乳腺癌乳腺癌HER2的标准化检测的标准化检测HER2，又名，又名HER2/neu，c-erbB-2，表皮生，表皮生长因子受体（因子受体（EGFR）家族成）家族成员；原癌基因，位于原癌基因，位于17q21，编码相相对分子量分子量185KD的跨膜糖蛋白（跨膜酪氨酸激的跨膜糖蛋白（跨膜酪氨酸激酶受体，受体，表皮生表皮生长因子因子样分子），在分子），在细胞表面表达；胞表面表达；通通过参与信号参与信号传道通路的一系列活道通路的一系列活动影响影响细胞的增殖与分化。胞的增殖与分化。HER2基因基因信号传导信号传导至细胞核至细胞核细胞核细胞核接合部接合部酪氨酸激酶酪氨酸激酶活性部分活性部分细胞浆细胞浆细胞膜细胞膜生长因子（配体）生长因子（配体）癌基因活化癌基因活化细胞分裂细胞分裂 HER2 受体跨膜二聚体的信号受体跨膜二聚体的信号传导途径途径1 = 1 = 基因拷贝数基因拷贝数2 = 2 = mRNA 转录转录3 = 3 = 细胞表面受体蛋白表达细胞表面受体蛋白表达4 = 4 = 细胞外受体功能域释放细胞外受体功能域释放A = HER2 DNAB = HER2 mRNAC = HER2 receptor protein正常正常扩增扩增/ /过度表达过度表达细胞核细胞核细胞质细胞质细胞膜细胞膜1234CBAHER2过度表达：正常状度表达：正常状态的的10-100倍倍 HER2癌基因的致瘤机制：癌基因的致瘤机制： 抑制凋亡，促抑制凋亡，促进增殖；增加增殖；增加肿瘤瘤细胞的侵胞的侵袭 力；促力；促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。瘤血管新生和淋巴管新生。研究表明：研究表明： 30以上的人以上的人类肿瘤中存在瘤中存在HER2基因的基因的扩增增/ / 过度表达（如乳腺癌、卵巢癌、子度表达（如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜内膜 癌、癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等卵管癌、胃癌和前列腺癌等; ; 2030的原的原发性浸性浸润性乳腺癌有性乳腺癌有HER2基基因的因的扩增增/ /过度表达度表达。HER2阳性阳性患者患者的生存期比阴性者的生存期比阴性者缩短一半以上短一半以上转移性乳腺癌患者的中位生存期转移性乳腺癌患者的中位生存期HER2 阳性阳性8-10个月个月HER2 阴性阴性17-22个月个月Slamon DJ et al. Science 1987;235:177822004年年发现淋巴淋巴结阴性患者阴性患者预后与后与HER2状状态密切相关密切相关p=0.0001Cumulative disease recurrence curvesSun JM. Cancer 2004;101:2516220.30.20.10020406080100月月HER2阳性患者平均风险曲线阳性患者平均风险曲线HER2 阴性患者平均风险曲线阴性患者平均风险曲线基础风险曲线基础风险曲线HER2 HER2 表达在原发肿瘤和转移灶呈高度一致表达在原发肿瘤和转移灶呈高度一致*Mainly distant metastases. *Liver and lung metastases. Lymph node metastases were analysed in all cases, except in the studies by Vincent-Salomon et al (2002) and Gancberg et al (2002), where distant metastases were analysed.StudyMasood & Bui (2000)Shimizu et al (2000)Simon et al (2001)Tanner et al (2001)Gancberg et al (2002)Vincent-Salomon et al (2002)Tsutsui et al (2002)Carlsson et al (2004)Primary tumours32%38%25%28%29%25%25%55%Metastases32%38%22%28%27%*20%*25%55%Percentage IHC overexpression 2005年年St. Gallen国际治疗指南国际治疗指南乳腺癌危险度分级乳腺癌危险度分级低度低度中度中度高度高度淋巴淋巴结1+(13)2+(13)1+( 3)2pT（cm）2伴伴21病理分病理分级1或或 2 31瘤周脉管瘤周脉管或或 +1HER2或或 +1 2+1年年龄35或或3512005 St Gallen 指南指南乳腺癌初乳腺癌初诊时需明确需明确HER2 HER2阳性阳性即做即做为高高风险因子加以考因子加以考虑Goldhirsch et al 2005CMF, cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil预后后评估估预后差后差疗效效预测从赫从赫赛汀汀的治的治疗中最大中最大获益益芳香化芳香化酶抑制抑制剂的的疗效效优于三苯氧胺于三苯氧胺蒽蒽环类和紫杉和紫杉类的的疗效效优于于CMF随着随着肿瘤的靶向性治瘤的靶向性治疗的的发展，以展，以单抗抗为主的分子靶点主的分子靶点药物的不断研制物的不断研制应用，用，已成已成为肿瘤靶向治瘤靶向治疗的新武器的新武器 Herceptin即即为一种一种针对HER2受体的高受体的高纯度重度重组DNA衍生物的人源化衍生物的人源化单克隆抗克隆抗体，是乳腺癌治体，是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶域的第一个分子靶向性向性药物物刺激刺激刺激刺激刺激刺激刺激刺激刺激刺激刺激刺激HER2細胞細胞増殖増殖増殖増殖増殖増殖刺激刺激刺激刺激刺激刺激 刺激刺激刺激刺激刺激刺激HER2癌癌细细胞胞増殖抑制増殖抑制HeceptinHeceptinHeceptin的作用的作用的作用的作用的作用的作用HeceptinHeceptin：一种针对一种针对Her-2/neu受体的高纯度重组受体的高纯度重组DNA衍生物的人源化衍生物的人源化单克隆抗体，是乳腺癌治疗领域的第一单克隆抗体，是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶向性药物，具有高效、低毒、个分子靶向性药物，具有高效、低毒、选择性强的特点选择性强的特点 癌癌细细胞表面存在着胞表面存在着CerbB-2蛋白，蛋白， 受刺激后促受刺激后促进进癌癌细细胞的增殖胞的增殖 2030的癌细胞的癌细胞Her-2/neu基因的蛋白基因的蛋白CerbB-2 与与CerbB-2结结合阻断和抑制合阻断和抑制细细胞的增殖胞的增殖 转转移性乳腺癌病人的治移性乳腺癌病人的治疗疗效果效果 检测检测癌癌细细胞表面胞表面cerbB-2存在程度决定使用存在程度决定使用意义意义 靶向靶向药物物Heceptin仅对HER2扩增的乳腺癌有效增的乳腺癌有效 准确的准确的检测HER2有无有无扩增是增是临床床应用用Heceptin的的绝 对必要条件必要条件，也是成功，也是成功进行靶向治行靶向治疗的的前前题和关和关键 HER-2扩增的乳腺癌往往提示其增的乳腺癌往往提示其恶性程度高，性程度高，进展迅展迅 速，化速，化疗缓解期短，解期短，对CMF方案化方案化疗反反应降低降低 乳乳 腺癌化腺癌化疗药物物环磷磷酰胺、阿胺、阿酶素、素、5 5氟尿氟尿嘧啶等等 的主要参考指的主要参考指标 HER-2扩增的乳腺癌增的乳腺癌对蒽蒽环类药物和紫杉醇物和紫杉醇类药物化物化 疗敏感性高敏感性高 HER2和拓扑异构和拓扑异构酶II-a基因同基因同时扩 增的乳腺癌患者，可以从蒽增的乳腺癌患者，可以从蒽环类药物物为基基础的方案的方案 中受益，故同中受益，故同时检测HER2和拓扑异构和拓扑异构酶II-a可以可以筛 选出以蒽出以蒽环类化化疗药为基基础的化的化疗方案候方案候选患者患者 HER-2扩增的乳腺癌增的乳腺癌对三苯氧胺易三苯氧胺易产生耐生耐药性性 制制 定内分泌治定内分泌治疗方案的有力依据方案的有力依据 HER-2扩增的乳腺癌无病生存率和增的乳腺癌无病生存率和总生存率低，并且生存率低，并且 与淋巴与淋巴结阳性、癌的高阳性、癌的高级别、阴性受体状、阴性受体状态及高增及高增 殖活性有关殖活性有关 预后判断的参考指后判断的参考指标意义意义ST. GALLEN 2007 HER2HER2：乳腺癌危乳腺癌危险因素的新定因素的新定义低低中中高高G1G1T2T2ER/PR +ER/PR +年龄年龄352G2-3 T2淋巴结淋巴结 1-3 1-3 和和 HER2 +, HER2 +, ER/PR -ER/PR -或或淋巴结淋巴结 4 4淋巴结淋巴结-, -, HER2 +, HER2 +, ER/PR ER/PR - -或或 LVI LVI 侵润侵润 淋巴结淋巴结1-31-3且且 HER2 -,HER2 -, ER/PR +ER/PR +淋巴结淋巴结- -HER2 HER2 - - LVILVI无无RISKRISK2007 NCCN 治疗指南治疗指南HER2检测的原则检测的原则ASCO/CAP: HER2检测指南检测指南HER2阳性阳性： IHC HER2 3+ (完整的，强的膜阳性完整的，强的膜阳性 30% 30%) 或或 FISH HER2 基因扩增基因扩增 (HER2/ CEP17 2.2 2.2 或或 HER2 基因拷贝数基因拷贝数 6 6 信号信号/核，无内对核，无内对照的探针照的探针)HER2阴性：阴性： IHC HER2 0-1+ 或或 FISH HER2 基基因扩增因扩增 (HER2/ CEP17 1.8 或或 HER2基因拷贝基因拷贝数数 4 4 信号信号/核，无内对照的探针核，无内对照的探针) )不能确定：不能确定：不能确定：不能确定：IHC HER2 2+ 或或 FISH HER2 基因扩基因扩增增 (HER2/ CEP17 1.8-2.2 或或 HER2基因拷贝数基因拷贝数 4-6 4-6 信号信号/核，无内对照的探针核，无内对照的探针) )HER2测定流程定流程图HER2的的检测方法方法免疫免疫组织化学（化学（IHC）：）：HER2蛋白的表达蛋白的表达荧光原位光原位杂交（交（FISH）：）：HER2基因的基因的扩增增显色原位色原位杂交（交（CISH）：）：HER2基因的基因的扩增增酶联免疫分析（免疫分析（EIA）酶联免疫吸附分析（免疫吸附分析（ELISA）聚合聚合酶链反反应（PCR）HER2阳性定义阳性定义IHC 3+IHC 3+CISH +CISH +FISH +FISH +或或或或蛋白过度表达蛋白过度表达基因扩增基因扩增=一抗一抗结合于合于Her-2受体受体二抗结合并激活底物反应显色二抗结合并激活底物反应显色免疫免疫组织化学法原理化学法原理Immunohistochemistry (IHC)IHC检测HER2表达初表达初筛最常使用的方法。最常使用的方法。判断判断HER2蛋白蛋白过表达表达最重要的是染色方法最重要的是染色方法的的标准化和准化和结果的判断。果的判断。建建议使用美国食品和使用美国食品和药品管理局品管理局(FDA)批准批准的的试剂盒。盒。应使用使用EnVision法和高法和高质量的量的DAB显色液色液以避免内源性生物素的影响。以避免内源性生物素的影响。应有有严格的、包括内部和外部的格的、包括内部和外部的质量控制，量控制，须设阳性阳性对照、阴性照、阴性对照和空白照和空白对照。照。IHC结果判断结果判断先在先在10物物镜下下进行判行判读注意注意细胞膜完全着色的癌胞膜完全着色的癌细胞比例及着色胞比例及着色强度度胞胞质着色着色应忽略不忽略不计导管内癌管内癌(DCIS)的着色的着色应忽略不忽略不计，只只评定浸定浸润癌的着色情况癌的着色情况正常乳腺上皮不正常乳腺上皮不应着色着色应使用使用美国美国FDA批准的批准的HercepTest评分系分系统ASCO/CAP ：C-erbB2 IHC的评分的评分0 (阴性阴性): 无染色无染色, 或或 10%的细胞膜微弱的的细胞膜微弱的 或不完或不完整的膜染色整的膜染色2+ (弱阳性弱阳性): 10% 细胞弱到中等膜染色细胞弱到中等膜染色3+ (强阳性强阳性): 10%中等到强的完整的膜中等到强的完整的膜染色染色 30%01+2+3+C-erbB22008/12/12HER-2 检测检测: IHC抗原修复抗原修复抗原修复抗原修复有有有有 / / 无无无无组织固定组织固定方法方法抗体选择抗体选择抗体选择抗体选择评分标准评分标准评分标准评分标准变异性变异性变异性变异性福福尔马林固定林固定/ /石蜡包埋石蜡包埋组织 HER 基因扩增基因扩增25倍倍 （Southern Hybridization）Slamon et al, Science 244:712, 1989HER2 “阴性阴性” 是由于组织固定后抗原被遮蔽是由于组织固定后抗原被遮蔽需要行抗原修复来纠正需要行抗原修复来纠正Courtesy Michael PressFISH是一种分子是一种分子细胞胞遗传学技学技术，通，通过荧光光标记的的DNA探探针与与细胞核内的胞核内的DNA靶序列靶序列杂交。在交。在荧光光显微微镜下，于下，于细胞和胞和( (或或) )组织原位原位观察并分析察并分析细胞核内胞核内杂交于交于DNA靶序靶序列的多种彩色探列的多种彩色探针信号，以信号，以获得得细胞内多胞内多条染色体条染色体( (或染色体片段或染色体片段) )或多种基因状或多种基因状态的信息。的信息。“金金标准准”HER2 geneHER2 geneHER2 gene双链靶基因双链靶基因变性的性的单链DNA与与荧光光标记探探针复复性性 产生生荧光信号光信号荧光原位光原位杂交法原理交法原理 Fluorescence in situ Hybridisation (FISH)HER2探针探针绝大部分是同大部分是同时含有含有HER2基因基因( (标记为橘橘红色色荧光光) )和和该基因所在的基因所在的17号染色体着号染色体着丝粒粒( (标记为绿色色荧光光) )序列的混合探序列的混合探针经美国美国FDA批准的批准的进口探口探针 VS 国国产探探针评价价17号染色体数目和意号染色体数目和意义HER2基因位于基因位于17号染色体上，大号染色体上，大约有有47%的乳腺癌存的乳腺癌存在在17号染色体非整体性号染色体非整体性，即即17号染色体不是正常的二号染色体不是正常的二体，而是体，而是单体或多体。体或多体。绿色探色探针可以将可以将17号染色体的非整体性和号染色体的非整体性和单纯的的HER2基因基因扩增，尤其是低水平的增，尤其是低水平的扩增区分开。增区分开。当当HER2基因与基因与17号染色体数目比号染色体数目比值大于大于2 2时，即，即为HER2基因基因扩增。增。加入了加入了这个内个内对照，就排除了照，就排除了单色探色探针( (探探针中中仅有有HER2基因基因) )可能造成的假阴性可能造成的假阴性(17号染色体号染色体单体体) )或假或假阳性阳性(17号染色体多体号染色体多体) )。临床研究床研究显示，示，具有具有这类遗传学特征的患者学特征的患者对治治疗的反的反应和和预后与后与单纯的基因的基因扩增明增明显不同。不同。质量控制质量控制内内对照：照：杂交的交的组织、细胞中有胞中有75%的的细胞核胞核显示出双色信号示出双色信号时，视为实验成功，成功，并且并且红、绿信号互信号互为对照，癌与非癌照，癌与非癌细胞胞互互为对照。照。外外对照：照：应选择FISH阳性和阴性的阳性和阴性的标本片。本片。结果判读结果判读杂交信号交信号计数数应选择细胞核大小一致、核的胞核大小一致、核的边界完整、二界完整、二脒基苯基基苯基吲哚(DAPI)染色均一、染色均一、细胞核孤立无重叠、胞核孤立无重叠、绿色着色着丝粒信号清晰的粒信号清晰的细胞。胞。随机随机计数数2030个癌个癌细胞核中的双色信号。胞核中的双色信号。判判读标准准红色信号的色信号的总数与数与绿色信号的色信号的总数比数比值2.2时，即，即为HER2基因基因扩增增若若红、绿两信号的两信号的比比值20或众多信号或众多信号连接成簇接成簇时可不可不计算，即算，即视为基因基因扩增；增；若比若比值介于介于1.82.2之之间，则需要再需要再计数数20个个细胞核中的信号胞核中的信号或或由另外一个分析者重新由另外一个分析者重新计数。如仍数。如仍为临界界值，则应在在FISH检测报告中注明。告中注明。若若HER2基因基因扩增在不同癌增在不同癌细胞中胞中存在异存在异质性性时，应在另一癌区在另一癌区域再域再计算算2030个癌个癌细胞核中的胞核中的红、绿信号信号值，报告其最大告其最大值，并加以注并加以注释。注意避免注意避免G2期期细胞内的基因拷胞内的基因拷贝数目特征数目特征(4个拷个拷贝) )可能可能导致的致的计数数误差。差。HER2 probeCEP 17 probeHER2 / CEP17 ratio = 1HER2 / CEP17 ratio = 1HER2 / CEP17 ratio = 7No amplificationNo amplification; tetraploidyHER2 gene amplification (ratio 2.2)HER2 FISH PatternsFISHAmplifiedFISHNot amplifiedAneusomyNot amplifiedCourtesy Ken BloomFISH: PathVysionTM无无扩增增扩增增比比值 2.2提示提示Her-2有有扩增增比值比值 2.2提示提示Her-2有扩增有扩增比比值介于介于1.82.2临界界值Aneusomy, Not amplifiedIHC vs FISH C-erbB2 scoreGene amplification by FISH04%17%210-35%390%转移性乳腺癌中：移性乳腺癌中：HER2 检测 IHC 3+ or FISH +赫赫赛汀汀的治的治疗效果相当效果相当Vogel C, et al. J Clin Oncol 2002;20:71926263534384848Response rateClinical benefit rateThank You!谢谢谢谢!