免疫组织化学技术免疫组织化学技术 http:/http:/1 1免疫组织化学免疫组织化学技术n n基本原理基本原理 通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原形成抗原形成抗原形成抗原 抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。2 2n n组织与细胞材料的制备组织与细胞材料的制备n n免疫组织化学方法免疫组织化学方法3 3组织与细胞材料的制备组织与细胞材料的制备n n组织石蜡切片制作n n组织冰冻切片制作n n细胞爬片制作n n细胞涂片制作4 4切片的制作切片的制作n n组织的固定组织的固定n n组织石蜡包埋组织石蜡包埋n n切片切片5 5n n目的目的目的目的: : : : （1 1 1 1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。的固有形态。的固有形态。的固有形态。 （2 2 2 2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的 死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 （3 3 3 3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造 成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 （4 4 4 4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制 片。片。片。片。 （5 5 5 5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 （6 6 6 6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。于辨认。于辨认。于辨认。组织材料的固定组织材料的固定6 6n n固定液的选择：固定液的选择：(1)(1)(1)(1)甲醛固定液：甲醛固定液：甲醛固定液：甲醛固定液：10101010福尔马林，福尔马林，福尔马林，福尔马林，10101010中性福尔马林，中性福尔马林，中性福尔马林，中性福尔马林，10101010中中中中 性缓冲福尔马林性缓冲福尔马林性缓冲福尔马林性缓冲福尔马林(2)4(2)4(2)4(2)4多聚甲醛固定液多聚甲醛固定液多聚甲醛固定液多聚甲醛固定液(3)Bouin S(3)Bouin S(3)Bouin S(3)Bouin S液及改良液及改良液及改良液及改良Bouin SBouin SBouin SBouin S液液液液(4)Zenker S(4)Zenker S(4)Zenker S(4)Zenker S液液液液(5)Zamboni S(5)Zamboni S(5)Zamboni S(5)Zamboni S液液液液 (6)PLP(6)PLP(6)PLP(6)PLP固定液：过碘酸固定液：过碘酸固定液：过碘酸固定液：过碘酸- - - -赖氨酸赖氨酸赖氨酸赖氨酸- - - -多聚甲醛固定液。该固定剂多聚甲醛固定液。该固定剂多聚甲醛固定液。该固定剂多聚甲醛固定液。该固定剂 较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保 存较好。存较好。存较好。存较好。(7)PLPD(7)PLPD(7)PLPD(7)PLPD固定液固定液固定液固定液 取取取取PLPPLPPLPPLP固定液固定液固定液固定液25ml25ml25ml25ml，加入，加入，加入，加入2.5%2.5%2.5%2.5%重铬酸重铬酸重铬酸重铬酸25ml25ml25ml25ml。(8)Kanovsky S(8)Kanovsky S(8)Kanovsky S(8)Kanovsky S液液液液(9)Methacarn(9)Methacarn(9)Methacarn(9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。固定液，对核内抗原的保存效果较好。固定液，对核内抗原的保存效果较好。固定液，对核内抗原的保存效果较好。(10)PEG(10)PEG(10)PEG(10)PEG液液液液(11)0.4%(11)0.4%(11)0.4%(11)0.4%对苯醌对苯醌对苯醌对苯醌(12)(12)(12)(12)碳二亚酰胺碳二亚酰胺碳二亚酰胺碳二亚酰胺- - - -戊二醛（戊二醛（戊二醛（戊二醛（ECG-GECG-GECG-GECG-G）液）液）液）液(13)(13)(13)(13)丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂7 7n n固定时间：固定时间： 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。液的穿透力及浓度与固定时间成反比。液的穿透力及浓度与固定时间成反比。液的穿透力及浓度与固定时间成反比。8 8n n大组织：大组织：75757575乙醇乙醇乙醇乙醇30303030120min120min120min120min，85858585乙醇乙醇乙醇乙醇30303030120min120min120min120min，95959595醇醇醇醇 2h 2h 2h 2h，95959595乙醇乙醇乙醇乙醇 2h 2h 2h 2h，95959595乙醇乙醇乙醇乙醇过夜，无水乙醇过夜，无水乙醇过夜，无水乙醇过夜，无水乙醇30 30 30 30 60min60min60min60min，无水乙醇，无水乙醇，无水乙醇，无水乙醇3030303060min60min60min60min，无水乙醇，无水乙醇，无水乙醇，无水乙醇60min60min60min60min120min120min120min120min，二甲苯，二甲苯，二甲苯，二甲苯、和和和和各各各各15min15min15min15min（可视观察结果而定），石蜡（可视观察结果而定），石蜡（可视观察结果而定），石蜡（可视观察结果而定），石蜡30min30min30min30min石蜡石蜡石蜡石蜡11112h2h2h2h，石蜡，石蜡，石蜡，石蜡22223h3h3h3h。n n小组织：小组织：75757575乙醇乙醇乙醇乙醇30min30min30min30min，85858585乙醇乙醇乙醇乙醇30min30min30min30min，95959595乙醇乙醇乙醇乙醇1h1h1h1h、1h1h1h1h、过夜或过夜或过夜或过夜或2h2h2h2h，无水乙醇，无水乙醇，无水乙醇，无水乙醇、和和和和各各各各30min30min30min30min，二甲苯，二甲苯，二甲苯，二甲苯15min15min15min15min、10min10min10min10min、10min10min10min10min（肉眼观察），石蜡（肉眼观察），石蜡（肉眼观察），石蜡（肉眼观察），石蜡30min30min30min30min，石蜡，石蜡，石蜡，石蜡30min30min30min30min，石蜡，石蜡，石蜡，石蜡11112h2h2h2h。组织石蜡包埋9 9切切 片片n n载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液泡市售载玻片需经清洁液泡市售载玻片需经清洁液泡市售载玻片需经清洁液泡24h24h24h24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240240240240烤烤烤烤2h2h2h2h。n n切片粘合剂的使用：（1 1 1 1）多聚赖氨酸（分子量）多聚赖氨酸（分子量）多聚赖氨酸（分子量）多聚赖氨酸（分子量300KD300KD300KD300KD）：）：）：）：0.5%0.5%0.5%0.5%浓度。浓度。浓度。浓度。（2 2 2 2）APESAPESAPESAPES试剂（试剂（试剂（试剂（3-3-3-3-氨基、丙基三氧基硅烷）氨基、丙基三氧基硅烷）氨基、丙基三氧基硅烷）氨基、丙基三氧基硅烷） 干净载玻片干净载玻片干净载玻片干净载玻片丙酮丙酮丙酮丙酮5min 5min 5min 5min 用镊子夹住浸入用镊子夹住浸入用镊子夹住浸入用镊子夹住浸入APESAPESAPESAPES试剂（试剂（试剂（试剂（1ml+50ml1ml+50ml1ml+50ml1ml+50ml丙酮）丙酮）丙酮）丙酮） 1 1 1 13 3 3 3次次次次纯丙酮洗二次纯丙酮洗二次纯丙酮洗二次纯丙酮洗二次干燥玻片干燥玻片干燥玻片干燥玻片用铝箔包好，室温用铝箔包好，室温用铝箔包好，室温用铝箔包好，室温或或或或4444保存备用。保存备用。保存备用。保存备用。 （3 3 3 3）铬矾明胶液：铬矾）铬矾明胶液：铬矾）铬矾明胶液：铬矾）铬矾明胶液：铬矾0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 明胶明胶明胶明胶5g H5g H5g H5g H2 2 2 2O O O O2 2 2 2 1000ml 1000ml 1000ml 1000ml （4 4 4 4）甲醛明胶液：）甲醛明胶液：）甲醛明胶液：）甲醛明胶液：40404040甲醛甲醛甲醛甲醛2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 明胶明胶明胶明胶0.5g H0.5g H0.5g H0.5g H2 2 2 2O O O O2 2 2 2 100ml 100ml 100ml 100ml1010n n切片：切片： 石蜡切片：石蜡切片：石蜡切片：石蜡切片： (1)(1)(1)(1)连续切片按序贴在玻片的下连续切片按序贴在玻片的下连续切片按序贴在玻片的下连续切片按序贴在玻片的下1/31/31/31/3。 (2)52(2)52(2)52(2)5260606060烤片烤片烤片烤片18h18h18h18h。 (3)(3)(3)(3)切片厚切片厚切片厚切片厚2 2 2 24 4 4 4m m m m。 (4)(4)(4)(4)切片刀要快切片刀要快切片刀要快切片刀要快 (5)(5)(5)(5)编上号编上号编上号编上号 (6)(6)(6)(6)切片可在切片可在切片可在切片可在4444保存数年保存数年保存数年保存数年 冰冻切片：冰冻切片：冰冻切片：冰冻切片： (1) (1) (1) (1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理 24h24h24h24h，冰冻切片。，冰冻切片。，冰冻切片。，冰冻切片。 (2) (2) (2) (2)冰冻切片后需凉干后立即固定冰冻切片后需凉干后立即固定冰冻切片后需凉干后立即固定冰冻切片后需凉干后立即固定 (3) (3) (3) (3)冰冻切片固定后冰冻切片固定后冰冻切片固定后冰冻切片固定后-80-80-80-80保存备用保存备用保存备用保存备用1111细胞爬片制作细胞爬片制作n n将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。瓶或六孔板内。n n待细胞生长达到待细胞生长达到6060以上后取出玻片。以上后取出玻片。n n用用4%4%的多聚甲醛固定的多聚甲醛固定2h2h以上。以上。n n可加甘油封存置于零下可加甘油封存置于零下2020度保存。度保存。1212细胞涂片制作细胞涂片制作n n离心将细胞收集出来，用预冷的离心将细胞收集出来，用预冷的PBSPBS洗洗2 23 3遍，最后用遍，最后用PBSPBS将细胞重悬。将细胞重悬。n n吸取吸取303050ul50ul（可根据细胞量调整）滴（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。n n待稍微风干以后加待稍微风干以后加4 4多聚甲醛溶液覆多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定盖细胞，固定2 24 4小时。小时。n n在细胞上加一层甘油放在细胞上加一层甘油放-20-20-20-20保存。保存。保存。保存。1313免疫组织化学方法免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学酶联免疫组织化学1414荧光标记免疫组织化学荧光标记免疫组织化学 直接法直接法 间接法间接法1515酶联免疫组织化学酶联免疫组织化学 ABC法法 S - P法法1616免疫组化二步法免疫组化二步法 1717二步法二步法免疫免疫组化染色步骤组化染色步骤n n二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯n nPBSPBSPBSPBS冲洗冲洗冲洗冲洗3 3 3 3次，每次次，每次次，每次次，每次3 3 3 3分钟分钟分钟分钟n n根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复 n n0.3%0.3%0.3%0.3%过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断20202020分钟，以消除内源性过氧分钟，以消除内源性过氧分钟，以消除内源性过氧分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性化物酶的活性化物酶的活性化物酶的活性n nPBSPBSPBSPBS冲洗、浸泡冲洗、浸泡冲洗、浸泡冲洗、浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次n n正常山羊血清室温封闭正常山羊血清室温封闭正常山羊血清室温封闭正常山羊血清室温封闭10101010分钟分钟分钟分钟1818n n甩去血清，加入适当稀释的一抗，甩去血清，加入适当稀释的一抗，甩去血清，加入适当稀释的一抗，甩去血清，加入适当稀释的一抗，37373737孵育孵育孵育孵育60606060分钟或分钟或分钟或分钟或4444过夜过夜过夜过夜n nPBSPBSPBSPBS冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次n n滴加多聚螯合物，滴加多聚螯合物，滴加多聚螯合物，滴加多聚螯合物，37373737孵育孵育孵育孵育30303030分钟分钟分钟分钟n nPBSPBSPBSPBS冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次n n新鲜配置酶底物显色液新鲜配置酶底物显色液新鲜配置酶底物显色液新鲜配置酶底物显色液DABDABDABDAB显色显色显色显色3 3 3 310101010分钟分钟分钟分钟n n流水冲洗流水冲洗流水冲洗流水冲洗n n苏木素复染，脱水，透明，封片。苏木素复染，脱水，透明，封片。苏木素复染，脱水，透明，封片。苏木素复染，脱水，透明，封片。n n显微镜观察拍照显微镜观察拍照显微镜观察拍照显微镜观察拍照n nIPPIPPIPPIPP软件分析光密度软件分析光密度软件分析光密度软件分析光密度1919抗原修复方法抗原修复方法n n真空负压抗原修复法：真空负压抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇真空负压处理甲醇真空负压处理甲醇真空负压处理甲醇真空负压处理5 5 5 5分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M0.01M0.01M0.01M柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（PH6.0PH6.0PH6.0PH6.0），真空负压），真空负压），真空负压），真空负压干燥箱预先调至干燥箱预先调至干燥箱预先调至干燥箱预先调至95959595，真空负压处理，真空负压处理，真空负压处理，真空负压处理10101010分钟。分钟。分钟。分钟。待修复注降至室温的一，待修复注降至室温的一，待修复注降至室温的一，待修复注降至室温的一，PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后按次，随后按次，随后按次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。选好的免疫组化染色方法进行染色。选好的免疫组化染色方法进行染色。选好的免疫组化染色方法进行染色。2020n n微波辐射抗原修复法：微波辐射抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理甲醇处理甲醇处理甲醇处理10101010分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M0.01M0.01M0.01M柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（PH6.0PH6.0PH6.0PH6.0），于微波炉内），于微波炉内），于微波炉内），于微波炉内微波辐射微波辐射微波辐射微波辐射10101010分钟，如检测分钟，如检测分钟，如检测分钟，如检测ErErErEr和和和和PrPrPrPr则需要则需要则需要则需要20202020辐射分辐射分辐射分辐射分钟左右。钟左右。钟左右。钟左右。待修复液降至室温后，待修复液降至室温后，待修复液降至室温后，待修复液降至室温后，PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后按选好次，随后按选好次，随后按选好次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。的免疫组织化学的染色方法进行染色。的免疫组织化学的染色方法进行染色。的免疫组织化学的染色方法进行染色。2121n n高压抗原修复法：高压抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10101010分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1 1 1 14 4 4 4分分分分钟。钟。钟。钟。待修复液恢复至室温后，待修复液恢复至室温后，待修复液恢复至室温后，待修复液恢复至室温后，PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后按选次，随后按选次，随后按选次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。好的免疫组织化学染色方法进行染色。好的免疫组织化学染色方法进行染色。好的免疫组织化学染色方法进行染色。2222n n隔水热抗原修复法：隔水热抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10101010分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入切片放入切片放入切片放入0.01M0.01M0.01M0.01M柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（PH0.6PH0.6PH0.6PH0.6）中，）中，）中，）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（温度后（温度后（温度后（92929292）。即开始计时，持续）。即开始计时，持续）。即开始计时，持续）。即开始计时，持续40404040分钟。分钟。分钟。分钟。待抗原修复液恢复至室温后，待抗原修复液恢复至室温后，待抗原修复液恢复至室温后，待抗原修复液恢复至室温后，PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后次，随后次，随后次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。按选定好的免疫组化染色方法进行染色。按选定好的免疫组化染色方法进行染色。按选定好的免疫组化染色方法进行染色。2323n n电炉加热抗原修复法：电炉加热抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10101010分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达用温度计测量温度，当达用温度计测量温度，当达用温度计测量温度，当达92929292后，即可拔离电源，后，即可拔离电源，后，即可拔离电源，后，即可拔离电源，当温度低于当温度低于当温度低于当温度低于92929292时，再插上电源，如此反复持续时，再插上电源，如此反复持续时，再插上电源，如此反复持续时，再插上电源，如此反复持续至至至至10101010分钟左右。分钟左右。分钟左右。分钟左右。待抗原修复液降至室温后，待抗原修复液降至室温后，待抗原修复液降至室温后，待抗原修复液降至室温后，PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后按次，随后按次，随后按次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。选定的免疫组化染色方法进行染色。选定的免疫组化染色方法进行染色。选定的免疫组化染色方法进行染色。2424n n胃蛋白酶消化法：胃蛋白酶消化法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10101010分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，次，次，次，1 1 1 1分钟分钟分钟分钟/ / / /次。次。次。次。滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20202020分钟左右。分钟左右。分钟左右。分钟左右。PBSPBSPBSPBS冲洗冲洗冲洗冲洗3 3 3 3次，次，次，次，2 2 2 2分钟分钟分钟分钟/ / / /次。次。次。次。后按选择好的免疫组化该法进行染色。后按选择好的免疫组化该法进行染色。后按选择好的免疫组化该法进行染色。后按选择好的免疫组化该法进行染色。2525n n胰蛋白酶消化法：胰蛋白酶消化法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10101010分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，次，次，次，1 1 1 1分钟分钟分钟分钟/ / / /次。次。次。次。滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20202020分钟左右。分钟左右。分钟左右。分钟左右。PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，次，次，次，2 2 2 2分钟分钟分钟分钟/ / / /次。次。次。次。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。2626注意事项一、抗体的保存一、抗体的保存 浓缩抗体：有效期内，只需放在浓缩抗体：有效期内，只需放在浓缩抗体：有效期内，只需放在浓缩抗体：有效期内，只需放在 4 4 4 4 冰箱内，保存时间可达冰箱内，保存时间可达冰箱内，保存时间可达冰箱内，保存时间可达1-31-31-31-3年。年。年。年。 即用型抗体：理论上在即用型抗体：理论上在即用型抗体：理论上在即用型抗体：理论上在4 4 4 4 冰箱内冰箱内冰箱内冰箱内 可保存半年左右。可保存半年左右。可保存半年左右。可保存半年左右。 PBSPBSPBSPBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般或抗体稀释液稀释的抗体：一般或抗体稀释液稀释的抗体：一般或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置只可放置只可放置只可放置1-1-1-1-2 2 2 2个月。个月。个月。个月。2727二、出现假阳性的原因二、出现假阳性的原因 组织切片质量不佳，造成假象，如组织切片质量不佳，造成假象，如 刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作 为判断阳性的依据。为判断阳性的依据。 出血和坏死：红细胞的内源性过氧出血和坏死：红细胞的内源性过氧 化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化 物酶均可出现假阳性反应。物酶均可出现假阳性反应。 抗体的交叉反应。抗体的交叉反应。2828三、出现假阴性的原因三、出现假阴性的原因 固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。无法补救。无法补救。无法补救。 固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%10%10%10%中性福尔马林。中性福尔马林。中性福尔马林。中性福尔马林。 抗体浓度过低。抗体浓度过低。抗体浓度过低。抗体浓度过低。 孵育时间太短，或孵育温度太低。孵育时间太短，或孵育温度太低。孵育时间太短，或孵育温度太低。孵育时间太短，或孵育温度太低。 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液pHpHpHpH值不正确。值不正确。值不正确。值不正确。29293030四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。五、五、DABDAB有致癌性，用后不应随处倒弃。有致癌性，用后不应随处倒弃。3131http:/3232