MicroRNA定量检测-技术讲座南宁科迪生物技术有限公司12 August 2024 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA2主要内容microRNA基础知识介绍12microRNA数据库及其应用3microRNA定量检测4microRNA功能验证 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA31.MicroRNA的特征及功能2.MicroRNA的作用原理及解决方案MicroRNA基础知识1MicroRNA基础知识介绍 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA4MicroRNA的发现Lin-14Lin-41. C. elegansLee R C，Feinbaum R L，Ambros VThe Celegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 Cell1993，75：843-8542. C. elegans：let-7Reinhart B J，Slack F J，Basson M ，et alThe 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegansNature. 2000，403：901-906 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA5MicroRNA的特征 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA6MicroRNA的特征 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA7MicroRNA的功能发育 Timing (Lee et al. 1993) Cell proliferation (Brennecke et al. 2003) Stem cell & neuron (Krichevsky et al. 2003; Hatfield et al., 2005)细胞凋亡(Baehrecke, 2003)疾病 肿瘤(Lu et al. 2005) 原癌miRNA(He et al. 2005) 脑肿瘤(Ciafre et al. 2005; Chan et al. 2005) 白血病(Calin et al. 2002; 2004) 糖尿病(Poy et al. 2004) 胆固醇的生物合成(Krutzfeldt et al. 2005)DNA 甲基化与染色质修饰(Bao et al. 2004) 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA8MicroRNA的作用原理 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA9MicroRNA的作用原理 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA10microRNA研究解决方案-发现新MiRNA发现新的新的microRNA 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA11microRNA研究解决方案-MiRNA的检测目前有很多与癌症临床诊断相关的研究在进行中。定量PCR的方法由于其灵敏度高，需要样品量少，而被广泛应用。MicroRNA的检测方法 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA12microRNA研究解决方案-MiRNA的检测 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA13MicroRNA数据库及其应用2MicroRNA数据库及其应用1.microRNA数据库2. microRNA数据查询与使用3.microRNA靶基因的预测与验证 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA14microRNA靶标数据库数据库名字数据库描述数据库类型网页链接targetScantargetScan 搜寻动物的microRNA靶基因。database,webserverstarBasestarBase 从高通量的CLIP-Seq实验数据（CLIP-Seq和HITS-CLIP）和降解组实验数据中（degradome sequencing）搜寻micorRNA的靶标。提供了各式各样的可视化界面去探讨microRNA的靶标。databasePicTarPicTar 联合的microRNA靶标预测。database,webserver,predictionsPITAPITA基于靶位点的可接性（target-site accessibility）预测microRNA的靶标。webserver,predictionsRNA22RNA22基因序列特征预测microRNA的结合位点。webserver,predictionsmiRecords一个整合的microRNA靶标数据库。databaseTarBase一个全面收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。databasemiRTarBase 一个全面收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。database 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA15MicroRNA查询数据库数据库名称数据库描述数据库类型网页链接deepBasedeepBase 从新一代测序技术（深度测序技术，deep-sequencing）数据中注释和鉴定microRNA，piRNA，siRNA基因及长非编码RNA基因及其他们的表达模式。databasemiRBasemiRBase 数据库是查询和发布发表的microRNA基因。databasemicroRNA.orgmicroRNA.org 构建和查询microRNA的表达模式及microRNA的靶标。databasemiRGenmiRGen研究动物的microRNA基因组织和功能。databasemiRNAMapmiRNAMap: 动物microRNA基因的基因组的map和microRNA的靶基因。databasePMRD植物microRNA数据库database. 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA16MicroRNA靶标预测 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA17MicroRNA靶标预测 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA18MicroRNA靶标预测 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA19MicroRNA靶标预测 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA20MicroRNA查询方法-查找序列已知已知MiRNAMiRNA基因名称查询序列基因名称查询序列 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA21MicroRNA查询方法-查找序列 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA22MicroRNA查询方法-查找序列 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA23主要内容3MicroRNA定量检测反转录反应反转录反应定量实验解决方案加A尾及反转录一步完成引物提供应用SYBRGreen方法进行qPCR特异性引物库常见问题分析RealTimePCRRealTimePCR反应反应 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA24MiRNA研究解决方案-MiRNA的定量检测microRNA 的定量的定量检测-TaKaRa 方案方案 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA25加A尾与反转录一步完成microRNApolyA polymerase加A尾microRNAmicroRNAAAAAOligo dT PrimingAAAANV TTTTXXXXRTasemicroRNAAAAATTTTXXXXFR10pg-5ug总RNA 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA26加A尾与反转录一步完成稀释至100ul，取2ul做qPCR（可以检测任何基因）。含Primer 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA27RealtimePCR原理-染料法SYBRGreenI：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenISYBRGreenI 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA28SYBRGreenI法作用机理示意图Primer退退 火火 FFFFPol.FPrimerPol.延延 伸伸 FFFFFFPrimer热变性热变性 FFFF 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA29RealTimePCR反应仪器不同有差别已经含有 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA30结果举例灵敏度验证 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA31结果举例microRNA定量检测多种用途 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA32结果举例microRNA定量检测多种用途 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA33TaKaRamicroRNA定量引物库 Takara Human miRNA Specific qPCR Primer Sets Takara Code Product NameSanger Registry IDSanger Accession #Entrez Gene IDMature sequenceDHM0001 hsa-let-7a qPCR Primer Mix hsa-let-7a MIMAT0000062 406883UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUDHM0002 hsa-let-7b qPCR Primer Mix hsa-let-7b MIMAT0000063406884UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUDHM0003 hsa-let-7c qPCR Primer Mix hsa-let-7c MIMAT0000064406885UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUUDHM0004 hsa-let-7d qPCR Primer Mix hsa-let-7dMIMAT0000065406886AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUUDHM0005 hsa-let-7e qPCR Primer Mix hsa-let-7eMIMAT0000066406887UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUUDHM0006 hsa-let-7f qPCR Primer Mix hsa-let-7fMIMAT0000067406888UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUUDHM0007 hsa-let-7g qPCR Primer Mix hsa-let-7gMIMAT0000414406890UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUUDHM0008 hsa-let-7i qPCR Primer Mix hsa-let-7iMIMAT0000415406891UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUUDHM0009 hsa-miR-100 qPCR Primer Mix hsa-miR-100 MIMAT0000098406892AACCCGUAGAUCCGAACUUGUGDHM0010 hsa-miR-101 qPCR Primer Mix hsa-miR-101MIMAT0000099406893UACAGUACUGUGAUAACUGAADHM0011 hsa-miR-103a-3p qPCR Primer Mix hsa-miR-103a-3pMIMAT0000101406896AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGADHM0012 hsa-miR-103b qPCR Primer Mix hsa-miR-103bMIMAT0007402100302238UCAUAGCCCUGUACAAUGCUGCU 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA34常见问题-引物设计要求 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA35常见问题-引物设计原则 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA36常见问题-模板要求 可以是总可以是总RNARNA可以是MicroRNA要求去除gDNA10pg-1ug总RNARNA20ul20ul体系体系 加入模板加入模板RNARNA的总体积不要超的总体积不要超过总体系的过总体系的10%10%。当丰度低时，适当增加模板量最高添加量为5ug模板要求模板用量是多少？ 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA37常见问题-扩增不好可能的原因 常见问题-引用文献举例12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA38 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA39主要内容4MicroRNA功能验证1.MiRNA表达载体2.MiRNA诱导表达 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA40MiRNA研究解决方案-MiRNA功能验证MicroRNA MicroRNA 表达载体：表达载体： 克隆表达感兴趣的克隆表达感兴趣的MiRNAMiRNA，然后进行筛选等研究工作。，然后进行筛选等研究工作。 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA41MiRNA研究解决方案-MiRNA功能验证MicroRNA MicroRNA 表达载体：表达载体： 克隆表达感兴趣的克隆表达感兴趣的MiRNAMiRNA，然后进行筛选等研究工作。，然后进行筛选等研究工作。4112 August 2024 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA42MiRNA研究解决方案-MiRNA功能验证MiRNAMiRNA的诱导表达的诱导表达 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA43联系我们南宁科迪生物技术有限公司南宁科迪生物技术有限公司地 址：南宁市大学东路98号世贸西城F座1605室电 话： ，传 真：E-mail： TaKaRaTaKaRa总部总部Takara技术服务热线：8008909508 E-mail：Clontech技术服务热线：8008106261 E-mail： 12 August 2024南宁科迪技术讲座之MicroRNA44THANK YOU！ 茎环法茎环法-探针法探针法12 August 202445