKDnaK，固定化，共表达固定化，共表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refoldingrefolding）：）：二硫键形成二硫键形成在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防化学氧化法（化学氧化法（AA）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是二硫键交换（二硫键交换（BB）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSHGSH和和GSSGGSSG），），二硫键二硫键止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有：配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有： 随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠 形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好HSHSHSHSHSHS S S S S S S+ + +2 22e ee+ + +2 22H HH+ +A AAHSHSHSHSHSHS S-S-R S-S-R S-S-R HS HS HS+ + +B BBR-S-S-RR-S-S-RR-S-S-R S S S S S S2 22R-SHR-SHR-SH分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物产物NN端端信号肽信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件序列的存在是蛋白质分泌的前提条件分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达以分泌形式表达目的蛋白的优缺点以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的优点：分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳 稳定性大约是在细胞质中的稳定性大约是在细胞质中的1010倍倍目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整目的蛋白末端完整目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白相当多的真核生物成熟蛋白相当多的真核生物成熟蛋白N NN端并不含有端并不含有端并不含有 甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质 N N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠 杆菌的杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其NN端端 的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达以分泌形式表达目的蛋白的优缺点以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的缺点：分泌表达形式的缺点： 相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍尽管有，但并不普遍分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达蛋白质的分泌机制蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多原核细菌周质中含有多种种分子伴侣分子伴侣可阻止分泌可阻止分泌蛋白的随机折叠蛋白的随机折叠，分泌分泌在细胞周质或培养基中在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感蛋白酶不敏感 分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型目的蛋白表达系统的构建分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内上的磷酸酯酶上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。，导致细菌内外膜的通透性增大。 因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。组大肠杆菌中的完全分泌。融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达 除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架阅读框架进行表达。由这进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于通常受体细菌的蛋白部分位于NN端，异源蛋白位于端，异源蛋白位于CC端。通过在端。通过在DNADNA水水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达以融合形式表达目的蛋白的优缺点以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进目的蛋白表达率高目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件与受体蛋白共用一套完善的表达元件 胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性 目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段 行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白溶解性好目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在目的蛋白需要回收目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型目的蛋白表达系统的构建融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表达质粒的构建原则：融合蛋白表达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着为目的蛋白分离回收创造条件为目的蛋白分离回收创造条件外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，融合蛋白的裂解工艺融合蛋白的裂解工艺两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型目的蛋白表达系统的构建融合型目的蛋白表达系统的构建用于融合蛋白构建的受体蛋白：用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（谷胱甘肽转移酶（GSTGST） 维持良好空间构象维持良好空间构象硫氧化还原蛋白（硫氧化还原蛋白（TrxATrxA） 维持良好空间构象维持良好空间构象 pTrxFuspTrxFus麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（MBPMBP） 促进分泌促进分泌金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白A A（SAPASAPA） 免疫亲和层析免疫亲和层析 pRIT2TpRIT2T外膜蛋白（外膜蛋白（OmpFOmpF） 促进分泌促进分泌b b- -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZLacZ） 免疫亲和层析免疫亲和层析泛素蛋白（泛素蛋白（UbiUbi） 维持良好空间构象维持良好空间构象融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收目的蛋白的回收目的蛋白的回收 融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：法有两种： 化学断裂法化学断裂法 酶促裂解法酶促裂解法 融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收目的蛋白的回收目的蛋白的回收 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰溴化氰（CNBrCNBr）它与多肽链中的它与多肽链中的甲硫氨酸甲硫氨酸残基侧链的残基侧链的硫醚基硫醚基反应，生成溴化亚氨内反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段其中其中上游肽段上游肽段的甲硫氨酸残基转化为的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸高丝氨酸残基，而下游肽段残基，而下游肽段NN端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高（可端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高（可达到达到85%85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的NN端不含甲端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如果硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法化学断裂法：化学断裂法：融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收目的蛋白的回收目的蛋白的回收酶促裂解法：酶促裂解法：单残基位点单残基位点蛋白内切酶蛋白内切酶切割位点切割位点切割位点梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶 Arg-CArg-C葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶 Glu-CGlu-C假单孢菌蛋白酶假单孢菌蛋白酶 Lys-CLys-C猪胰蛋白酶猪胰蛋白酶 Arg-CArg-C Lys-CLys-CLys-C蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，同时每种蛋白酶均具有相应的同时每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定断裂位点决定簇簇，因此可供选择的专一性断裂位点范围较，因此可供选择的专一性断裂位点范围较广。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白广。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的酶分别在多肽链中的精氨酸精氨酸、谷氨酸、赖氨谷氨酸、赖氨酸酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件是外用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但赖氨酸残基，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的Arg CArg CArg CN NNN NNC CC受体蛋白受体蛋白受体蛋白目的蛋白目的蛋白目的蛋白融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收目的蛋白的回收目的蛋白的回收酶促裂解法：酶促裂解法：多残基位点多残基位点 为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码编码寡肽序列寡肽序列（Ile-Glu-Gly-ArgIle-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，该寡肽为具有的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的蛋白酶活性的凝血因子凝血因子XaXa的识别和作用序列，其断裂位点在的识别和作用序列，其断裂位点在ArgArg的的CC末端末端。纯化后的融合蛋白用。纯化后的融合蛋白用XaXa处理，即可获得不含上述寡肽序列处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于的目的蛋白。由于XaXa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收目的蛋白的回收目的蛋白的回收酶促裂解法：酶促裂解法：多残基位点多残基位点启动子启动子受体基因受体基因受体基因接头接头目的基因目的基因目的基因MetMetMetArgArgArgStopStopStopLysLysLysGluGluGluIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-ArgArgArgArgLysLysLysGluGluGluIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-Arg表达表达亲和层析亲和层析酶解回收酶解回收融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达目的蛋白的回收目的蛋白的回收目的蛋白的回收酶促裂解法：酶促裂解法：多残基位点多残基位点Pinpoint XaPinpoint XaPinpoint Xatactactac生物素结合肽编码序列生物素结合肽编码序列XaXa因子识别位点编码序列因子识别位点编码序列SP6SP6SP6T7T7T7ApApApr rroriorioriMCSMCSMCSATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGCATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGCXa-1Xa-1Xa-1Ile Glu Gly ArgIle Glu Gly Arg GluGluATC GAA GGT CGC GAA ATC GAA GGT CGC GAA A AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG CGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG CXa-2Xa-2Xa-2ATC GAA GGT CGC GAA ATC GAA GGT CGC GAA AAAAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GCG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GCXa-3Xa-3Xa-3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotIXaXaXa因子切割位点因子切割位点因子切割位点寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达 从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即贝数（即基因剂量基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量往往不能获得满意的效果。往往不能获得满意的效果。 另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建构建寡聚串联型异源蛋白表达载体寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白高效表达目的蛋白高效表达在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以稳定表达小分子短肽稳定表达小分子短肽在一定程度上改善表达量在一定程度上改善表达量目的产物回收困难目的产物回收困难短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高降解的能力大幅度提高降解的能力大幅度提高寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后裂解后的短肽分子容易出现序列不均一性的短肽分子容易出现序列不均一性寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型目的蛋白表达系统的构建寡聚型目的蛋白表达系统的构建P PPSDSDSDgenegenegenegenegenegenegenegenegenegenegenegeneT TT1 1 1 T TT2 22H HH2 22N NNCOOHCOOHCOOHMetMetMetMetMetMetMetMetMetMetMetMetmRNAmRNAmRNACNBrCNBrCNBr基本战略：基本战略：寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型目的蛋白表达系统的构建寡聚型目的蛋白表达系统的构建构建举例：构建举例：P P PSDSDSDT T T1 1 1 T T T2 22EcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIBamHIAATTCAGATCTAATTCAGATCTAATTCAGATCT GTCTAGA GTCTAGA GTCTAGAG GGCCTAGCCTAGCCTAGEcoRIEcoRIEcoRIBgl IIBgl IIBgl IIBamHIBamHIBamHIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIBamHIBgl IIBgl IIBgl II GATCT GATCT GATCT A A AG G GCCTAGCCTAGCCTAGEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIBamHIBgl IIBgl IIBgl IIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIBamHIBgl IIBgl IIBgl IIEcoRI + BamHIEcoRI + BamHIEcoRI + BamHIBgl II + BamHIBgl II + BamHIBgl II + BamHIBamHIBamHIBamHI整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达以整合形式表达目的蛋白的优缺点以整合形式表达目的蛋白的优缺点目的基因稳定表达目的基因稳定表达整合型的目的基因随受体细胞染色体整合型的目的基因随受体细胞染色体DNADNA的复制而复制，在大的复制而复制，在大多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续目的基因表达率低目的基因表达率低单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达元件而加以补偿元件而加以补偿培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程案例特别有意义的的基因工程案例特别有意义整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达DNADNA体内重组的基本原理体内重组的基本原理 在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNADNA的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种群的进的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种群的进化。细胞内的化。细胞内的遗传重组遗传重组可分为两大类：可分为两大类： 转位因子依赖型转位因子依赖型同源序列依赖型同源序列依赖型整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达DNADNA体内重组的基本原理体内重组的基本原理 转位因子转位因子是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNADNA可可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子，例如：移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子，例如： 转位因子依赖型的体内重组：转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族转位因子家族噬菌体噬菌体 GG片段（片段（G-FragmentG-Fragment） 原核细菌原核细菌 插入顺序（插入顺序（ISIS） 真核细菌真核细菌 转座子（转座子（TnTn、TyTy） 高等植物高等植物 可移动因子（可移动因子（AcAc、DsDs） 高等动物高等动物 跳跃基因（跳跃基因（mobil genemobil gene） 整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达DNADNA体内重组的基本原理体内重组的基本原理转位因子依赖型的体内重组：转位因子依赖型的体内重组：转位因子的结构转位因子的结构ISISIS（1 kb1 kb1 kb）TyTyTy（5 kb5 kb5 kb）TnTnTn（2 - 20 kb2 - 20 kb2 - 20 kb）ACCATGGTTACCATGGTTACCATGGTTTTGGTACCATTGGTACCATTGGTACCA抗药性基因抗药性基因转位酶基因转位酶基因识别位点识别位点阻遏基因阻遏基因阻遏基因IRIRIRIRIRIRIRIRIRIRIRIRISISISISISIS整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达DNADNA体内重组的基本原理体内重组的基本原理转位因子依赖型的体内重组：转位因子依赖型的体内重组：整合形式整合形式整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达DNADNA体内重组的基本原理体内重组的基本原理 在在很很多多原原核核细细菌菌细细胞胞中中，染染色色体体DNADNA链链上上的的两两个个同同源源区区之之间间可可发发生生所所谓谓的的同同源源重重组组，其其频频率率与与细细菌菌种种类类、两两个个同同源源区区之之间间的的距距离离同同源源区区的的长长度度、同同源源程程度度密密切切相相关关。一一般般地地说说，距距离离越越远远、长长度度越越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。 同源重组有同源重组有整合整合和和交换交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者涉及两个断裂位点而后者涉及两个断裂位点同源序列依赖型的体内重组：同源序列依赖型的体内重组：基本形式基本形式整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达DNADNA体内重组的基本原理体内重组的基本原理同源序列依赖型的体内重组：同源序列依赖型的体内重组：同源整合同源整合orioriori目的基因目的基因目的基因同源区域同源区域同源区域标记基因标记基因整合位点整合位点整合位点染色体染色体染色体DNADNADNA整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达DNADNA体内重组的基本原理体内重组的基本原理同源序列依赖型的体内重组：同源序列依赖型的体内重组：同源交换同源交换orioriori目的基因目的基因目的基因同源区域同源区域同源区域标记基因标记基因交换区域交换区域染色体染色体染色体DNADNADNAorioriori标记基因标记基因+ + + + + +蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 无论是在真核生物还是在原核细胞中，重组目的蛋白表无论是在真核生物还是在原核细胞中，重组目的蛋白表达后都会面临被降解的命运，其稳定性甚至还不如半衰期较达后都会面临被降解的命运，其稳定性甚至还不如半衰期较短的受体细胞内源性蛋白质。短的受体细胞内源性蛋白质。 在大多数情况下，重组目的蛋白的不稳定性可归结为对在大多数情况下，重组目的蛋白的不稳定性可归结为对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。然而越来越多的实验表明，受体细胞蛋白酶系统的敏感性。然而越来越多的实验表明，重组目的蛋白在受体细胞内的半衰期可以通过蛋白序列的人重组目的蛋白在受体细胞内的半衰期可以通过蛋白序列的人工设计以及受体细胞的改造加以调整和控制。工设计以及受体细胞的改造加以调整和控制。蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 实验结果表明，大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆菌实验结果表明，大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆菌中的蛋白酶中的蛋白酶LaLa和和TiTi降解的，两者分别由降解的，两者分别由lonlon和和clpclp基因编码，其蛋基因编码，其蛋白水解活性依赖于白水解活性依赖于ATPATP。lonlon基因由热休克等环境压力激活，细基因由热休克等环境压力激活，细胞内异常蛋白或重组异源蛋白的过量表达也可作为一种环境压力胞内异常蛋白或重组异源蛋白的过量表达也可作为一种环境压力诱导诱导lonlon基因的表达。基因的表达。lonlon-的的大肠杆菌突变株可使原来半衰期较短大肠杆菌突变株可使原来半衰期较短的细菌调控蛋白（如的细菌调控蛋白（如SulASulA、RscARscA、l lNN）稳定性大增，因此被广稳定性大增，因此被广泛用作外源基因高效表达的受体菌。泛用作外源基因高效表达的受体菌。蛋白酶缺陷型受体细胞的改造蛋白酶缺陷型受体细胞的改造lonlon基因缺陷的大肠杆菌受体（基因缺陷的大肠杆菌受体（lon lon - - -）：）：蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 大肠杆菌中庞大的热休克蛋白家族对异常或大肠杆菌中庞大的热休克蛋白家族对异常或异源蛋白的降解异源蛋白的降解也有重要作用，其机理是胁迫也有重要作用，其机理是胁迫异常或异常或异源蛋白形成一种对蛋白异源蛋白形成一种对蛋白酶酶识别和降解较有利的空间构象，从而提高识别和降解较有利的空间构象，从而提高异常或异常或异源蛋白对蛋白异源蛋白对蛋白酶的敏感性。热休克基因酶的敏感性。热休克基因dnaKdnaK、dnaJdnaJ、groELgroEL、grpEgrpE以及环境以及环境压力特异性压力特异性s s因子编码基因因子编码基因htpRhtpR的突变株均呈现出对异源蛋白降的突变株均呈现出对异源蛋白降解作用的严重缺陷，特别是解作用的严重缺陷，特别是lonlon-htpRhtpR-的双缺陷株，非常适合高效的双缺陷株，非常适合高效表达各种不稳定的重组异源蛋白表达各种不稳定的重组异源蛋白。蛋白酶缺陷型受体细胞的改造蛋白酶缺陷型受体细胞的改造htpRhtpR基因缺陷的大肠杆菌受体（基因缺陷的大肠杆菌受体（htpR htpR - - -）：）：蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 大量的实验结果表明，在所大量的实验结果表明，在所有的极性氨基酸中，有的极性氨基酸中，天门冬氨酸天门冬氨酸（AspAsp）的存在对提高蛋白质稳定性的效应最显著，而且的存在对提高蛋白质稳定性的效应最显著，而且AspAsp残残基离基离CC末端末端越近，蛋白质的稳定性就越大。更为重要的是，在多越近，蛋白质的稳定性就越大。更为重要的是，在多种结构和功能相互独立的蛋白质种结构和功能相互独立的蛋白质CC末端引入末端引入AspAsp残基，都能显著残基，都能显著地延长这些蛋白质的半衰期，因此具有普遍意义地延长这些蛋白质的半衰期，因此具有普遍意义。抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链多肽链CC末端氨基酸序列对稳定性的影响：末端氨基酸序列对稳定性的影响：蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 大量的实验结果同时表明，如果多肽链的大量的实验结果同时表明，如果多肽链的NN末端序列中含有末端序列中含有较高比例的较高比例的AlaAla、AsnAsn、CysCys、GlnGln、HisHis，则蛋白质的稳定性显著则蛋白质的稳定性显著改善。改善。 相反，相反，NN末端含有末端含有ProPro、GluGlu、SerSer、ThrThr的真核生物蛋白质，的真核生物蛋白质，在真核和原核细胞中的半衰期通常很短在真核和原核细胞中的半衰期通常很短，尤其尤其Pro-Glu-Ser-ThrPro-Glu-Ser-Thr序列序列（PESTPEST序列序列），是胞内蛋白酶的超敏感区。），是胞内蛋白酶的超敏感区。抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链多肽链NN末端氨基酸序列对稳定性的影响：末端氨基酸序列对稳定性的影响：D D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策6 6 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善基因工程菌不稳定性的策略改善基因工程菌不稳定性的策略基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制工程菌遗传不稳定性的表现形式工程菌遗传不稳定性的表现形式 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：这种不稳定性具有下列两种表现形式：结构不稳定性结构不稳定性重组重组DNADNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失其表观生物学功能的丧失分配不稳定性分配不稳定性整个重组整个重组DNADNA分子从受体细胞中逃逸（分子从受体细胞中逃逸（curingcuring）基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制工程菌遗传不稳定性的产生机制工程菌遗传不稳定性的产生机制受体细胞中的限制修饰系统对外源重组受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNADNA分子的降解分子的降解能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配这是重组质粒逃逸的基本原因这是重组质粒逃逸的基本原因受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制重组质粒的逃逸率重组质粒的逃逸率一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为 当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中称为重组质粒的称为重组质粒的宏观逃逸率宏观逃逸率。重组质粒逃逸的原因有：。重组质粒逃逸的原因有： 高温培养、表面活性剂（高温培养、表面活性剂（SDSSDS）、）、药物（利福平）、染料（药物（利福平）、染料（ 吖啶）促使重组质粒渗漏吖啶）促使重组质粒渗漏 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒受体细胞中的核酸酶降解重组质粒 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒 拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧改善基因工程菌不稳定性的策略改善基因工程菌不稳定性的策略改进载体受体系统改进载体受体系统 以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括：以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括：将将R1R1质粒上的质粒上的parBparB基因引入表达型载体中，基因引入表达型载体中，其表达产物可以其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞正确设置载体上的多克隆位点，正确设置载体上的多克隆位点，禁止禁止DNADNA片段插在稳定区内片段插在稳定区内将受体细胞的致死性基因安装在载体上，将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssbssb基因（基因（DNADNA单链结合单链结合蛋白编码基因蛋白编码基因改善基因工程菌不稳定性的策略改善基因工程菌不稳定性的策略施加选择压力施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营培养基复杂，成本较高培养基复杂，成本较高养组份养组份改善基因工程菌不稳定性的策略改善基因工程菌不稳定性的策略控制目的基因的过量表达控制目的基因的过量表达使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数优化基因工程菌的培养工艺优化基因工程菌的培养工艺培养基组成：培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定较低的培养温度有利于重组质粒的稳定E E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素6 6 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成S SSS SSS SSS SSC CCN NNS SSS SSB B 肽（肽（3030）C C 肽（肽（3131）A A 肽（肽（2121）R RRR RRR RRK KKS SSS SSS SSS SSC CCN NNS SSS SSN NNC CC高尔基体内的特异性肽酶高尔基体内的特异性肽酶N NNC CC信号肽信号肽B B B 肽肽肽C C C 肽肽肽A A A 肽肽肽信号肽酶信号肽酶人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法直接提取法制人胰岛素直接提取法制人胰岛素迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。床需求。床需求。人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法化学合成法制人胰岛素化学合成法制人胰岛素根据人胰岛素根据人胰岛素A A链和链和B B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法化学转型法制人胰岛素化学转型法制人胰岛素 猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在与人胰岛素只在B B链的链的CC末端有一个氨基酸的差异，猪的为末端有一个氨基酸的差异，猪的为AlaAla，人人的为的为ThrThr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。选择。选择。 上述思路的技术路线是：在上述思路的技术路线是：在pHpH为为6-76-7的有机相中使胰蛋白酶催的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B B链链CC末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%60%但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法基因工程法制人胰岛素基因工程法制人胰岛素 1982 1982年，美国年，美国Ely LiLiEly LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。19871987年，年，NovoNovo公司公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合受体结合性能性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用降血糖作用、血浆药代血浆药代动力学动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫无免疫原性原性、注射吸收迅速等注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。中的巨大潜力。中的巨大潜力。重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A A链和链和B B链分别表达法链分别表达法基因工程菌的构建战略：基因工程菌的构建战略：tactactactactactacb bb- -GalGalGalb bb- -GalGalGalA peptideA peptideA peptideB peptideB peptideB peptideorioriorioriorioriApApApr rrApApApr rrMetMetMetMetMetMetMetMetMetMetMetMetMMMMMMN NNC CCMMMMMMN NNC CC化学合成化学合成化学合成A A A链链链和和B B链的编码链的编码序列序列序列重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A A链和链和B B链分别表达法链分别表达法表达产物的后处理路线：表达产物的后处理路线：MMMMMMN NNC CCMMMMMMN NNC CCb bb- -GalGalGalb bb- -GalGalGalA AAB BBCNBr CNBr 处理处理N NNC CCS SSS SSS SSS SSC CCN NNS SSS SSN NNC CCN NNC CCN NNC CCN NNC CCCys Cys 体外氧化和重折叠体外氧化和重折叠分离纯化分离纯化重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A A链和链和B B链分别表达法链分别表达法生产技术的评价：生产技术的评价： 由于由于A A链和链和B B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有确配对率较低，通常只有10% - 20%10% - 20%，因此采用这条工艺路线生，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达产的重组人胰岛素每克成本高达100100美元美元以上。以上。 为了进一步降低生产成本，美国为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLiEly LiLi公司随后又建立了第公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。二条生产重组人胰岛素的工艺路线。重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建人胰岛素原表达法人胰岛素原表达法基因工程菌的构建战略：基因工程菌的构建战略：tactactacb bb- -GalGalGalC peptideC peptideC peptideoriorioriApApApr rrMetMetMetMetMetMetMMMMMMN NNC CCB peptideB peptideB peptideA peptideA peptideA peptide人胰岛素原的人胰岛素原的cDNAcDNA重组人胰岛素原重组人胰岛素原转化转化分离纯化分离纯化重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建人胰岛素原表达法人胰岛素原表达法表达产物的后处理路线：表达产物的后处理路线：S SSS SSS SSS SSC CCN NN胰蛋白酶胰蛋白酶C peptideC peptideC peptideA peptideA peptideA peptideB peptideB peptideB peptideMMMR RRR RRK KKR RRCNBrCNBrCNBrR RRS SSS SSS SSS SSC CCN NNN NNC CCS SSS SSS SSS SSR RR羧肽酶羧肽酶BBBB链中第链中第2222位上的位上的ArgArg和第和第2929位上的位上的LysLys由于良好折叠的原由于良好折叠的原因，对胰蛋白酶不敏感因，对胰蛋白酶不敏感重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建人胰岛素原表达法人胰岛素原表达法生产技术的评价：生产技术的评价： 在人胰岛素原表达工艺中，由于在人胰岛素原表达工艺中，由于CC肽的存在，胰岛素原能形成肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达达80%80%以上。虽然这条工艺路线并不比以上。虽然这条工艺路线并不比ABAB链分别表达法更为简捷，链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅5050美元美元。 目前美国目前美国Ely LiLiEly LiLi公司采用此工艺年产公司采用此工艺年产十几吨十几吨的重组人胰岛素。的重组人胰岛素。重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A A链和链和B B链同时表达法链同时表达法tactactacb bb- -GalGalGaloriorioriApApApr rrMetMetMetMetMetMetMMMMMMN NNC CCB peptideB peptideB peptideA peptideA peptideA peptide化学合成化学合成ABAB链编码序列链编码序列重组人胰岛素重组人胰岛素转化转化分离纯化分离纯化CNBr CNBr 处理处理特异性裂解特异性裂解体外折叠体外折叠重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建分泌型重组人胰岛素表达法分泌型重组人胰岛素表达法 上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌码序列与大肠杆菌b b- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包涵体的形式重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包涵体的形式存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与岛素或胰岛素原编码序列与b b- -內酰胺酶內酰胺酶基因拼接，基因拼接，b b- -內酰胺酶通內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。序减轻了负担。