第第三三章章液相色谱分析液相色谱分析一、一、液相色谱固定相液相色谱固定相stationary phase of HPLC二、液相色谱流动相二、液相色谱流动相 mobile phase of HPLC第三节第三节第三节第三节液相色谱的固定相与液相色谱的固定相与液相色谱的固定相与液相色谱的固定相与流动相流动相流动相流动相high performance liquid high performance liquid chromatographchromatographstationary phase and stationary phase and mobile phase of HPLCmobile phase of HPLC2024/8/112024/8/11液相色谱的固定液相色谱的固定相与流动相相与流动相一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相 stationary phases of LC 1. 1. 1. 1. 液液液液- - - -液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相 （1 1）全多孔型担体）全多孔型担体）全多孔型担体）全多孔型担体 由由氧氧化化硅硅、氧氧化化铝铝、硅硅藻藻土土等等制制成成的的多多孔孔球球体体；早早期期采采用用100100 mm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用现采用1010 mm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； （2 2）表面多孔型担体）表面多孔型担体）表面多孔型担体）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体） 30304040 mm的的玻玻璃璃微微球球，表表面面附附着着一一层层厚厚度度为为1 1 2 2 mm的多孔硅胶。的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；表面积小，柱容量底；2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相（3）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相化学键合固定相: : 目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相； a. a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型： SiSiOOC C b. b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型： SiSiOOSi Si C C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. c. 硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型： SiSiC C d. d. 硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型： SiSiN N2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1 1）传质快传质快传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2 2）寿命长寿命长寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定稳定； （4 4）选择性好选择性好选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；可键合不同官能团，提高选择性；（5 5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱； 存在着存在着存在着存在着双重分离机制双重分离机制双重分离机制双重分离机制：( (键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理) )高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主； 2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相 2. 2.液液- -固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：粒度：粒度：粒度：5 510 10 mm； 2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相3.3.离子交换色谱离子交换色谱分离固定相分离固定相 结构类别：结构类别：结构类别：结构类别：（1 1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄薄壳壳玻玻璃璃珠珠为为担担体体，表表面涂约面涂约1%1%的离子交换树脂；的离子交换树脂；（2 2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄薄壳壳键键合合型型；微微粒粒硅硅胶胶键合型（键合离子交换基团）键合型（键合离子交换基团） 树脂类别：树脂类别：树脂类别：树脂类别：（1 1） 阳阳阳阳离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂（强强强强酸酸酸酸性、弱酸性）性、弱酸性）性、弱酸性）性、弱酸性）（2 2） 阴阴阴阴离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂（强强强强碱碱碱碱性、弱碱性）性、弱碱性）性、弱碱性）性、弱碱性）2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相 4. 4. 空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1 1）软质凝胶）软质凝胶）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。水为流动相。适用于常压排阻分离。（2 2）半硬质凝胶）半硬质凝胶）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯苯乙烯- -二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3 3）硬质凝胶）硬质凝胶）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；多孔硅胶、多孔玻珠等； 化化学学稳稳定定性性、热热稳稳定定性性好好、机机械械强强度度大大，流流动动相相性性质质影影响响小，可在较高流速下使用。小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC 1. 1. 流动相特性流动相特性 （1 1）液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：淋淋洗洗液液，洗洗脱脱剂剂。流流动动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2 2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为为正正相相液液液液色色谱谱法法，极极性性柱柱也也称称正正相柱。相柱。 （3 3）若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型型分分离离柱柱上上的出峰顺序相反。的出峰顺序相反。 2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相2. 2. 流动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；：单组分和多组分； 按极性分按极性分按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分按使用方式分按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常常常常用用用用溶溶溶溶剂剂剂剂： 己己烷烷、四四氯氯化化碳碳、甲甲苯苯、乙乙酸酸乙乙酯酯、乙乙醇醇、乙腈、水。乙腈、水。 采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相3. 3. 流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液采用正相液- -液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序： 水水( (最大最大) ) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油( (最小最小) )2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相4. 4. 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1 1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2 2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。相等。（3 3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4 4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相请选择内容请选择内容第一节第一节第一节第一节 高效液相色谱的特点与仪器高效液相色谱的特点与仪器高效液相色谱的特点与仪器高效液相色谱的特点与仪器feature and instrument of HPLCfeature and instrument of HPLC第二节第二节第二节第二节 基本原理与主要分离类型基本原理与主要分离类型基本原理与主要分离类型基本原理与主要分离类型basic principle and main separating typesbasic principle and main separating types第三节第三节第三节第三节 固定相与流动相固定相与流动相固定相与流动相固定相与流动相stationary phase and mobile phase stationary phase and mobile phase 第四节第四节第四节第四节 影响分离的因素与操作条件选择影响分离的因素与操作条件选择影响分离的因素与操作条件选择影响分离的因素与操作条件选择factors influenced separation and choice of operation conditionfactors influenced separation and choice of operation condition第五节第五节第五节第五节 离子色谱法离子色谱法离子色谱法离子色谱法ion chromatographion chromatograph第六节第六节第六节第六节 超临界流体色谱超临界流体色谱超临界流体色谱超临界流体色谱supercritical fluid chromatographsupercritical fluid chromatograph结束结束结束结束2024/8/112024/8/11液相色谱液相色谱的固定相的固定相与流动相与流动相