u 研究背景(bijng)u 研究内容u 研究方法u 特色及创新处u 研究计划及预期成果第1页/共22页第一页，共23页。RSVRSV引起(ynq)(ynq)的病症病症：水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)是水稻条纹叶枯病的致病原，该病毒靠灰飞虱传播。症状：感病水稻发病初期叶片沿叶脉呈现断续的黄绿色或黄白色短条斑，以后常连成褪绿大片。早期发病植株枯死，发病迟的只在剑叶或叶鞘上有褪色斑，但抽穗(chu su)不良或穗畸形不实，病株分蘖一般减少。第2页/共22页第二页，共23页。 水稻条纹叶枯病最早于1897年在日本发现,在我国自1963年在苏南地区始发后,已经扩散到18个省市,特别是自2001年来在江苏和河南连续暴发,造成(zo chn)了水稻生产上的巨大损失。因此如何防止病害发生和控制病害流行成为研究者迫切希望解决的问题。RSVRSV的危害(wihi)(wihi)第3页/共22页第三页，共23页。RSVRSV基因组结构(jigu)(jigu)和功能RNA1RdRpRNA2RNA3NS2NSvc2NS3CPRNA4SPMPRdRp: RNARdRp: RNA聚合酶聚合酶NSvc2: NSvc2: 推测为糖蛋白推测为糖蛋白NS3NS3：RNARNA沉默沉默(chnm)(chnm)抑制子抑制子CPCP： 外壳蛋白外壳蛋白SPSP： 症状相关蛋白症状相关蛋白MP: MP: 移动蛋白移动蛋白3506 nts2472 nts2137 nts8970 nts第4页/共22页第四页，共23页。RSV RSV 研究(ynji)(ynji)情况 初步初步(chb)(chb)研究的研究的方面方面基因组序列、某些(mu xi)基因功能转基因的抗病毒植物 还需研究的方面还需研究的方面基因功能病毒的致病机理病毒的传播机制第5页/共22页第五页，共23页。深入研究难点(ndin)(ndin) RSV RSV的侵染性克隆的侵染性克隆(k (k ln)ln)难以建立难以建立 灰飞虱细胞系还未建立(jinl)第6页/共22页第六页，共23页。立项依据及研究立项依据及研究(ynji)(ynji)意义意义 RSV RSV与宿主与宿主(szh)(szh)互作研究的重要互作研究的重要性性 研究研究(ynji)(ynji)的的创新性创新性 结合实验条件结合实验条件第7页/共22页第七页，共23页。研究(ynji)(ynji)内容 CP与水稻(shudo)的互作 构建水稻(shudo)cDNA文库 筛选筛选cDNAcDNA文库中与文库中与CPCP互作的蛋白互作的蛋白 蛋白功能分析蛋白功能分析 cDNA 文库：生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段集合。测序、序列比对，分析基因功能。方法：酵母双杂交系统第8页/共22页第八页，共23页。 NSvc2蛋白(dnbi)是否为病毒传播必需 CP、NSvc2蛋白是否(sh fu)存在相互作用 NSvc2蛋白是否具有膜融合(rngh)功能酵母双杂交系统验证蛋白间的互作利用杆状病毒表达系统使目的蛋白展示在细胞膜上，然后研究膜融合功能 CP、NSvc2蛋白与昆虫细胞的互作第9页/共22页第九页，共23页。u 水稻cDNA 文库(wnk)构建研究(ynji)(ynji)方法总RNAmRNA的分离(fnl)AAAATT TTmRNAcDNAcDNA第一链合成AAAATT TTcDNA第二链合成AAAA5AAAATT TT加接头，连接载体构建cDNA文库Oligo(dT)Oligo(dT)纤维纤维柱分离柱分离逆转录逆转录RNaseHDNA polymeraseDNA ligase重组载体感重组载体感染宿主菌染宿主菌第10页/共22页第十页，共23页。u 酵母(jiom)双杂交系统l l酵母激活因子酵母激活因子 GAL4 GAL4由由N N端的端的DNADNA结合域结合域(BD)(BD)和和C C端的转录激活域端的转录激活域(AD)(AD)组成。组成。GAL4GAL4分子的分子的DNADNA结合域可以和上游激活序列结合，而转结合域可以和上游激活序列结合，而转录激活域则能激活下游的基因进行转录。只有录激活域则能激活下游的基因进行转录。只有BDBD和和ADAD共同存在形共同存在形成复合体时才能成复合体时才能(cinng)(cinng)激活下游基因转录。激活下游基因转录。l l在酵母双杂交系统中，编码这两个结构域的在酵母双杂交系统中，编码这两个结构域的DNADNA片段分别被构建在片段分别被构建在两个独立的表达载体上，一个表达载体含有两个独立的表达载体上，一个表达载体含有BDBD基因片段与已知蛋基因片段与已知蛋白形成的融合基因，另一载体含白形成的融合基因，另一载体含ADAD基因片段与未知基因片段与未知cDNAcDNA形成的融形成的融合基因。若两种蛋白间互作便会形成复合体，启动报告基因的表合基因。若两种蛋白间互作便会形成复合体，启动报告基因的表达达 第11页/共22页第十一页，共23页。BDXCOOHGal4NH2+cDNA libraryCOOHcDNAADGal4NH2 共转化ADGal4?BDXPromoterLacZ ReporterPromoterLacZ ReporterBDX?AD酵母(jiom)双杂交系统原理第12页/共22页第十二页，共23页。酵母(jiom)双杂交基本过程第13页/共22页第十三页，共23页。蛋白细胞膜表面表达载体(zit)构建NSvc2蛋白前端连接gp64的信号肽序列，后端连接VSV G蛋白的跨膜结构域， 这样NSvc2蛋白表达后便成功展现(zhnxin)在了昆虫细胞膜上 gp64 spcp/NSvc2VSV G tm目的(md)蛋白信号肽跨膜域第14页/共22页第十四页，共23页。杆状病毒表达系统(xtng)表达蛋白第15页/共22页第十五页，共23页。第16页/共22页第十六页，共23页。细胞膜融合(rngh)功能的研究 目的(md)蛋白在细胞膜表面的表达检测抗体(kngt)标记TRITC， TRITC是一种荧光素，用激光共聚焦显微镜观察则细胞的表面出现橙红色荧光。 目的蛋白膜融合功能检测细胞低pH条件下诱导，然后观察细胞融合 的。pH shift time 0+4h+7h第17页/共22页第十七页，共23页。本研究(ynji)(ynji)创新点RSVRSV与宿主相互作用的研究还未有与宿主相互作用的研究还未有(wi yu)(wi yu)报道报道 首开了首开了RSVRSV侵染介体昆虫侵染介体昆虫(knchng)(knchng)机理机理的研究的研究利用杆状病毒表达系统，使目的蛋白呈利用杆状病毒表达系统，使目的蛋白呈现在膜上，便于研究蛋白的膜融合功能现在膜上，便于研究蛋白的膜融合功能第18页/共22页第十八页，共23页。年度(nind)(nind)研究计划u ：RSV CP与水稻(shudo)的互作u ：互作蛋白(dnbi)的功能分析u ：RSV侵染昆虫细胞机制研究第19页/共22页第十九页，共23页。预期(yq)(yq)研究成果构建水稻构建水稻cDNAcDNA文库文库探明探明RSV CPRSV CP功能及在病毒致病过程中所起作用功能及在病毒致病过程中所起作用RSV NSvc2RSV NSvc2蛋白的膜融合蛋白的膜融合(rngh)(rngh)功能功能初步阐明初步阐明RSVRSV侵染介体昆虫的机理侵染介体昆虫的机理第20页/共22页第二十页，共23页。Thank You !Thank You !Thank You!Thank You!第21页/共22页第二十一页，共23页。感谢您的观看(gunkn)！第22页/共22页第二十二页，共23页。内容(nirng)总结研究背景。病症：水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)是水稻条纹叶枯病的致病原，该病毒靠灰飞虱传播。早期发病植株枯死，发病迟的只在剑叶或叶鞘上有褪色斑，但抽穗不良或穗畸形不实，病株分蘖一般减少。水稻条纹叶枯病最早于1897年在日本发现,在我国自1963年在苏南地区始发后,已经扩散(kusn)到18个省市,特别是自2001年来在江苏和河南连续暴发,造成了水稻生产上的巨大损失。CP： 外壳蛋白第二十三页，共23页。