http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry实验八：实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳贾跃腾贾跃腾 罗世翔罗世翔http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry实验八：实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳贾跃腾贾跃腾 罗世翔罗世翔http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry一、一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项实验操作及注意事项 （P138P138） http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry实验分组（每人做一管，每组配一份胶）实验分组（每人做一管，每组配一份胶）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）封管封管分离胶配制与灌胶（浓度为分离胶配制与灌胶（浓度为6%6%，化学聚合，化学聚合，A1C2H2G5A1C2H2G5，每组总，每组总体积为体积为10ml10ml，灌胶高度为，灌胶高度为7-8cm7-8cm）封正丁醇封正丁醇3mm3mm（手法、高度、（手法、高度、15min15min左右出现折光线时可进行左右出现折光线时可进行下一步操作）下一步操作）1.1分离胶的配制分离胶的配制http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry注意事项：注意事项：1 1、封管要严，防止漏液。、封管要严，防止漏液。2 2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。3 3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。4 4、配胶后立即灌胶、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清洗用滴管灌胶，用后立即清洗用滴管灌胶，用后立即清洗用滴管灌胶，用后立即清洗）5 5、正丁醇沿管壁缓缓加入、正丁醇沿管壁缓缓加入http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry浓缩胶配制（浓度为浓缩胶配制（浓度为浓缩胶配制（浓度为浓缩胶配制（浓度为3%3%3%3%，光聚合，光聚合，光聚合，光聚合，B1D2E1F4B1D2E1F4B1D2E1F4B1D2E1F4，每组总，每组总，每组总，每组总体积为体积为体积为体积为8ml8ml8ml8ml） 倒掉正丁醇倒掉正丁醇倒掉正丁醇倒掉正丁醇灌浓缩胶（灌胶高度为灌浓缩胶（灌胶高度为灌浓缩胶（灌胶高度为灌浓缩胶（灌胶高度为1.5cm,1.5cm,1.5cm,1.5cm,上面留上面留上面留上面留1cm1cm1cm1cm空隙加样）空隙加样）空隙加样）空隙加样） 封正丁醇封正丁醇封正丁醇封正丁醇3mm3mm3mm3mm（观察界面，（观察界面，（观察界面，（观察界面，10101010分钟左右出现折光线时可分钟左右出现折光线时可分钟左右出现折光线时可分钟左右出现折光线时可倒去正丁醇）倒去正丁醇）倒去正丁醇）倒去正丁醇） 1.2浓缩胶的配制浓缩胶的配制http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry注意事项：注意事项：1 1、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩胶。、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩胶。2 2、配胶后立即灌胶（、配胶后立即灌胶（用滴管用滴管）3 3、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固于管中。、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固于管中。4 4、撕掉封口膜撕掉封口膜，用胶塞将玻璃管固定于电泳槽上，用胶塞将玻璃管固定于电泳槽上（竖直，防漏竖直，防漏）5 5、加电极缓冲液（、加电极缓冲液（注意液面注意液面）http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）不漏水、除气泡）不漏水、除气泡）不漏水、除气泡）加加加加bufferbufferbufferbuffer（没过上下管口）（没过上下管口）（没过上下管口）（没过上下管口） 样品处理并加样（样品处理并加样（样品处理并加样（样品处理并加样（20ul20ul20ul20ul） 电泳（电泳（电泳（电泳（6mA/6mA/6mA/6mA/管，距底管，距底管，距底管，距底1cm1cm1cm1cm时停止）时停止）时停止）时停止）剥胶剥胶剥胶剥胶 固定（时间固定（时间固定（时间固定（时间5min5min5min5min）染色（时间染色（时间染色（时间染色（时间2min2min2min2min）漂洗脱色至背景透亮漂洗脱色至背景透亮漂洗脱色至背景透亮漂洗脱色至背景透亮1.3安装、加样、电泳安装、加样、电泳http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistryhttp:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry 二、电泳基本原理及相关知识二、电泳基本原理及相关知识 http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry2.1电泳的概念电泳的概念 带电粒子带电粒子带电粒子带电粒子（胶体颗粒、离子等）在（胶体颗粒、离子等）在（胶体颗粒、离子等）在（胶体颗粒、离子等）在电场电场电场电场的作用下在的作用下在的作用下在的作用下在特定的特定的特定的特定的介质介质介质介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。象。象。象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定广泛应用于生物大分子的分离和鉴定广泛应用于生物大分子的分离和鉴定广泛应用于生物大分子的分离和鉴定. . . .http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry2.2电泳的基本原理电泳的基本原理利用物质的两个差异来分离物质利用物质的两个差异来分离物质利用物质的两个差异来分离物质利用物质的两个差异来分离物质1.1.1.1.电荷差异电荷差异电荷差异电荷差异 (1)(1)(1)(1)电荷性质电荷性质电荷性质电荷性质 (2)(2)(2)(2)电荷数量电荷数量电荷数量电荷数量2.2.2.2.分子差异分子差异分子差异分子差异 (1)(1)(1)(1)分子大小分子大小分子大小分子大小 (2)(2)(2)(2)分子形状分子形状分子形状分子形状http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry2.3电泳分离蛋白质的原理电泳分离蛋白质的原理1.1.1.1.蛋白质两性解离与等电点蛋白质两性解离与等电点蛋白质两性解离与等电点蛋白质两性解离与等电点 若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同，若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同，若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同，若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同，此时溶液的此时溶液的此时溶液的此时溶液的 pH pH pH pH 值称为该蛋白质的等电点（值称为该蛋白质的等电点（值称为该蛋白质的等电点（值称为该蛋白质的等电点（PIPIPIPI）。）。）。）。2.2.2.2. 溶液溶液溶液溶液pHpHpHpH与蛋白质等电点决定与蛋白质等电点决定与蛋白质等电点决定与蛋白质等电点决定蛋白质电荷性质与数量蛋白质电荷性质与数量蛋白质电荷性质与数量蛋白质电荷性质与数量3.3.3.3. 不同不同不同不同蛋白质分子大小和分子形状的差异蛋白质分子大小和分子形状的差异蛋白质分子大小和分子形状的差异蛋白质分子大小和分子形状的差异 http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry2.4实验室中常用到的电泳方法实验室中常用到的电泳方法（以介质分类）（以介质分类）1. 1. 1. 1. 纸电泳：纸电泳：纸电泳：纸电泳：是最早使用的一种电泳技术，滤纸为支持物是最早使用的一种电泳技术，滤纸为支持物是最早使用的一种电泳技术，滤纸为支持物是最早使用的一种电泳技术，滤纸为支持物 2. 2. 2. 2. 醋酸纤维膜电泳：醋酸纤维膜电泳：醋酸纤维膜电泳：醋酸纤维膜电泳：醋酸纤维膜为其支持物醋酸纤维膜为其支持物醋酸纤维膜为其支持物醋酸纤维膜为其支持物3. 3. 3. 3. 凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳（1 1 1 1）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（2 2 2 2）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry3.1聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis(polyacrylamide gel electrophoresis，简称简称PAGE)PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。 1 1、聚丙烯酰胺凝胶由、聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺和和甲基双丙烯酰胺甲基双丙烯酰胺聚合而形成聚合而形成的三维网状结构，聚合过程由自由基催化完成。的三维网状结构，聚合过程由自由基催化完成。 2 2、催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。、催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。 (1)(1)在化学聚合过程中，以在化学聚合过程中，以过硫酸铵（过硫酸铵（APAP）为催化剂，以为催化剂，以四甲基乙四甲基乙二胺（二胺（TEMEDTEMED）为加速剂为加速剂, TEMED, TEMED催化催化APAP产生自由基；产生自由基； (2)(2)在光聚合过程中，以在光聚合过程中，以核黄素核黄素为催化剂，光催化核黄素产生自由为催化剂，光催化核黄素产生自由基。自由基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲基双丙烯酰胺与丙烯酰基。自由基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲基键交联，从而形成三维网状结构。胺链间产生甲基键交联，从而形成三维网状结构。http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry3.2聚丙烯酰胺凝胶的特性聚丙烯酰胺凝胶的特性(1)(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；不溶；(3)(3)对对pHpH和温度变化较稳定；和温度变化较稳定；(4)(4)几乎无吸附和电渗作用，只要几乎无吸附和电渗作用，只要AcrAcr纯度高，操作条件一致，纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；则样品分离重复性好；(5)(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达1010-6-6g g(6)(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。等有更高的分辨率。http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类1. 1. 根据其有无浓缩效应，分为：根据其有无浓缩效应，分为：（1 1）连连续续系系统统连连续续系系统统电电泳泳体体系系中中缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度相相同同，带带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应 （2 2）不不连连续续系系统统不不连连续续系系统统中中由由于于缓缓冲冲液液离离子子成成分分，pHpH，凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性，带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应，分分子子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 2. 2. 根据蛋白质样品变性与否，分为：根据蛋白质样品变性与否，分为：（1 1）变性电泳）变性电泳也就是也就是SDS-PAGESDS-PAGE，蛋白质失去二三级结构；，蛋白质失去二三级结构；（2 2）非非变变性性电电泳泳 蛋蛋白白质质能能够够保保持持完完整整状状态态，并并依依据据蛋蛋白白质质的的分分子子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。3.3.根据电泳槽体系的类型，分为：根据电泳槽体系的类型，分为： （1 1）圆盘电泳）圆盘电泳（2 2）板状电泳）板状电泳两者电泳原理完全相同。两者电泳原理完全相同。 http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistryhttp:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistryhttp:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistryhttp:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistryhttp:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistryhttp:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry四、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳四、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry SDS-PAGE SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由最初由shapiroshapiro于于19671967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素），其原理在于：子量的大小（可以忽略电荷因素），其原理在于：1.1.去电荷：去电荷：由于由于SDSSDS（十二烷基硫酸钠）产生的十二烷基硫酸根带负电，（十二烷基硫酸钠）产生的十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质使各种蛋白质-SDS-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别；因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别； 2.2.破坏结构：破坏结构：SDSSDS能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中白分子的二、三级结构。如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带；可能会形成分别对应于各个亚基的几条带；3.3.统一构象：统一构象：SDSSDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS-SDS复合复合物形成近似物形成近似“雪茄烟雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDSSDS复合物的短轴长复合物的短轴长度都一样，约为度都一样，约为18A18A； 这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小。SDS-PAGESDS-PAGE的原理的原理http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry4.1 4.1 不连续不连续PAGEPAGE的原理的原理三个不连续三个不连续三个不连续三个不连续 三个效应三个效应三个效应三个效应 凝胶孔径不同凝胶孔径不同凝胶孔径不同凝胶孔径不同缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液pHpHpHpH不同不同不同不同缓冲液离子成分不同缓冲液离子成分不同缓冲液离子成分不同缓冲液离子成分不同浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry4.2不连续体系的组份不连续体系的组份 不连续体系由浓缩胶、分离胶及电极缓冲液所组成。不连续体系由浓缩胶、分离胶及电极缓冲液所组成。1. 1. 浓缩胶是由核黄素催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为浓缩胶是由核黄素催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7pH6.7的的Tris-HC1Tris-HC1。2. 2. 分离胶是由分离胶是由APAP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 pH8.9 Tris-HC1Tris-HC1。3. 3. 电极缓冲液是电极缓冲液是pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。甘氨酸缓冲液。 2 2种孔径的凝胶、种孔径的凝胶、2 2种缓冲体系、种缓冲体系、3 3种种pHpH值使不连续体系形成值使不连续体系形成了凝胶孔径、了凝胶孔径、pHpH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。缩的主要因素。http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry4.3样品浓缩效应样品浓缩效应1.1.凝胶孔径不连续性；凝胶孔径不连续性；2.2.缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH值的不连续性；值的不连续性；v在在pH6.7pH6.7的凝胶缓冲体系中的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：前导离子或快离子：HC1HC1解离出的氯根解离出的氯根(C1(C1- -) ) 尾随离子尾随离子(trailing ion)(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根或慢离子：甘氨酸根 m mclcl clclmmp p p p m mG G G G(Cl(Cl代代表表氯氯根根，P P代代表表蛋蛋白白质质，G G代代表表甘甘氨氨酸根酸根) )有效迁移率有效迁移率= =m m ，m m为迁移率，为迁移率， 为解离度为解离度) )v当当进进入入pH8.9pH8.9的的分分离离胶胶时时，甘甘氨氨酸酸解解离离度度增增加加，其其有有效效迁迁移移率率超过蛋白质；超过蛋白质；3.3.电位梯度的不连续性。电位梯度的不连续性。http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistryGly-Pro-Cl-Gly-Pro-Cl-Cl-Cl-Cl-Pro-Pro-Pro-Gly-Gly-Gly-pHpHpHpH为为为为8.38.38.38.3的电泳缓冲液的电泳缓冲液的电泳缓冲液的电泳缓冲液（Tris-GlyTris-GlyTris-GlyTris-Gly）pHpHpHpH为为为为6.76.76.76.7的浓缩胶的浓缩胶的浓缩胶的浓缩胶pHpHpHpH为为为为8.98.98.98.9的分离胶的分离胶的分离胶的分离胶有效泳动率：有效泳动率：有效泳动率：有效泳动率：M M M MClClClCl- - - - M M M M ProProProPro- - - - M M M M GlyGlyGlyGly- - - -6%6%胶胶胶胶3%3%胶胶胶胶有效泳动率：有效泳动率：有效泳动率：有效泳动率：M M M MClClClCl- - - - M M M M GlyGlyGlyGly- - - - M M M M ProProProPro- - - - http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry五、实验结果的分析五、实验结果的分析 http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry5.1 5.1 相关理论相关理论表表表表-1 -1 -1 -1 血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性种种种种 类类类类分子量分子量分子量分子量( (万）万）万）万）PIPI分分分分布布布布(%)(%)清蛋白清蛋白清蛋白清蛋白 1-1-球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 2-2-球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 - -球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 - -球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白6.96.95.05.09.09.013.013.011.011.06.16.17.37.36.86.87.67.68.08.055552.130.82.130.84.172.54.172.51.2251.22515.615.6http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry 前清蛋白前清蛋白前清蛋白前清蛋白 清蛋白清蛋白清蛋白清蛋白 2-2-球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 1-1-球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 - -球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 - -球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白5.2 5.2 结果示意图结果示意图http:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistryhttp:/basicmed.sysu.edu.cn/department/biochemistry