内毒素凝胶法检查技术 1、凝胶法BET试验程序2、试验器具3、鲎试剂灵敏度复核4、干扰初筛试验5、干扰试验6、检查法7、实验相关知识及技巧2024/8/122Http:/www.zacb.com 孵育反应温度是鲎试验的重要条件参数之一现行法规对反应温度的要求较宽松(371)严格的实验条件是实验室水平的重要标志之一80年代发达国家已使用干式恒温仪取代水浴箱2000年版中国药典BET法开始接受干式恒温仪TAL-40型试管恒温仪的特点温控精确：370.2发热均匀：0.1可定时及提示：090分钟任意可设定时，到时蜂鸣提示试管免封口，无水蒸气或水滴影响体积小巧，使用方便2024/8/126Http:/www.zacb.com3、鲎试剂标示灵敏度的复核试验实验目的验证实验室的条件是否满足BET实验的要求验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET水等）是否满足BET实验的要求2024/8/127Http:/www.zacb.com 实验步骤开启恒温仪器预热C溶液(标准内毒素溶液)的制备鲎试剂的准备加样及恒温反应结果判断数据处理2024/8/128Http:/www.zacb.com操作步骤示意图稀释为2、0.5、0.25内毒素标准溶液(C溶液)0.1mlTAL0.1mlCSE(RSE)，平行4管NC：0.1mlTAL0.1mlBET水，平行2管单次管：原安瓿多次管：反应试管轻轻转动瓶壁摇匀每步稀释于旋涡混合器混合30秒旋涡混合器混合15min混匀混匀BET水复溶BET水复溶内毒素RSE或CSE鲎试剂TAL371，孵育60min2min混匀（水浴恒温需封口）翻转180度，观察凝胶状况2024/8/129Http:/www.zacb.com灵敏度复核试验举例试剂试剂名称厂家规格标示效价数量TAL 安度斯0.1ml/支0.25EU/ml18内毒素标准品(CSE) 安度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水 (W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml12024/8/1210Http:/www.zacb.com1）标准内毒素溶液C的制备0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s30s2.0ml100EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml2.0ml3.6ml2.0ml2.0ml0.125EU/ml30s2.0ml2.0ml0.06EU/ml30s2.0ml2.0ml混合5分钟2024/8/1211Http:/www.zacb.com2）鲎试剂的准备取0.1ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两支，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列：用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解阴性对照溶液D0.06EU/ml0.125EU/ml0.25EU/ml0.5EU/ml2024/8/1212Http:/www.zacb.com3）加样用精确移液器分别吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml的标准内毒素溶液C，加入复溶的鲎试剂中，每浓度平行4管，吸取0.1mlBET水（D溶液）加入另外两支鲎试剂内，作为阴性对照CSETAL0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.1ml0.25EU/ml0.1ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.1ml0.06EU/ml0.1ml0.1mlBET水0.1ml加样顺序一般从低浓度到高浓度2024/8/1213Http:/www.zacb.com4）恒温反应将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），放入371的恒温器中孵育602分钟（孵育过程中避免振动影响凝胶形成）若恒温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染2024/8/1214Http:/www.zacb.com5）结果判断将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为“”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为“-”。阳性阴性结果判断：反应管缓缓倒转180 阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱者阴性(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者试验符合要求的基本条件： NC管全部阴性 （）2管全部阳性 （） 0.25管全部阴性 （）2024/8/1215Http:/www.zacb.com6）数据处理举例c=lg-1（X/4） =lg-1(0.903)(0.602)(0.602)(0.602)/4=0.210EU/ml即本批号鲎试剂的复核灵敏度（c）为0.21EU/ml药典要求：当c在0.52（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度值。结论：本批TAL的灵敏度标示值符合规定。0.125平行管内毒素标准溶液浓度(EU/ml)NC反应终点浓度X（lg反应终点浓度）0.50.250.0610.1250.90320.250. 60230. 60240.250. 6020.252024/8/1216Http:/www.zacb.com4、干扰初筛试验目的及原理本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含2内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出对鲎试验无干扰的浓度本试验可减少干扰试验的盲目性2024/8/1217Http:/www.zacb.com试验步骤供试品限值的确定供试品最大有效稀释倍数的确定试剂的选择反应溶液的制备加样及反应结果判断2024/8/1218Http:/www.zacb.com干扰初筛试验举例1）供试品限值硫酸庆大霉素，100ml/瓶，20000U/ml；药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U2024/8/1219Http:/www.zacb.com2）最大有效稀释倍数的确定最大有效稀释倍数MVD=cL/使用=0.5EU/ml灵敏度的鲎试剂时，MVD0.5 =因此可计算出使用不同时所对应的MVD：0.5EU/ml20000U/ml 0.5EU/1000U灵敏度（EU/ml）0.50.250.1250.060.03对应的MVD（倍） 204080160320=20（倍）2024/8/1220Http:/www.zacb.com3）试剂为了方便试验，干扰初筛试验中一般选择灵敏度较低的鲎试剂作试验试剂名称厂家规格标示效价数量TAL 安度斯0.1ml/支0.25EU/ml24内毒素标准品（CSE） 安度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水（W） 安度斯50ml/瓶0.003EU/ml12024/8/1221Http:/www.zacb.com4）各反应溶液的制备溶液编号AD溶液内容 S20 S40 S80 S160 S320W平行管溶液编号BC溶液内容 S20E 2 S40E 2 S80E 2 S160E 2 S320E 2E 2平行管2024/8/1222Http:/www.zacb.com溶液C的制备E1000.4ml3.6ml WE100.4ml3.6ml WE10.5ml0.5ml WE0.5溶液C： E2溶液A的制备S原液0.4ml3.6ml WS101.4ml1.4ml WS201.4ml1.4ml WS401.4ml1.4ml WS801.4ml1.4ml WS1601ml1ml WS320溶液A备用液备用液2024/8/1223Http:/www.zacb.com溶液B的制备E1S100.5ml0.5mlS20 E0.5E1S200.5ml0.5mlS40 E0.5E1S800.5ml0.5mlS160 E0.5E1S1600.5ml0.5mlS320 E0.5E1S400.5ml0.5mlS80 E0.5溶液B： SE2注意事项：制备溶液C和B时，每一步的混合液需在旋涡混合器上混 合至少30秒。2024/8/1224Http:/www.zacb.com5）加样及反应开启20支鲎试剂，分别用移液器准确吸取0.1ml BET水将鲎试剂复溶取0.1ml相应溶液C、B、A加入鲎试剂反应管，每浓度平行2管另外取0.1ml BET水作为阴性对照溶液D加入鲎试剂反应管。2024/8/1225Http:/www.zacb.com6）结果判断当溶液A、D均为阴性；溶液C均为阳性时，试验有效溶液B系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度。本试验中的样品无干扰浓度为 S40 溶液编号AD溶液内容 S20 S40 S80 S160 S320W平行管溶液编号BC溶液内容 S20E 2 S40E 2 S80E 2 S160E 2 S320E 2E 2平行管-+-+-+2024/8/1226Http:/www.zacb.com5、干扰试验通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰。至少对3批样品进行干扰试验。2024/8/1227Http:/www.zacb.com试验步骤供试品限值的确定鲎试剂的选择最大有效稀释倍数的确定反应溶液的制备加样及反应结果判断2024/8/1228Http:/www.zacb.com1）供试品限值硫酸庆大霉素，20000U/ml；药典要求内毒素限值L=0.5EU/1000U2）试剂的选择根据干扰初筛试验的结果，供试品在40倍稀释（对应鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml）时无干扰一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作干扰试验。这里我们选择灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行干扰验证试验。试剂名称厂家规格标示效价数量TAL 安度斯0.1ml/支0.125EU/ml36内毒素标准品（CSE） 安度斯10ng/瓶10EU/ng（CoA）1BET（水） 安度斯50ml/瓶0.003EU/ml12024/8/1229Http:/www.zacb.com3）最大有效稀释倍数的计算MVD=cL/=80（倍）4）各反应溶液的制备溶液编号CD溶液内容E0.25E0.125E0.06E0.03W平行管溶液编号BA溶液内容S80E0.25S80E0.125S80E0.06S80E0.03S80平行管2024/8/1230Http:/www.zacb.com30s0.4ml0.12530s30s30s1000.4mlCSEBET水1.0ml100.50.251.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml3.6ml1.8ml30s1.03.6ml0.0630s1.8ml1.8ml30s1.8ml1.8ml0.03(EU/ml)溶液C的制备CSE(E4)、E2、E、E0.5、E0.25（即E0.5、E0.5、E0.125、E0.06、E0.03）稀释稀释溶液C混合5分钟2024/8/1231Http:/www.zacb.com溶液A的制备S原液0.3ml2.7ml WS101ml3ml WS400.6ml0.6ml WS80硫酸庆大霉素S0.3mlS102.7 ml1.0ml3.0 ml溶液A：S80BET水0.6ml0.6 mlS402024/8/1232Http:/www.zacb.com溶液B的制备E0.5S400.5ml0.5mlS80 E0.25E0.25S400.5ml0.5mlS80 E0.125E0.125S400.5ml0.5mlS80 E0.06E0.06S400.5ml0.5mlS80 E0.032024/8/1233Http:/www.zacb.com5）加样及反应开启36支鲎试剂，先分别用0.1mlBET水复溶,再分别加相应的溶液0.1ml（A、B、C和D）371反应602分钟0.25EU/ml(2)0.125EU/ml()0.06EU/ml()0.03EU/ml()BET水S80 E0.25(SE2)S80 E0.125(SE)S80 E0.06(SE)S80 E0.03(SE)S802024/8/1234Http:/www.zacb.com6）结果判断反应结果溶液编号C（Es系列）D溶液内容E0.25E0.125E0.06E0.03W平行管溶液编号B（Et系列）A溶液内容S80E0.25S80E0.125S80E0.06S80E0.03S80平行管+2024/8/1235Http:/www.zacb.com结果计算及判断药典规定：当溶液A和溶液D（阴性对照）的所有平行管都为阴性，且0.5 Es 2时，试验有效。当0.5EsEt2Es时，供试品在该浓度下无干扰。本试验：1）0.5=0.06，2=0.25Es=0.125，0.5Es2，有效!2）0.5Es=0.06，2Es=0.25Et=0.104，0.5EsEt2Es，无干扰！结论：使用灵敏度=0.125EU/ml的鲎试剂对样品(S)的80倍稀释液(S80)作BET，无干扰。ES=lg-14(lg0.125) 4=0.125EU/mlEt=lg-1=0.104EU/ml(lg0.06) +(lg0.125) 342024/8/1236Http:/www.zacb.com6、检查法1) 凝胶法限量试验反应项目设置项目名称供试品检查供试品阳性对照阳性对照阴性对照溶液编号ABCD溶液内容SSE2E2W平行管2024/8/1237Http:/www.zacb.com试剂根据干扰试验结果，供试品在80倍稀释，使用鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml条件下，对BET无干扰本试验选择TAL灵敏度为0.125EU/ml，供试品稀释80倍检查试剂名称厂家规格灵敏度或效价数量TAL安度斯0.1ml/支0.125EU/ml8CSE安度斯10ng/支10EU/ng1BET水(W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml1硫酸庆大霉素(S)100ml/支20000U/ml12024/8/1238Http:/www.zacb.com各反应溶液制备S原液0.3ml2.7ml WS100.6ml1.8ml WS400.6ml0.6ml WS80E1000.4ml3.6ml WE100.4ml3.6ml WE11.6ml1.6ml WE0.50.6ml0.6ml WE0.25E0.5S400.6ml0.6mlS80 E0.25溶液C溶液A溶液B2024/8/1239Http:/www.zacb.com加样及反应开启8支鲎试剂，分别加0.1mlBET水复溶；再分别加入相应的溶液，每浓度平行2管溶液D（W）溶液C（ E0.25 ）溶液A（ S80 ）溶液B（ S80 E0.25 ）各0.1mL各0.1mL各0.1mL各0.1mL2024/8/1240Http:/www.zacb.com结果判断当需要复检时，A溶液平行4管，若所有平行管均为阴性，则供试品合格；否则不合格。溶液编号ABCD溶液内容S80S80E0.25E0.25W试验有效合格不合格需复检复检合格复检不合格+ +2024/8/1241Http:/www.zacb.com2）凝胶法半定量试验编号内毒素浓度/加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水12482222B2/供试品溶液122C2/检查用水检查用水1248210.50.252222D无/检查用水注：A为不超过MVD并且通过干扰实验的供试品溶液，从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释成1倍，2倍，4倍，8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。B为2浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列D为阴性对照反应项目设置2024/8/1242Http:/www.zacb.com凝胶半定量试验举例试剂鲎试剂（TAL）0.06EU/ml内毒素（CSE）10ng/瓶；10EU/ngBET水(W)50ml/瓶供试品(生理盐水）L=0.5EU/ml凝胶半定量法一般选用灵敏度较高的鲎试剂2024/8/1243Http:/www.zacb.com各反应溶液的制备溶液C的制备将CSE稀释成E0.125,E0.06,E0.03,E0.015浓度溶液溶液A的制备将供试品(S1)稀释至2倍、4倍、8倍E0.1251.8ml1.8ml WE0.061.8ml1.8ml WE0.031.8ml1.8ml WE0.015S11.8ml1.8ml WS21.8ml1.8ml WS41.8ml1.8ml WS8E1.250.4ml3.6ml W2024/8/1244Http:/www.zacb.com加样及反应溶液B的制备E1.25S10.2ml1.8mlS1 E0.125近似稀释法溶液ABCDS1S2S4S8S1E0.125E0.125E0.06E0.03E0.015W平行管2024/8/1245Http:/www.zacb.com结果判断试验有效条件*溶液D：*溶液B：*溶液C：E0.125且E0.015（即0.5c2）ABCDS1S2S4S8S1E0.125E0.125E0.06E0.03E0.015W平行管2024/8/1246Http:/www.zacb.com结果计算所有平行管的反应终点浓度的几何平均值即为供试品的内毒素浓度(CE=Lg-1 （X/2）:供试品内毒素浓度(CE)=当溶液A所有平行管均为阴性时，供试品溶液的内毒素浓度小于乘以初始稀释倍数(本试验初始稀释倍数为1)；当溶液A所有平行管均为阳性时，供试品溶液内毒素浓度大于或等于乘以最大稀释倍数（本试验最大稀释倍数为8）。A反应终点倍数反应终点浓度（EU/ml)S1S2S4S8平行管220.06=0.125110.06=0.06lg-12lg0.125+lg0.06=0.08(EU/ml)2024/8/1247Http:/www.zacb.com7、实验相关知识及技巧关于pH值的要求CP2005年版BET要求“一般要求供试品的pH值在6.08.0范围”USP的BET法要求是供试品与鲎试剂1：1的混合液的pH值在6.08.0；推荐的做法：在验证试验时，测定供试品溶液与鲎试剂的混合液的pH值，如果满足要求（pH值在6.08.0），则在日常检查试验中无需调节pH值。如果不满足要求，那么需进行pH的调节，且日常检查试验时，也必须进行同样的调节。2024/8/1248Http:/www.zacb.com溶液B的制备方法如需制备S4E0.25（供试品4倍稀释液，其中含有0.25EU/ml的内毒素浓度）1）50/50法 该法不能制备S1E22）近似法E0.5S20.8ml0.8mlS4 E0.25E2.5S40.2ml1.8mlS4E0.252024/8/1249Http:/www.zacb.com3）一步法制备溶液C系列 如要制备E0.5，E0.25，E0.125及E0.06 ：0.8mlE0.50.8mlE0.25E0.125E0.060.8ml2.4ml0.4ml2.8ml2024/8/1250Http:/www.zacb.com