技术报告No. 26 (2008 修订版)Celebrating over 65 Yearsof Connecting People, Science and RegulationSM除菌过滤器的验证除菌过滤器的验证 细菌的截留细菌的截留第第6.0部分部分液体的除菌过滤液体的除菌过滤第 6.0部分 除菌过滤器的验证 / 细菌的截留n6.1影响微生物截留的因素n6.2细菌截留验证研究需要考虑的方面n6.3挑战细菌的选择n6.4培养的保持n6.5培养条件和标准n6.6有效挑战浓度n6.7挑战水平n6.8聚集n6.9培养物的生存能力n6.10 挑战试验方法n6.11 试验用微生物的生存能力n6.12 试验步骤和方案n6.13 非杀菌过程和液体n6.14 替代液体n6.15 杀菌液体n6.16 过滤介质vs.装置n6.17 压力/流量n6.18 持续时间n6.19 下游取样n6.20 试验用膜的选择n6.21 结果的解释n6.22 产品的生物负荷n6.23 过滤器构造的改变目 录除菌级性能的基本解释n除菌过滤是在对产品没有不良影响的前提下从流动的液体中去除微生物的过程。nASTMF 838-05 是一种标准的内置TM，可以用于比较所有灭菌级的膜。n证明能去除一种标准试验细菌(Brevundimonas diminuta) n最低浓度为107 cfu/cm2 n这是一个很好的开始，但是还要考虑其他因素重要参考 ASTM F 838-05ASTM 标准 F838-05, “决定液体过滤器过滤膜细菌截留性能的标准测试方法”, 宾州Conshohocken美国测试和材料协会 ASTM 委员会 D19(2005) www.astm.org 除菌级表现的基本定义n2008 版 TR 26 进一步描述了过滤器验证需要考虑的方面除菌过滤器验证要考虑的两个重要因素: q通过适当的标准试验或同等的方法进行细菌挑战实验来决定过滤器膜的级别。q由过滤器的使用者或指定的测试机构（例如：过滤器生产商或契约实验室）n使用一种代表性的挑战微生物证明能完全去除一种产品或一组产品上的细菌。n在进行验证试验前，具有每组产品是按照适当监管机构的规定生产和检验的科学依据。挑战微生物的选择n以前一直推荐用 Pseudomonas diminuta 作为验证0.22 m 除菌级过滤器的细菌之选。nPseudomonas diminuta 最近基于DNA的相同性被重新划分为Brevundimonas diminutanFDA并没有统一推荐某种细菌用于细菌截留试验q细菌大小应能通过 0.45 m 过滤器q其他符合要求的细菌也能被接受时间时间影响细菌截留的因素微生物微生物大小大小形状形状产品产品 pH渗透压渗透压离子强度离子强度表面活性剂表面活性剂膜膜孔径分布孔径分布 表面化学成分表面化学成分微孔结构微孔结构 P流量流量温度温度Section 6/6.1产品产品细菌截留验证需要考虑的方面n对过滤过程进行详尽的评估，包括：q溶剂的性质 (如：水的，酸性的，碱性的, 有机的)q过滤时间q过程压力q过程流量q过程温度q过滤器设计说明 q签约细菌截留试验，三大厂家会给一个POP文件qSatorious的所有试验都在德国，millipore的析出物试验在美国。Section 6.2细菌截留验证需要考虑的方面n产品细菌截留验证研究应该包括多个过滤膜 (通常三个) 。最接近泡点的过滤膜做这个试验。市场流通的过滤器基本泡点都会比较高 n 在产品可能对膜造成伤害的情况下，膜的确切数量和测试设计取决于过程。Section 6.2细菌截留验证需要考虑的方面n用于细菌截留验证试验的三个膜中至少有一个膜应该在试验前或使用前物理完整性测试数值达到或接近过滤器生产商的测试要求。n 可能无法获得达到或接近过滤器生产商要求的膜q 在这种情况下，应该从一批使用前完整性测试数值尽量低的膜产品中选取测试膜。q然后根据（验证研究中）使用前物理完整性测试数值最接近生产商要求的膜来确定一个特定过滤过程的完整性测试要求Section 6.2细菌截留验证需要考虑的方面n测试报告中应该包括细菌截留验证研究中得测试报告中应该包括细菌截留验证研究中得到的膜物理完整性测试值。到的膜物理完整性测试值。n应在挑战测试前使用水、产品或其他有说明应在挑战测试前使用水、产品或其他有说明的液体来确定物理完整性的液体来确定物理完整性Section 6.2细菌截留验证需要考虑的方面n应该在产品细菌挑战后调查测试微生物是否在过滤器的下游重现。n如果调查确认测试微生物穿过了过滤器，并且过滤器达到了完整性测试要求q那么应重新考虑该过滤器是否适合于这样的过程条件。Section 6.2细菌截留验证需要考虑的方面n成分相同、只有浓度不同的系列产品可以通过挑战极限浓度和接受中间一组浓度来验证。n如果某个单个产品被认为是最差情况代表，则应伴有依据和数据。Section 6.2细菌截留验证需要考虑的方面n一般来说重复使用过滤器是不实际的，或者说不建议用于制药生产n但是如果重复使用除菌级过滤器q应该给出理由，并且重复使用参数应该经过验证。测试设计的两种方法n1. 直接接种法n2. 修改法q有时被称为:n间接法n两步法n再循环法1. 直接注入细菌法直接接种测试直接接种测试药品药品可存活可存活微生物微生物?B. Diminuta / 挑战微生物挑战微生物测试过滤器测试过滤器泵泵化验滤出液化验滤出液的微生物的微生物2. 间接法药品药品可存活可存活微生物微生物?化验滤出液化验滤出液的微生物的微生物否否改变改变产品产品/过程过程预处理过滤器预处理过滤器B. Diminuta / 挑战微生物挑战微生物泵泵测试过滤器测试过滤器抗生素抗生素防腐剂防腐剂温度温度pH12预处理n时间n温度n化学性质n压力n流量使过滤器暴露于实际的产品和过程条件中使过滤器暴露于实际的产品和过程条件中抑制配方抑制配方预处理注入物预处理注入物12冲洗缓冲器冲洗缓冲器:去除过滤器的毒杀活动去除过滤器的毒杀活动维持全部维持全部过程条件过程条件验证此步骤验证此步骤确保细菌活性确保细菌活性修改产品、过程的两个例子8 小时过程时间杀菌产品预处理预处理8 小时小时修改过的产品修改过的产品8小时小时预处理预处理截留测试截留测试预处理预处理4小时小时实际的产品实际的产品4小时小时冲洗冲洗细菌截留研究的一般图示接种后产品储存罐接种后产品储存罐无菌无菌储存罐储存罐测试过滤器装置测试过滤器装置细菌截留细菌截留 一般测试结构一般测试结构 压力计蠕动泵蠕动泵化验化验过滤器支架过滤器支架()()()()(细菌截留研究的一般图示 接种挑战溶液的再循环接种挑战溶液的再循环研究设计决策树Validation Strategy Study DesignValidation Strategy Study DesignIdeal Method / ApproachValidation Strategy Study DesignAlternative ApproachValidation Strategy Study Design挑战微生物的选择 - 1.n推荐选择Brevundimonas diminuta 作为用于除菌级过滤器验证的微生物。n但是:q请明白FDA或其他法规机构并没有推荐某一种微生物作为用于验证的唯一微生物。q微生物的尺寸应小到能通过 0.45 m 的过滤器q其他符合要求的微生物也可以接受。q必须建立挑战细菌符合要求的模型q必须清楚过程中的生物负荷对所选择细菌的影响挑战微生物的选择 - 2.n推荐选择Brevundimonas diminuta 作为用于除菌级过滤器验证的微生物。n目前应用的培养方法有两种:q肉汤法 (Leahy and Sullivan, 1978)q冻膏法 (Fennington Jr. and Howard Jr., 1997)q两者都符合现行工业标准有效挑战浓度n过滤后应该q过滤器测试膜每平方厘米表面达到至少107 个微生物q均匀分布于膜的表面是最理想的n挑战浓度 (cfu/mL) 和挑战水平 (cfu/cm2).是不同的，不可混淆有效的挑战水平n最低挑战水平应为每平方厘米膜表面至少 107 cfu B. diminuta (或生物负荷)n基于Bowman对0.45 m过滤器的观察qBowman et al., J. Pharm. Sci., 56: 222 (1967)q0.45 m 过滤器截留数量 104-106 cfu/cm2q检查过大的孔q“除菌级”的定义聚集n单分散性的细胞最适用于挑战n用光学显微镜甄选菌株n使用超声波/振动使其散开n通过光学显微镜和存活计数予以确定n使用 0.45 m过滤器作为过滤器挑战测试中的阳性对照措施。测试微生物的活性n确认挑战液体中微生物的活性q药物产品或替代物q微生物必须在整个挑战测试的过程中是存活的 q如果损失了10倍的微生物，可能就不适合采用直接接种法来进行挑战测试。n挑战前后确定活性n使用可接受的微生物学方法，如q标准平板计数，用于上游分析q方法必须经过验证 (暗示)n使用相同的培养基分析滤出液中细菌存在的情况。nSection 6.9/6.11抑菌/杀菌/非分散溶液n由于直接接种法是理想的n由于测试微生物活性的一些问题，一个成功的测试计划可能需要改变q挑战液体q挑战条件q或两者兼有n可能需要预处理过滤器n文件给出了定义毒性水平的指南2. 直接法可存活的可存活的微生物微生物?否否改变改变产品产品/过程过程预处理过滤器预处理过滤器B. Diminuta / 挑战微生物挑战微生物泵泵测试过滤器测试过滤器抗生素抗生素防腐剂防腐剂温度温度pH12药品药品化验滤出液化验滤出液中的微生物中的微生物产品或过程的改变:抑菌/杀菌溶液n概述q决策过程一般不能被很好地理解。q图2 给出了大概的指南n首选始终是直接接种法。n第二个选择是改变产品/过程。n预处理过滤器需要与改变产品/过程结合起来进行。n文件提供了关于定义毒性水平的指南 (毒性大于 1 log)n文件没有试图把改变产品或程序的方法区分优先次序q必须科学地使决策合理化。 Section 6.15压差和流量n应包括最大过程条件n达到或超过已知压差n达到或超过已知流量n也许不能在小范围内同时模拟两者。n使用者决定哪个与特定的过程更相关n建立支持决策的理由Section 6.17化验和结果解释n可以用0.45 或 0.22 m过滤器从滤出液中回收微生物。n所有的滤出液必须经过化验n要认为一个过滤器对于某个过程来说是灭菌级别:q测试过滤器不能允许任何微生物通过q所有的阳性和阴性对照措施必须是有效的。q为确定微生物穿过了过滤器而进行重复测试是允许的产品的生物负荷n产品的生物负荷必须经q辨认q确定特征 q确定数量n过滤器生物负荷(即挑战水平)的计算q过滤器生物负荷=BV/A，那么nB = 微生物计数 (cfu/mL)nV = 总体积 (ml)nA = 过滤器总表面积 (cm2)n过滤器生物负荷单位是cfu/cm2n允许使用者拿生产过滤器生物负荷与标准挑战测试生物负荷（107 cfu/cm2)相比较。nSection 6.22设备测试的原理：评估过滤器装置的完整性n要考虑到生产出来的装置可能没有截留作用q膜未封闭好q膜遭到了破坏q构件相交之处膜有缺陷n要考虑到不能依赖完整性测试检查出设备在生产过程中形成的缺陷。滤介体vs. 装置n选择膜盘还是装置取决于验证操作的目的n如果目的是验证膜的截留性能，那么使用膜盘进行缩小比例试验n完整性测试的方法必须有意义: 如: 建立泡点和扩散流之间的关系n膜的完整性在安放膜的时候得以建立，在装置测试中得以确认。扩大试验:滤介体vs. 装置n膜盘是适用于验证过程过滤装置某些特征的一种模型。n过滤装置必须经过验证才能应用于生产过程中。Section 6.1647 mm 盘盘滤筒膜膜盘测试的原因: 确保过滤装置完整性n过滤器最初的和过程中的完整性通过以下手段得以充分保证q证明过滤器与过程相匹配的充分研究q过滤器生产商质量系统审查q经验证的完整性测试n于过滤器使用前后恰当地执行压差和流量n应包括最大过程条件n达到或超过已知压差n达到或超过已知流量n也许不能在小范围内同时模拟两者。n使用者决定哪个与特定的过程更相关n建立支持决策的理由化验膜的选择n通常两者均可q0.45 m 或 0.22 mq用额定的分析过滤器回收测试微生物n一篇发表的论文支持使用0.45 m过滤器(J. Carter, PDA-JPST, Volume 50, No.3, 1996)n化验过滤器的选择应该经过验证产品生物负荷n验证设计必须考虑最初的生物负荷q辨认q确定特征 q确定数量n过滤器生物负荷的计算qB = BV/A 在这里nB = 微生物计数 (cfu/mL)nV = 总体积 (mL)nA = 过滤器总表面积 (cm2)n使用B. diminuta假定用过滤的方法去除自然生物负荷微生物更难。area生物负荷Brevundimonas diminuta 对比自然生物负荷试验n标准培养法 (ASTM)n小细胞n单分散性的细胞n历史上n需要培养方法u培养的效果?需要大小分析法u没有工业标准安全事宜生物负荷何时变化?B. diminuta将B. diminuta 与自然生物负荷微生物相比较?n培养方法的建立n微生物大小的确定q光学显微镜q扫描电子显微镜q同时测量生物负荷微生物和B. diminuta n过滤性研究q使用0.45 m 膜盘q同时测量生物负荷微生物和B. diminuta的截留情况自然生物负荷微生物n知道生物负荷情况q质量上q数量上n考虑对B. diminuta有杀菌/抑菌作用的产品。n所选的微生物必须能在实际测试产品中生存。n必须能繁殖到足以提供107cfu/cm2 过滤面积的水平。n能与产品或生产区域隔离。n继续在几乎所有截流测试中使用。自然生物负荷微生物n考虑对B. diminuta有杀菌/抑菌作用的产品。n所选的微生物必须能在实际测试产品中生存n微生物浓度应足以提供107cfu/cm2 过滤面积的挑战水平。n能与产品或生产区域隔离n在大多数情况下继续使用 B. diminuta 结尾意见 n过程条件和测试设计之间的关系是关键的n为你选择的挑战微生物建立合理依据是很重要的n微生物截流研究和产品放行之间有着直接的联系。n多次使用的验证对缩小比例设计构成挑战n如果可能的话，提前与监管机构在方法上取得一致意见。