1实实 验验 五五碘淀粉比色法测定血清淀粉酶碘淀粉比色法测定血清淀粉酶 2实验目的实验目的 掌握掌握：碘淀粉比色法测定碘淀粉比色法测定AMYAMY的原理的原理熟悉熟悉：碘淀粉比色法测：碘淀粉比色法测AMYAMY的操作的操作了解了解：AMYAMY测定的方法进展测定的方法进展3 血清淀粉酶概述概述概述概述n n淀淀粉酶（粉酶（粉酶（粉酶（AMYAMYAMYAMY）又称）又称）又称）又称1,41,41,41,4葡聚糖水解酶，作葡聚糖水解酶，作葡聚糖水解酶，作葡聚糖水解酶，作用于多糖分子的用于多糖分子的用于多糖分子的用于多糖分子的1,41,41,41,4糖苷键，生成麦芽糖和葡萄糖苷键，生成麦芽糖和葡萄糖苷键，生成麦芽糖和葡萄糖苷键，生成麦芽糖和葡萄糖。主要存在于胰腺、唾液腺及其分泌液中。对于食糖。主要存在于胰腺、唾液腺及其分泌液中。对于食糖。主要存在于胰腺、唾液腺及其分泌液中。对于食糖。主要存在于胰腺、唾液腺及其分泌液中。对于食物中的多糖物质消化起到重要的作用。物中的多糖物质消化起到重要的作用。物中的多糖物质消化起到重要的作用。物中的多糖物质消化起到重要的作用。n n血清淀粉酶主要有两种同工酶，同工酶血清淀粉酶主要有两种同工酶，同工酶血清淀粉酶主要有两种同工酶，同工酶血清淀粉酶主要有两种同工酶，同工酶P P P P来自胰腺，来自胰腺，来自胰腺，来自胰腺，同工酶同工酶同工酶同工酶S S S S来自唾液等组织。血清淀粉酶增高对于急性来自唾液等组织。血清淀粉酶增高对于急性来自唾液等组织。血清淀粉酶增高对于急性来自唾液等组织。血清淀粉酶增高对于急性胰腺炎有诊断价值，也常用于急性胰腺炎和急腹症的胰腺炎有诊断价值，也常用于急性胰腺炎和急腹症的胰腺炎有诊断价值，也常用于急性胰腺炎和急腹症的胰腺炎有诊断价值，也常用于急性胰腺炎和急腹症的鉴别诊断。而鉴别诊断。而鉴别诊断。而鉴别诊断。而淀粉酶同工酶的测定比总酶有着更淀粉酶同工酶的测定比总酶有着更淀粉酶同工酶的测定比总酶有着更淀粉酶同工酶的测定比总酶有着更好的诊断灵敏度和特异性。好的诊断灵敏度和特异性。好的诊断灵敏度和特异性。好的诊断灵敏度和特异性。4 方法概述n n测定方法分类，大致可以分为粘度测量法、比测定方法分类，大致可以分为粘度测量法、比浊法、碘量法、糖化法和染料释放法。浊法、碘量法、糖化法和染料释放法。n以天然淀粉为底物的测定方法 早期的一种方法，共同缺点是天然淀粉缺乏统一明确的分早期的一种方法，共同缺点是天然淀粉缺乏统一明确的分子结构和化学性质，因此难以达到方法学标准化，测定的准确子结构和化学性质，因此难以达到方法学标准化，测定的准确性和重复性较差，但因方法简单易行，尚有应用于基层医院手性和重复性较差，但因方法简单易行，尚有应用于基层医院手工测定工测定 。n以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的方法。 这类底物的结构和分子量确定，溶解度好可以配制较高浓度，使酶反应初速度达到最大速度，满足零级反应的要求。这类方法均适合自动化分析，分析速度快，精密度高，酶的活性可以国际单位表达，目前几乎已完全取代了天然淀粉为底物的方法。 n nIFCCIFCCIFCCIFCC推荐方法是对硝基麦芽庚糖苷法（推荐方法是对硝基麦芽庚糖苷法（推荐方法是对硝基麦芽庚糖苷法（推荐方法是对硝基麦芽庚糖苷法（4NP-G74NP-G74NP-G74NP-G7法）法）法）法）对对-硝基苯麦芽庚糖苷硝基苯麦芽庚糖苷(4-nitrophenyl-malto-heptaoside，4NP-G7)为底物，经为底物，经-淀粉酶催化，水淀粉酶催化，水解为游离的寡糖解为游离的寡糖(G5，G4，G3)及葡萄糖残基减少的及葡萄糖残基减少的对对-硝基苯寡糖苷硝基苯寡糖苷(4NP-G2，4NP-G3，4NP-G4)。4NP-G2、4NP-G3及部分及部分4NP-G4，在，在-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶催化下，进一步水解为葡萄糖和对催化下，进一步水解为葡萄糖和对-硝基酚硝基酚对对-硝基苯麦芽庚糖苷法硝基苯麦芽庚糖苷法了解了解7碘比色法实验原理碘比色法实验原理 淀粉经淀粉经-淀粉酶淀粉酶(-1.4(-1.4糖苷健糖苷健) )催化，水催化，水解为麦芽糖解为麦芽糖, ,及葡萄糖及葡萄糖,-1.6,-1.6糖苷健的糊精。糖苷健的糊精。在底物过量的前提下在底物过量的前提下, ,反应后加入碘液反应后加入碘液, ,与未与未反应的淀粉结合生成兰色化合物反应的淀粉结合生成兰色化合物, ,淀粉消耗淀粉消耗量在一定范围内与量在一定范围内与-淀粉酶活性呈正比。淀粉酶活性呈正比。8试剂与器材试剂与器材 1、0.4g/L缓冲淀粉溶液缓冲淀粉溶液 成分及作用：可溶性淀粉成分及作用：可溶性淀粉（底物）；磷酸氢二钠和磷酸二氢钾（缓冲液），氯（底物）；磷酸氢二钠和磷酸二氢钾（缓冲液），氯化钠（淀粉酶的激活剂）；甲醛（防腐剂）。化钠（淀粉酶的激活剂）；甲醛（防腐剂）。2、0.1mol/L碘储存液碘储存液 碘酸钾和碘化钾（提供显色反碘酸钾和碘化钾（提供显色反应的碘）；浓盐酸（稳定剂）应的碘）；浓盐酸（稳定剂）3、0.01mol/L碘应用液碘应用液9加入物加入物加入物加入物(ml) (ml) (ml) (ml) 空白管空白管空白管空白管测定管测定管测定管测定管1 1 1 1（重复两次）（重复两次）（重复两次）（重复两次） 测定管测定管测定管测定管2 2 2 2缓冲淀粉溶液缓冲淀粉溶液缓冲淀粉溶液缓冲淀粉溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 （37373737预温预温预温预温5min5min5min5min） 1.01.01.01.0血清或稀释唾液血清或稀释唾液血清或稀释唾液血清或稀释唾液 - -0.020.020.020.02立即混匀，置37水浴保温7.5min（准确）碘应用液碘应用液碘应用液碘应用液 1.01.01.01.0 1.0 1.0 1.0 1.0 去离子水去离子水去离子水去离子水 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0充分混匀，以波长充分混匀，以波长660nm660nm，去离子水调吸光度零点，读取各管吸光度值。，去离子水调吸光度零点，读取各管吸光度值。测定管测定管测定管测定管2 2：在试管里留取一份唾液（口水），首先稀释在试管里留取一份唾液（口水），首先稀释100-500倍。倍。操作步骤操作步骤 10计算计算 其中：其中：（空白管（空白管A A测测定管定管A A）/ /空白管空白管A A 底物消耗比率底物消耗比率0.4/5 0.4/5 （1ml1ml缓缓冲淀粉溶液中淀粉含量冲淀粉溶液中淀粉含量0.4mg0.4mg）相当于多少个活性相当于多少个活性单单位位15/7.5 15/7.5 反反应时间应时间折算折算100/0.02 100/0.02 血清用量折算血清用量折算单位定义：单位定义：100ml100ml血清中的淀粉酶，在血清中的淀粉酶，在373715min15min水解水解5mg5mg淀淀粉为粉为1 1个单位。个单位。11 血清血清AMY:AMY: 血清 80180U； 尿液 1001200U。参考范围参考范围 12 临床上主要用于急性胰腺炎的诊断（胰腺组织病临床上主要用于急性胰腺炎的诊断（胰腺组织病临床上主要用于急性胰腺炎的诊断（胰腺组织病临床上主要用于急性胰腺炎的诊断（胰腺组织病变损伤），发病后血清中变损伤），发病后血清中变损伤），发病后血清中变损伤），发病后血清中AMYAMYAMYAMY首先增高，首先增高，首先增高，首先增高，1212121224242424小时到达峰值，小时到达峰值，小时到达峰值，小时到达峰值，2 2 2 25 5 5 5天下降至正常。天下降至正常。天下降至正常。天下降至正常。 发病后尿液发病后尿液发病后尿液发病后尿液AMYAMYAMYAMY升高比血清晚，从升高比血清晚，从升高比血清晚，从升高比血清晚，从1212121224242424小时开小时开小时开小时开始升高，下降也比血清缓慢。始升高，下降也比血清缓慢。始升高，下降也比血清缓慢。始升高，下降也比血清缓慢。 在在在在发病发病发病发病12121212小时小时小时小时内，测定血清内，测定血清内，测定血清内，测定血清AMYAMYAMYAMY，后期测定尿，后期测定尿，后期测定尿，后期测定尿AMYAMYAMYAMY更有价值。更有价值。更有价值。更有价值。 流行性腮腺炎流行性腮腺炎流行性腮腺炎流行性腮腺炎AMYAMYAMYAMY也会大量升高。也会大量升高。也会大量升高。也会大量升高。临床意义临床意义 131 1 1 1、AMYAMYAMYAMY活性在活性在活性在活性在400U400U400U400U以下时，与底物的水解成良好的线性。如以下时，与底物的水解成良好的线性。如以下时，与底物的水解成良好的线性。如以下时，与底物的水解成良好的线性。如果结果超过果结果超过果结果超过果结果超过400U400U400U400U，或，或，或，或测定管吸光度小于空白管吸光度一半测定管吸光度小于空白管吸光度一半测定管吸光度小于空白管吸光度一半测定管吸光度小于空白管吸光度一半时时时时，应加大标本稀释倍数或减少稀释血清加入量，结果乘，应加大标本稀释倍数或减少稀释血清加入量，结果乘，应加大标本稀释倍数或减少稀释血清加入量，结果乘，应加大标本稀释倍数或减少稀释血清加入量，结果乘上稀释倍数上稀释倍数上稀释倍数上稀释倍数。注意事项注意事项142 2、使用血清标本，、使用血清标本，或以肝素抗凝或以肝素抗凝。草酸盐、枸橼酸。草酸盐、枸橼酸盐、盐、EDTA2NaEDTA2Na、氟化钠抗凝剂对、氟化钠抗凝剂对AMYAMY活性有抑制活性有抑制作用。作用。3 3、防止唾液污染。、防止唾液污染。4 4、本方法可以用于其它体液的、本方法可以用于其它体液的AMYAMY测定，如胸水和测定，如胸水和腹水，尿液腹水，尿液AMYAMY测定应做测定应做2020倍稀释。倍稀释。 方法线性：方法线性：方法线性：方法线性：400U400U400U400U； 精密度：批内精密度：批内精密度：批内精密度：批内CV 3CV 3CV 3CV 39 9 9 9，批间，批间，批间，批间1212121215151515；（精密度较差）；（精密度较差）；（精密度较差）；（精密度较差）与对硝基麦芽庚糖苷法（与对硝基麦芽庚糖苷法（与对硝基麦芽庚糖苷法（与对硝基麦芽庚糖苷法（4NP-G74NP-G74NP-G74NP-G7）比较：低值相关较好，高值相）比较：低值相关较好，高值相）比较：低值相关较好，高值相）比较：低值相关较好，高值相关性较差；关性较差；关性较差；关性较差；但是该方法操作简单，试剂价廉，不需要特殊仪器，不具备自动但是该方法操作简单，试剂价廉，不需要特殊仪器，不具备自动但是该方法操作简单，试剂价廉，不需要特殊仪器，不具备自动但是该方法操作简单，试剂价廉，不需要特殊仪器，不具备自动化分析仪的地方仍有较广泛的应用。化分析仪的地方仍有较广泛的应用。化分析仪的地方仍有较广泛的应用。化分析仪的地方仍有较广泛的应用。评价评价