实验一实验一 蛋白质的定量测蛋白质的定量测定定Folin-酚试剂法酚试剂法(Lowry法法)蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质及氨基酸的呈色反应n（一）双缩脲反应（一）双缩脲反应n是由两分子尿素缩合成一种化合物的反是由两分子尿素缩合成一种化合物的反应。应。2尿素尿素双缩脲双缩脲+氨氨180度度 双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的杂的紫红色络合物紫红色络合物，这一呈色反应称为双缩脲，这一呈色反应称为双缩脲反应。反应。n蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成成紫红色或蓝紫色络合物紫红色或蓝紫色络合物。通常可用此。通常可用此法来定性鉴定蛋白质的存在，也可根据法来定性鉴定蛋白质的存在，也可根据反应生成颜色的深浅，在反应生成颜色的深浅，在540nm波长处波长处进行比色，定量测定蛋白质的浓度。进行比色，定量测定蛋白质的浓度。允许测定范围为0.2-1.7mg蛋白质/ml。n（二）蛋白质的黄色反应（二）蛋白质的黄色反应n芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质所特有的呈色反应。n蛋白质遇硝酸后，产生白色沉淀，加热蛋白质遇硝酸后，产生白色沉淀，加热后沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深呈后沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深呈橙黄色。橙黄色。n（三）酚试剂反应（三）酚试剂反应n蛋白质分子一般都有酪氨酸，而酪氨酸蛋白质分子一般都有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。的混合物）。n（四）乙醛酸反应（四）乙醛酸反应n在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基结构的化合出现紫色环，凡含有吲哚基结构的化合物都有这一反应。物都有这一反应。n（五）坂口反应（五）坂口反应n精氨酸分子中所含量胍基能与次溴酸钠精氨酸分子中所含量胍基能与次溴酸钠（或次氯酸钠）及（或次氯酸钠）及-萘酚在碱性溶液中萘酚在碱性溶液中形成红色产物。形成红色产物。n（六）米伦反应（六）米伦反应（illon）n米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸的混合液。蛋白质溶液中加入米亚硝酸的混合液。蛋白质溶液中加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变为红色。酚类化合物有此反应。变为红色。酚类化合物有此反应。常用的蛋白质定量测定的方法n凯氏定氮法凯氏定氮法n双缩脲法双缩脲法nFolin-酚法酚法n紫外（紫外（UV）分光光度法）分光光度法n考马斯亮兰染色法考马斯亮兰染色法一、实验目的一、实验目的 1.学习学习Folin-酚试剂法测定蛋白质酚试剂法测定蛋白质含量的原理。含量的原理。 2.掌握掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。含量的方法和操作。二、实验原理二、实验原理n Folin酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。n进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：长：若蛋白质含量高时（若蛋白质含量高时（25-100g）在）在500nm波长波长处进行测定，含量低时处进行测定，含量低时(5-25g)在在755nm波长处进行波长处进行测定。测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。白质的含量。n此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏灵敏度高，较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法倍，较双缩脲法灵敏灵敏100倍，反应约在倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。以稳定几个小时。n缺点是此反应受多种因素干扰。缺点是此反应受多种因素干扰。在测定时应排除干扰因素或做空在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。白试验消除。此法是在此法是在Folin酚法的基础上引入双缩脲试剂，因酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin酚反应。此外，所测的蛋白酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约度较低的尿素（约0.5%左右），胍（左右），胍（0.5%左右），硫酸钠左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（），硝酸钠（1%），三氯乙酸（），三氯乙酸（0.5%），乙醇（），乙醇（5%），），乙醚（乙醚（5%），丙酮（），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠则需增加碳酸钠氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠也需提高碳酸钠氢氧化钠浓度氢氧化钠浓度12倍，这样即可纠正显色后色倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。浅的弊病。 n三、实验材料三、实验材料n（一）实验器材（一）实验器材n100毫升容量瓶毫升容量瓶 2只；移液管只；移液管 1毫升毫升4支，支，5毫升毫升2支；支；722型分光光度计。型分光光度计。n（二）实验试剂（二）实验试剂n试剂甲：试剂甲：n1) 4%碳酸钠溶液碳酸钠溶液n2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液n3) 1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液n4) 2%酒石酸钾钠溶液。酒石酸钾钠溶液。n临用前将（临用前将（1）与（）与（2）等体积配制碳酸钠）等体积配制碳酸钠氢氢氧化钠溶液。（氧化钠溶液。（3）与（）与（4）等体积配制成硫酸）等体积配制成硫酸铜铜酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成的比例配合，即成Folin酚试剂甲。此试剂临酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。用前配制，一天内有效。n试剂乙：试剂乙：n称钨酸钠（称钨酸钠（Na2WO22H2O）100g，钼酸钠，钼酸钠（Na2MoO42H2O）25g置置2000ml磨口回流装置内，磨口回流装置内，加蒸馏水加蒸馏水700ml，85%磷酸磷酸50ml和浓硫酸和浓硫酸100ml。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至，以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml，过滤即成，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，此液应为酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。n试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红液颜色由红紫红紫红紫灰紫灰墨绿时即为滴定终点。该试墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。酸度应用。n（二）标准和待测蛋白质溶液（二）标准和待测蛋白质溶液n1. 标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液n结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成配制成150ug/ml蛋白溶液蛋白溶液n2. 待测蛋白质溶液待测蛋白质溶液n人血清，使用前稀释人血清，使用前稀释100倍。倍。四、实验操作四、实验操作1. 绘制标准曲线:取7支试管，按下表分别加入各试剂试剂 管 号0123456标准蛋白质溶液(ml) 00.10.20.30.40.50.6蒸馏水(ml) 1.00.90.80.70.60.50.4Fo1in-酚试剂甲(ml) 5555555摇匀，室温下放置10分钟Fo1in-酚试剂乙(ml) 0.50.50.50.50.50.50.5迅速摇匀，30（或室温2025）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在500nm处比色 A500n各管加入各管加入Fo1in-酚试剂乙后，立即摇匀，酚试剂乙后，立即摇匀，放置放置30分钟后比色，在分钟后比色，在500nm处记下各处记下各管光密度，以管光密度，以0号管为对照，以光密度为号管为对照，以光密度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。绘制标准曲线。n2. 测定未知样品：测定未知样品： 取取2支试管，分别准确吸取支试管，分别准确吸取1毫升样毫升样品溶液，各加品溶液，各加5毫升毫升Fo1in-酚试剂甲，酚试剂甲，摇匀，室温放置摇匀，室温放置10分钟后，再各加分钟后，再各加1毫毫升升Fo1in-酚试剂乙，立即摇匀，放置酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在分钟，在500nm处测定光密度值。处测定光密度值。2.2.未知未知样品蛋白品蛋白质浓度度测定定取取4支支试管，分管，分2组，按下表平行操作：，按下表平行操作：试管编号试剂处理空白管2样品管2血清稀释液/ml00.2蒸馏水/ml1.00.8Folin酚甲试剂/ml5.05.0摇匀，于2025放置10minFolin酚乙试剂/ml0.50.5迅速摇匀，30（或室温2025）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm处比色A500五、注意事项五、注意事项(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白 质作用生成碱性的铜蛋白质溶液。当Folin酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前。(2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。【思考题思考题】n1.Folin-酚法进行蛋白定量测定的优缺点。酚法进行蛋白定量测定的优缺点。n2.常用的蛋白质含量测定方法在哪些？常用的蛋白质含量测定方法在哪些？